本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种提高烟草花果香香气糖苷前体的方法。
背景技术：
目前，业内常用的现有技术是这样的：在中国，烟草工业是财政收入的重要来源。烟叶的好坏直接决定卷烟的品质，而烟叶香气是烟叶的主要特色指标，是衡量烟叶质量和可用性的重要因素。烟草中的致香物质一般不是烟草碳、氮等物质的直接代谢产物，而是先合成酯类、萜类糖苷等非挥发性的大分子化合物，进一步在酶或者非酶作用下分解形成挥发性的有机化合物。香气糖苷作为挥发性香气物质的前体物质是一类不具挥发性，与糖类物质通过糖苷键结合后以糖苷态形式存在的一类香气前体，具有重要的生物和药理功能。在自然界中，糖苷化是植物次生代谢最为重要的修饰反应之一，糖苷物质是由udp-糖基转移酶催化完成，糖基转移酶可将糖基从活化的供体转移到小分子香气(苷元)上，从而调节受体分子在基体的生物活性、可溶性和稳定性。植物醇系香气糖基转移酶研究进展缓慢，限制了香气糖苷在体外的高效合成，制约了香气糖苷物质在食品、化妆品及医药行业的应用。
前期在大量糖基转移酶筛选的基础上,我们筛选到糖基转移酶csugt85a53在体外具有合成多种香气糖苷的能力,为多种香气物质糖苷的体外合成提供了可能(宋传奎，荆婷婷，高婷，张娜，董绪平，宛晓春，申请号：201710311140.4)，但其能否在烟草香气品质提升中具有作用仍然未知。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)由于烟叶中的烟碱含量高，刺激性强，劲头大具有辛辣味，对于烟叶的吃味影响很大。
(2)csugt85a53的体外活性已经已知，但能否将其应用到烟草香气糖苷前体提升上仍不清楚。
解决上述技术问题的难度和意义：烟草工业是财政收入的重要来源。烟叶的好坏直接决定卷烟的品质，而烟叶香气是烟叶的主要特色指标，是衡量烟叶质量和可用性的重要因素。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高烟草花果香香气糖苷前体的方法。
本发明是这样实现的，一种提高烟草花果香香气糖苷前体的方法，所述提高烟草花果香香气糖苷前体的方法基于基因的过量表达。将糖基转移酶基因csugt85a53在烟草中过量表达，可显著提高烟草中花果香香气前体的积累；将特定的香气物质施加到改造过的烟草叶片中，烟草叶片中富集该特定香型香气糖苷前体的能力提高10-20倍，为烟草香气的定向改造提供了方法。
进一步，所述具有花果香的醇系香气物质为苯甲醇，苯乙醇，香叶醇，芳樟醇，芳樟醇氧化物，香叶醇等。
进一步，所述提高烟草花果香香气糖苷前体的方法包括以下步骤：
步骤一，csugt85a53与过量表达载体(如pbi121)进行连接，构建该基因的过量表达载体；将该过量表达载体转入到gv3101等农杆菌中，在lb培养基进行培养，温度范围为25-29℃，通过菌落pcr和两端测序技术筛选阳性克隆，将阳性菌株在液体培养基中扩大培养至一定的浓度(od600＝0.5-1.2)
步骤二，利用携带有上述csugt85a53的过量表达载体的农杆菌对烟草叶片进行侵染，得到带有目的基因瞬时表达的烟草植株；或结合烟草叶盘侵染和组织培养方法得到csugt85a53稳定表达的烟草植株；
步骤三，花果香香气前体，如苯甲醇，苯乙醇，香叶醇，芳樟醇，芳樟醇氧化物，香叶醇等注射或喷施到改造过的烟草中；
步骤四，选择4个株系的转基因烟草通过lc-ms对从烟草叶片中萃取的糖苷进行检测。
进一步，所述步骤二中具体包括：
悬浮液的配置：50ml的im重悬液包括：0.1mol/l的mgcl2,500mmol/lmes,1mol/l乙酰丁香酮，ph调到5-6；
悬浮液的配置：10ml的im重悬液包括：10mmol/l的mgcl2和0.5μmol/l乙酰丁香酮将摇好的菌液取8-10毫升至离心管中，1000-4000×g离心10-20分钟，弃上清，用重悬液重悬至od600＝0.2-0.4，黑暗纺织2-3个小时选取6周长势良好的本氏烟草，挑选健康植株的嫩叶用注射器轻轻摩擦叶背除去角质层，从叶背注射300-500微升的重悬液待烟草自然生长3-6天后将100μmol/l的苯甲醇，苯乙醇，香叶醇，芳樟醇氧化物，香叶醇等的混合物或单个特定香型的香气注射或喷施到改造过的烟草中。
4-6个小时以后取样用液氮处理过之后保存在-80度冰箱将样品在液氮中磨碎后称取0.1克样品用500微升的甲醇进行低温超声萃取。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：从烟草原材料上进行花果香气糖苷前体的富集可以中和这种刺激性气味对烟叶品质的影响同时达到改良和丰富烟叶香型的目的。以突变体csugt85a83为例，通过在烟草中瞬时表达从而进行代谢物分析表明处理过的烟草与对照(pbi-intron-gus)对照相比能够产生更多的氧化芳樟醇糖苷(9.7倍)，香叶醇糖苷(8.0倍)，2-苯乙醇糖苷(7.7倍),苄醇糖苷(7.3倍)。
附图说明
图1是本发明实施例提供的提高烟草花果香香气糖苷前体的方法实现流程图。
图2是本发明csugt85a83定点突变后的重组蛋白相对活性分析(以野生型为100％)
图3-图6是本发明实施例提供的数据结果是通过lc/ms的方法分别验证了在处理过的烟草叶片中确实检测到了几种花果香香气糖苷(氧化芳樟醇糖苷，香叶醇糖苷，2-苯乙醇糖苷，苄醇糖苷)的产生示意图。
图7是本发明实施例提供的从统计结果上可以看出通过处理过的烟草植株产生氧化芳樟醇，香叶醇，2-苯乙醇,苄醇等花果香香气糖苷的量与对照组相比分别提高了9.7倍、8.0倍、7.7倍和7.3倍。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
苯甲醇，苯乙醇，香叶醇，芳樟醇氧化物，香叶醇等香气物质存在许多植物和水果中，具有怡人的芳香和花果香，但其本身稳定性差，在空气中容易变形变质，影响了其在食品，医药方面的应用，而这些物质的糖基化产物可以显著提高其稳定性，水溶性，降低其毒性，极大地拓宽这些香气物质应用到新的领域，因此，在烟草中通过转基因技术实现对一些花果香气前体的富集，改善烟叶的品质具有很大的商业前景。
如图1所示，本发明实施例提供的提高烟草花果香香气糖苷前体的方法包括以下步骤：
s101：csugt85a5(wt)的突变基因csugt85a53(e59d)csugt85a53(p283t)csugt85a53(l445m)的体外酶活实验；csugt85a53的突变体在体外酶活实验中催化相应的香气物质产生的糖苷；野生型酶的活性设定为100％；
s102：过量表达载体的构建(csugt85a53a与过量表达载体pbi121的连接)与转化；
s103：烟草的瞬时或稳定表达；
s104：选择4个株系的转基因烟草通过lc-ms对从烟草叶片中萃取的糖苷进行检测，香气物质的选择性施加到改造过的烟草中；
s105：利用lc-ms对烟草中萃取的糖苷进行定量分析。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。
csugt85a5编码的蛋白在体外具有催化苯甲醇，苯乙醇，香叶醇，芳樟醇氧化物，香叶醇等醇系香气糖基化的功能，(这种合成醇系香气糖苷高效生物酶及其制备方法已申请专利)。在此基础上，本发明将csugt85a5的氨基酸序列进行了定性改造，并研究了e59d、p283t、l445m突变体的酶活性；将csugt85a53或其突变体与过量表达载体连接构成重组质粒，转入农杆菌，将其在烟草中进行瞬时或稳定超表达。同时将苯甲醇，苯乙醇，香叶醇，芳樟醇氧化物，香叶醇等的混合物或单个特定香型的香气注射或喷施到改造过的烟草中。
本发明实施例提供的提高烟草花果香香气糖苷前体的方法可分为瞬时表达和稳定遗传具体包括以下步骤：
(1)过量表达载体的构建(csugt85a53(e59d)与过量表达载体pbi121的连接)与转化以csugt85a53(e59d)为例子进行说明：
把上述基因连接到pbi121载体上，转入gv3101菌中28℃培养挑克隆通过菌落pcr验证，将阳性菌株扩大培养30毫升左右至od600＝0.6-0.8，。
(2)突变体csugt85a53(e59d)在烟草中的瞬时表达
悬浮液的配置(1)：50ml的im重悬液包括：0.1mol/l的mgcl2,500mmol/lmes,1mol/las(乙酰丁香酮)，ph调到5-6之间，悬浮液的配置(2.1)：10ml的im重悬液包括：10mmol/l的mgcl2和0.5μmol/las(乙酰丁香酮)将摇好的菌液取8-10毫升至离心管中，1000-4000×g离心10-20分钟，弃上清，用重悬液重悬至od600＝0.2-0.4，黑暗纺织2-3个小时选取6周左右长势良好的本氏烟草，挑选健康植株的嫩叶用注射器轻轻摩擦叶背除去角质层，从叶背注射300-500微升的重悬液待烟草自然生长3-6天后将10-100μmol/l的苯甲醇，苯乙醇，香叶醇(注意防止产生毒害)，芳樟醇氧化物，香叶醇等的混合物或特定的某种香气成分注射或喷施到之前已经改造过的烟草中。4-6个小时以后取样用液氮处理过之后保存在-80度冰箱将样品在液氮中磨碎后称取0.1克样品用500微升的甲醇进行低温超声萃取；
(2.2)选择4个株系的转基因烟草通过lc-ms对从烟草叶片中萃取的糖苷进行检测，结果如图2-图5分别为从四个转基因株系以及四个转空载体pbi121株系的烟草叶片中提取的糖苷的含量及液相结果。(以之前确定的体外酶活反应生成的苯甲醇葡萄糖苷，苯乙醇葡萄糖苷，香叶醇葡萄糖苷，芳樟醇氧化物葡萄糖苷，香叶醇葡萄糖苷为参照。)
(3)突变体csugt85a53(e59d)在烟草中的稳定遗传(3.1)选取云烟无菌苗的幼嫩叶片，切成1平方厘米左右的小块用以上培养好的农杆菌侵染10分钟，，然后用灭菌纸吸取多余菌液，将叶片放入共培养基中(1/2ms培养基+3mg/l6-ba+0.2mg/lnaa)中，25度培养两天，然后进行抗性筛选，(共培养培养基+50mg/l卡那霉素+300mg/l羧苄青霉素)，培养近三天后叶片边缘分化出愈伤组织，然后从愈伤组织分化出抗性芽，待其长到1厘米左右切下，插入长苗培养基(1/2ms培养基+50mg/l卡那霉素+300mg/l羧苄青霉素)中，待根系发育好后，移栽入土，为提高目标产物，可在烟草生长过程中进行外源香气物质的喷洒或者饲喂，待烟草长出5-6片真叶即可检测相应的糖苷化合物的含量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。