本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种精确控制基因重排的基因元件及其重组质粒和应用。
背景技术：
近年来，随着基因组测序的能力不断提升，已经能够解析出过去难以发现的普遍存在的基因组重排现象。20世纪研究发现的基因组变异主要形式是单核苷酸多态性(snp)和异染色质多态性(hp)。然而，近几年研究发现，在微生物(如耶尔森氏菌、酵母)、植物(如青草、水稻)、动物(如七鳃鳗、小鼠)、人类基因组中普遍发现了基因组重排现象，尤其是，基因组内大量结构变异(sv)(包括片段缺失、重复、水平迁移、相互易位、倒位等)是包含更多信息变化的更高频遗传变异方式，这为基因组通过重排推动生命进化提供了关键性证据。天然基因组重排与性状改变之间存在普遍联系，为我们研究生命进化与新功能产生提供了重要蓝本。
天然基因组重排和变异时间跨度较大，功能定向进化可控性低。通过人工设计实现基因组不同尺度重排和变异可以极大弥补天然基因重排的不足，加速新功能的发现。化学合成基因组提供了一种“自下而上、用创造去理解”的新思路，是用于生命信息理解、功能发现的崭新强大工具。利用类似机制，在化学合成的酵母染色体内预设了“基于loxpsym位点特异性重组的合成型基因组重排系统(scramble)”，该设计初步实现了单基因区段缺失、复制、易位的基因组重排方法。例如在2011年合成型synixr染色体酿酒酵母、2014年合成型syniii染色体酿酒酵母以及2017年合成型synv染色体酿酒酵母。
其中，在2011年合成synixr染色体以及和2014年合成syniii染色体这两项研究工作中，研究者均使用pscw11-cre-ebd质粒(pcre1)来进行化学合成基因组的重排工作。pscw11启动子是子代细胞(daughtercell)特异性启动子，即在酵母出芽生殖过程中，pscw11启动子仅在子代细胞中表达。cre-ebd是cre重组酶和雌激素结合结构域(ebd)的融合蛋白。理论上，cre-ebd在缺失雌二醇(estradiol)的环境中通过与细胞质中的hsp90蛋白结合而停留在细胞质中。当培养环境中加入雌二醇后，其与ebd结构域结合产生活化的cre-ebd复合物从hsp90蛋白上解离下来，并在cre自身信号肽的引导下进入细胞核，作用于loxp位点，进而产生化学合成基因组的重排。
然而在这两篇报道中，研究者们均发现即使在不加入雌二醇的培养基中培养合成型酵母，也会有少量的菌株发生scramble，与此同时细胞生长曲线略低于对照组(不含pscw11-cre-ebd)，表明细胞生长受到轻微影响。尽管loxpsym位点仅插入非必须基因3’端utr区域，但通常情况下在合成型染色体上必须基因与非必须基因均匀分散在整个基因组中，使得重排过程中同样会发生必须基因的删除，从而导致细胞死亡，生长速率下降。因此可通过对比细胞生长速率间接证明重排反应的发生。综上所述，不难发现pscw11-cre-ebd质粒存在泄漏表达的问题，这对于控制基因重排来说是十分不利的。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种精确控制基因重排的基因元件，使得所述基因元件在scramble(基于loxpsym位点的基因重排)中能够精确控制基因重排，避免出现泄露表达的问题；
本发明的另外一个目的在于提供一种含有上述基因元件的重组质粒以及利用所述基因元件或其重组质粒对基于scramble的基因重排的控制方法。
本发明的另外一个目的在于提供一种利用所述基因元件或其重组质粒构建具备人为控制基因重排功能的重组酵母菌株，以期利于后续菌株的筛选工作；
本发明的另外一个目的在于提供一种利用上述重组酵母菌株进行多轮迭代基因重排的筛选优势表型菌株的方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种精确控制基因重排的基因元件，由pgal1启动子、cre-ebd融合蛋白基因以及终止子顺次拼接而成。
针对现有的基因元件在控制基因重排中存在泄漏表达的问题，本发明通过pgal1启动子、cre-ebd融合蛋白基因以及终止子共同组成控制基于scramble的基因重排的元件，能够控制cre的表达，精确控制基因重排的开启和关闭，避免泄漏表达的问题。
在本发明具体实施中，所述终止子选择tcyc1终止子进行实例的说明。
为比较不同启动子和不同控制方式对cre活性的控制，在本发明具体实施方式中构建pcre1(pscw11-cre-ebd),pcre2(pzeo1-cre-ebd),pcre3(pgal1-cre)和pcre4(pgal1-cre-ebd，本发明)四种基因元件“开关”，并分别和prs413构建出重组质粒；将以上四种“开关”质粒和对照质粒prs413分别转化至合成型5号染色体酿酒酵母(具备scramble的合成型染色体酵母菌株)，分别对应获得重组菌株prs413-synv、pcre1-synv、pcre2-synv、pcre3-synv和pcre4-synv，在葡萄糖培养基中培养32h，间隔2h取样检测od600并绘制生长曲线。结果显示，pcre4-synv与prs413-synv表现出相似的生长状态，而pcre1-synv、pcre2-synv与pcre3-synv相比于prs413-synv均表现出一定的生长缺陷，这说明单独ebd的控制以及gal1启动子的控制均不能完全抑制cre的泄漏活性，而pcre4结合ebd控制以及gal1启动子的控制形成的基因元件能够很好的控制泄漏表达。
同时，本发明还分别从不同诱导培养基和基因元件的表达强度方面验证了本发明所述基因元件在对基因重排的上精确控制效果。因此，本发明提出了所述基因元件在构建控制基因重排的重组质粒或构建具备人为控制基因重排功能的重组酵母菌株中的应用。
其中，所述基因重排为基于scramble的基因重排，即基于loxpsym位点特异性重组的合成型基因组重排系统，一般具有scramble的多为合成型染色体的酵母菌株，特别是酿酒酵母中(酿酒酵母合成基因组计划)，如在2011年合成型synixr染色体酿酒酵母、2014年合成型syniii染色体酿酒酵母以及2017年合成型synv染色体酿酒酵母；在该类酵母中，一项重要的设计原则是在非必须基因的3’端非翻译区(utr)插入一个loxpsym位点。染色体上的必须基因与非必须基因通常情况下是随即分布的，这样一条合成型染色体将被众多loxpsym位点间隔划分为不同的重组单元，loxpsym位点是34bp完全对称的回文序列。在cre重组酶的作用下，任意两个loxpsym位点都可能发生相互作用，导致两个位点之间的区域会随机发生染色体片段的缺失和倒位，同时在重组作用下处于复制状态的细胞会随机发生染色体片段的重复，实现基因重排。
根据所述基因元件的应用，本发明提供了一种控制基因重排的重组质粒，在基础质粒上含有本发明所述基因元件。所述基础质粒可以根据实际需要采用任何可以购买到的商业化质粒，如商业化质粒prs413(质粒图谱见图1)，而根据商业化质粒上的多克隆位点即可利用酶切方式将本发明所述基因元件连接到基础质粒上形成重组质粒。
同样地，本发明还提供了所述重组质粒在构建具备人为控制基因重排功能的重组酵母菌株中的应用，该基因重排同样为基于scramble的基因重排。
具体地，一种具备人为控制基因重排功能的重组酵母菌株，其为转化有本发明所述重组质粒的具备scramble的酵母菌株，所述转化方法可以参照本领域常规技术方法。通过构建该种重组酵母菌株可以对酵母菌株的优良表型进行筛选和基础研究。同时，更进一步优选地，该所述重组酵母菌株敲除了yel013w基因和/或yer042w基因，基于此操作能够提高其类胡萝卜素产量。
在本发明具体实施方式中，本发明提供了控制利用本发明所述基因元件构建的重组酵母菌株基因重排的方法，即将本发明所述重组酵母菌株在sgal-aa半乳糖培养基、含有雌二醇的sc-aa葡萄糖培养基或含有雌二醇的sgal-aa半乳糖培养基中培养开启基因重排，重排完成后，菌体离心并水洗并更换为常规培养基(sc-aa葡萄糖培养基)培养，关闭基因重排。其中，各培养基中的aa表示氨基酸，而sc-aa表示缺少所述aa的培养基，所缺少的aa根据重组质粒上所携带的氨基酸筛选标签相对应，方便筛选出是否正确导入重组质粒的菌株；以his标签为例，上述各培养基就为sgal-his半乳糖培养基和sc-his葡萄糖培养基。
合成型基因组重排是通过开启诱导，关闭诱导，生长分化和筛选鉴定这个周期进行的，对二倍体的单次的基因组重排过程确实增加了重排事件的种类和数量，但是并不能保证在一次重排中获得最好的重排结果。而自然界生物进化是一个漫长且持续的过程。为了快速且连续地在大量细胞群体上生成染色体多样性，本发明根据所述重组酵母菌株筛选优势表型酵母菌株的具体应用，在此基础上提供了一种多轮迭代基因重排(multiplexscrambleiterativecycling)的酵母菌株筛选方法，即通过挑选每一个周期结束筛选到性状改良或者提升的菌株再次进行新的基因组重排反应。通过这种迭代基因组重排反应，持续地逐步地提高菌株的优势表型。
此外，得到的具有优势表型的二倍体酵母菌株可以通过减数分裂产生孢子，将筛选到的孢子与新的合成型染色体酵母进行交配，产生新的二倍体，再进行多轮迭代基因组重排反应。这样可以逐步的融合多条合成型染色体在一个细胞内，扩大基因组重排可作用的范围，可以在更大范围内筛选全新的靶点。上述两个方法的流程示意图见图2。
具体地，根据上述多轮迭代基因组重排的第一种实现方式，所述筛选方法包括：
步骤1、开启本发明所述重组酵母菌株的基因重排，关闭基因重排并对完成基因重排的酵母菌株进行培养，然后根据所需的表型对完成基因重排的酵母菌株进行筛选，选取具备优良表型的酵母菌株；
步骤2、将所述具备优良表型的酵母菌株按照步骤1的方式开启基因重排并继续进行筛选，选取表型更优的酵母菌株；
步骤3、将所述表型更优的酵母菌株替换所述具备优良表型的酵母菌株重复步骤2。
根据上述多轮迭代基因组重排的第二种实现方式，所述筛选方法包括：
步骤1、开启权利要求9所述重组酵母菌株的基因重排，关闭基因重排并对完成基因重排的酵母菌株进行培养，然后根据所需的表型对完成基因重排的酵母菌株进行筛选，选取具备优良表型的酵母菌株；
步骤2、将所述具备优良表型的酵母菌株通过减数分裂产生单倍体孢子，通过拆胞筛选出颜色加深的单倍体孢子(即继承了优良表型的孢子)，将颜色加深的单倍体孢子与新的具备scramble的单倍体酵母菌株交配形成新的二倍体酵母菌株，然后按照步骤1的方式开启基因重排并继续进行筛选，选取表型更优的酵母菌株；
步骤3、将所述表型更优的酵母菌株替换所述具备优良表型的酵母菌株重复步骤2。
在上述两种筛选方法中，具备潜在优势表型的酵母菌株往往在颜色上不同于出发菌株，这能够根据所需要的表型类型，通过方便的目测方法将具备潜在优势表型的酵母菌株挑选出来，但是颜色较深时，通过肉眼不容易分别，因此本发明在优选采用通过菌株颜色目测筛选时，将待筛选菌株在30-37℃范围内逐步升温培养，进一步筛选颜色相近的菌株。在该范围内，随着温度的升高，众多颜色很深的菌株颜色会变浅，相对差异比较明显，可以挑选出其中颜色相对较深的菌。并且，在恢复至菌株最适温度后，其颜色也会恢复至正常，表明对菌株的优势表型不会产生影响。
本发明所述表型类型在实际中可以为任何有利于实际生产和研究的表型类型，如高产、耐药、耐高温等，而对具备这些优势表型的菌株，本领域有比较成熟的一套筛选方法。
由以上技术方案可知，本发明通过pgal1启动子、cre-ebd融合蛋白基因以及终止子共同组成控制基于scramble的基因重排的“开关”，能够控制cre的表达，精确控制基因重排的开启和关闭，避免泄漏表达的问题。并且能够应用于后续重组质粒和重组酵母菌株的构建中以及优势表型酵母菌株的筛选中。
附图说明
图1所示为prs413质粒图谱；
图2所示为本发明所述多轮迭代基因重排的酵母菌株筛选方法的流程示意图；
图3所示为本发明基因元件和pscw11-cre-ebd的结构示意图；
图4所示为本发明所述重组质粒pcre4的质粒图谱；
图5所示为重组质粒pcre1的质粒图谱；
图6所示为分别转化pcre1和pcer4的合成型syniii号酿酒酵母和合成型synv号酵母的平板生长结果；其中，平板从左至右的稀释度依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6；
图7所示为重组质粒pcre2的质粒图谱；
图8所示为重组质粒pcre3的质粒图谱；
图9所示为本发明基因元件、pscw11-cre-ebd、pzeo1-cre-ebd和pgal1-cre的结构示意图；
图10所示为转化有不同重组质粒的合成型synv号酿酒酵母的od600生长曲线；
图11所示为转化有本发明所述重组质粒pcre4的合成型synv号酿酒酵母在不同诱导培养基下的代时柱形图；其中，柱形图下方表格依次表示葡萄糖培养基、半乳糖培养基以及雌二醇；
图12所示为pgal1-cre-ebd-gfp和pscw11-cre-ebd-gfp的结构示意图；
图13所示为分别转化有重组质粒pcre5和pcre6的合成型synv号酿酒酵母的od600荧光光强度柱形图；其中，initial表示初始状态，switchon表示开启状态，switchoff表示关闭状态；柱形a表示转化有重组质粒pcre5的合成型synv号酿酒酵母的荧光强度，柱形b表示转化有重组质粒pcre6的合成型synv号酿酒酵母的荧光强度；
图14所示为分别转化有重组质粒pcre5和pcre6的合成型synv号酿酒酵母的细胞gfp图像；其中，initial表示初始状态，switchon表示开启状态，switchoff表示关闭状态；cre5表示转化有重组质粒pcre5的合成型synv号酿酒酵母的细胞图像，cre6表示转化有重组质粒pcre6的合成型synv号酿酒酵母的细胞图像；
图15所示为利用本发明基因元件构建的合成型synv号酿酒酵母经过基因重排后筛选的菌株的类胡萝卜素(番茄红素+β-胡萝卜素)产量柱形图；
图16所示为本发明所述多轮迭代基因重排的酵母菌株筛选方法筛选出的5代菌株的类胡萝卜素(番茄红素+β-胡萝卜素)产量柱形图；
图17所示为30-37℃不同温度下培养的菌株的颜色结果；其中a图表示一个酵母转化涂布到多个平板后分别放置于不同的温度下进行培养；b图表示一个平板上的酵母菌落翻印到多个平板后放置于不同的温度下进行培养；
图18所示为敲除不同基因的酿酒酵母的类胡萝卜素(番茄红素+β-胡萝卜素)产量柱形图；其中，柱形图下方表格对应各菌株敲除基因的情形。
具体实施方式
本发明公开了一种精确控制基因重排的基因元件及其重组质粒和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述基因元件及其重组质粒和相关应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述基因元件及其重组质粒和相关应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
依照本发明技术核心，所述基因元件由pgal1启动子、cre-ebd融合蛋白基因以及终止子顺次拼接而成，即pgal1启动子+cre-ebd融合蛋白基因+终止子，pgal1启动子和cre-ebd融合蛋白基因在本领域中有唯一对应的基因序列。
在实施例的验证使用中，所涉及到的基因序列和培养基配方如下：
pgal1序列如seqidno:1所示，cre-ebd融合蛋白基因序列如如seqidno:2所示，tcyc1序列如seqidno:3所示，pzeo1序列如如seqidno:4所示。
sc-his葡萄糖培养基：葡萄糖20g/l，ynb6.7g/l，四缺氨基酸粉末2g/l(-ura,-his,-leu,-trp)，ura20mg/l，trp20mg/l，leu100mg/l，ph调至6.0；
sgal-his半乳糖培养基：半乳糖20g/l，ynb6.7g/l，四缺氨基酸粉末2g/l(-ura,-his,-leu,-trp)，ura20mg/l，trp20mg/l，leu100mg/l，ph调至6.0；
sc-his培养基：ynb6.7g/l，四缺氨基酸粉末2g/l(-ura,-his,-leu,-trp)，ura20mg/l，trp20mg/l，leu100mg/l，ph调至6.0；
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：本发明所述基因元件与pscw11-cre-ebd对合成型酵母染色体生长的影响
根据pgal1启动子、cre-ebd融合蛋白基因以及tcyc1终止子的基因序列，顺次拼接人工合成本发明基因元件(示意图见图3)，并连接至prs413质粒上，获得重组质粒pcre4(pgal1-cre-ebd)，质粒图谱见图4；同时以根据pscw11启动子、cre-ebd融合蛋白基因以及tcyc1终止子的基因序列，顺次拼接人工合成对照基因元件(示意图见图3)，并连接至prs413质粒上，获得重组质粒pcre1(pscw11-cre-ebd)，质粒图谱见图5；
将pcre1和pcer4分别转化至合成型syniii号酵母和合成型synv号酵母(均为具备scramble的合成型染色体酿酒酵母)，通过点板稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6)对比生长情况。如图6所示，与空白对照(prs413质粒)相比，在sc-his培养基中(prs413质粒含有his标签，在sc-his培养基中可以筛选到是否转入了重组质粒的菌株)，在稀释浓度为10-1～10-2时，由于菌落密集无法观察到差别；而当浓度为10-4～10-6时，pcre1-synv和pcre1-syniii稀释组的菌落数相比于对照组均显著降低，pcre4-synv和pcre4-syniii稀释组地的菌落数相比于对照组没有明显差别。实验结果显示pcre1导致synv酵母和syniii酵母均出现生长缺陷，而pcre4没有导致此现象。
这表明了由于pcre1表达的过量cre-ebd没有与hsp90结合而扩散进入细胞核，而pcre4中pgal1启动子的转录控制以及cre-ebd的定位控制非常有效地调节了cre重组酶，证明pgal1-cre-ebd可以精确控制合成型基因组的重排。
实施例2：不同基因元件对合成型酵母染色体基因重排的影响
为比较不同启动子和不同控制方式对cre活性的控制，在本实施例中构建pcre1(pscw11-cre-ebd)，pcre2(pzeo1-cre-ebd，质粒图谱见图7)，pcre3(pgal1-cre，质粒图谱见图8)和pcre4(pgal1-cre-ebd)四种“开关”质粒(图9)，其中pzeo1是一个组成型表达的弱启动子，这是考虑到pscw11是否过强而造成泄漏表达进行的对比设置；pcre3的ebd接合域被移除。将以上四种“开关”质粒和对照质粒prs413分别转化至合成型synv号酿酒酵母，并将重组菌株prs413-synv、pcre1-synv、pcre2-synv、pcre3-synv和pcre4-synv在葡萄糖培养基中培养32h，间隔2h取样检测od600并绘制生长曲线。
如图10所示，pcre4-synv与prs413-synv表现出相似的生长状态，而pcre1-synv、pcre2-synv与pcre3-synv相比于prs413-synv均表现出一定的生长缺陷，这说明单独ebd的控制以及gal1启动子的控制均不能完全抑制cre的泄漏活性，而pcre4结合ebd控制以及gal1启动子的控制形成的基因元件能够很好的控制泄漏表达。
实施例3：本发明所述基因元件在不同诱导方式下对合成型酵母染色体基因重排的影响
为评估本发明基因元件的性能，将实施例2中prs413-synv(对照)和pcre4-synv在4种不同条件下培养：(1)sc-his葡萄糖培养基；(2)具有1μm雌二醇的sc-his葡萄糖培养基；(3)sgal-his半乳糖培养基；(4)添加有1μm雌二醇的sgal-his半乳糖培养基。通过酶标仪记录生长曲线，并根据公式计算酵母的代时(doublingtime)。
如图11所示，当用sc-his葡萄糖培养基培养细胞时，pcre4-synv与对照组之间的代时无显著差异。当用葡萄糖培养基中添加1μm雌二醇时，pcre4-synv相比对照组的代时有所延长，这说明在葡糖糖培养基中pgal1启动子也有微量的泄漏表达。当用sgal-his半乳糖培养基培养细胞时，pcre4-synv与对照相比较其代时显著延长了8.3％。这说明gal1启动子被半乳糖诱导后表达，并产生大量cre-ebd，其中过量的部分进入细胞核引发基因组重排反应。当半乳糖和雌二醇同时加入到培养基中时，pcre4-synv酵母的代时显著延长到10小时，是对照组的1.5倍。证明cre-ebd大量转运进入细胞核，发生剧烈的合成基因组重排反应。
实施例4：本发明所述基因元件与pscw11-cre-ebd的表达强度对比
为研究pcre1和pcre4这两个开关的表达强度，利用cre-ebd与gfp绿色荧光蛋白构建融合蛋白，并分别置于pscw11和pgal1启动子控制之下，得到了pcre5(pscw11-cre-ebd-gfp-tcyc1)和pcre6(pgal1-cre-ebd-gfp-tcyc1)这两个质粒(图12)。
由于pcre5与pcre6这两个开关的诱导条件有所不同，因此这里分别定义，对于pcre5，其“初始”(initial)状态为sc-his葡萄糖培养基中培养8小时，“开启”(switchon)状态为添加1μm雌二醇的sc-his葡萄糖培养基培养8小时，“关闭”(switchoff)状态为经历“开启”状态培养8小时后，菌体离心并水洗两遍之后重悬于sc-his葡萄糖培养基中培养8小时。
对于pcre6，其“初始”状态为sc-his葡萄糖培养基中培养，“开启”状态为添加1μm雌二醇的sgal-his半乳糖培养基，“关闭”状态为经历“开启”状态培养8小时后，菌体离心并水洗两遍之后重悬于sc-his葡萄糖培养基中培养8小时。用酶标仪分别测量pcre5-synv与pcre6-synv在各自“初始”“开启”以及“关闭”的荧光强度/od600。
如图13所示，pcre5-synv在“初始”状态“开启”状态和“关闭”状态下的cre-ebd-gfp表达量分别为10.9,16.3和13.4(a.u.)。而pcre6-synv在“初始”状态，“开启”状态和“关闭”状态下的cre-ebd-gfp表达量分别为1.5,99.5和1.8(a.u.)。与pcre5相比，pcre6在“开启”状态下具有更高的表达强度，在“初始”状态和“关闭”状态下具有较低的表达强度。
如图14所示，同时用荧光显微镜分别拍摄记录pcre5-synv和pcre6-synv的细胞gfp荧光图像。可以发现pcre5-synv细胞在三种情况下都有低水平的绿色荧光。pcre6-synv在“初始”状态和“关闭”状态下没有观察到绿色荧光，在“开启”状态下有显著的绿色荧光。这些结果表明，本发明所述基因元件相比pscw11-cre-ebd具有更高的on/off比。这可能是由于pscw11只在子代细胞中表达，pgal1在开启状态下相当于组成型启动子，理论上所有细胞都会表达，因此理论上pgal1-cre-ebd可以作用于酵母细胞产生基因组重排的比例更大。
实施例5：利用本发明构建的具备人为控制基因重排功能的重组酵母菌株筛选优良表型
以生产类胡萝卜素的合成型synv号酿酒酵母为出发菌株(编号为yjbh000，通过整合外源crte，crti和crtyb三个基因整合到到synv酵母yel063c/can1基因座中，构建了异源类胡萝卜素合成途径)，筛选具备高产类胡萝卜素优良表型的酿酒酵母，方法具体如下：
将前述实施例构建的pcre4质粒转化到yjbh000酿酒酵母，菌液涂布到sc-his葡萄糖琼脂上，在30℃培养72小时。
将单个菌落接种在5mlsc-his中过夜培养，第二天用ddh2o洗涤两次，用含有1μm雌二醇(sigma-aldrich)的2％半乳糖sgal-his培养基中重悬至od600＝1.0。在30℃下诱导菌株8小时使细胞中的cre-ebd表达，开始scramble进展。
取1ml培养物离心分离酵母细胞，用ddh2o洗涤2次，并重悬于1mlsc-his葡萄糖培养基中。
将上一步洗涤过的菌调整到od600＝1,用sc-his葡萄糖培养基稀释10-3，10-4和10-5后涂布于sc-his葡萄糖琼脂平板，并在30℃孵育菌株，直到观察到酵母菌落的类胡萝卜素色素有明显差异(72小时至120小时)。
从这个琼脂中挑选酵母菌落。在sc-his葡萄糖琼脂上进行划线培养，并用sc-his葡萄糖培养基接种于48孔板中，30℃下震荡培养48小时。
挑选比yjbh000颜色更深的菌株进行发酵。取三个独立的菌落接种到5mlypd培养基中培养24小时，然后以od600为0.1接种与40ml的ypd培养基(40g/l葡萄糖)，在30℃，250rpm摇床中发酵培养60小时。
离心收集2ml发酵培养物，并用1ml丙酮从沉淀中提取类胡萝卜素。通过hplc分析样品。流动相由甲醇-乙腈-二氯甲烷(9：40：1v/v)组成，流速为30ml/min。
将最终确定高产的菌株进行全基因组深度测序(illuminahiseq2000平台)。验证类胡萝卜素生产的基因组结构变异。根据基因组序列数据，通过对照细胞中的缺失或过表达分析结构变异的突变体。
最终筛选出五株高产单倍体菌株，yjbh001，yjbh012，yjbh026，yjbh027和yjbh029，类胡萝卜素产量分别提高到19.22mg/l，21.76mg/l，19.59mg/l，19.15mg/l，19.38mg/l。如图15所示，yjbh000的类胡萝卜素生产量为12.53mg/l，与其相比，基因组重排进化后的yjbh001，yjbh012，yjbh026，yjbh027和yjbh029的类胡萝卜素产量提高了1.53～1.74倍。
实施例6：本发明多轮迭代基因重排的酵母菌株筛选方法
参照实施例5中的筛选方法，仍以synv号酿酒酵母为基础菌株构建生产类胡萝卜素的菌株(编号为yjbd000，通过整合外源crte，crti和crtyb三个基因整合到到synv酵母yel063c/can1基因座中，构建了异源类胡萝卜素合成途径)进行第一轮筛选，得到高产类胡萝卜素的yjbd001菌株，以其作为第二轮出发菌，继续按照实施例5的方法进行基因组重排并筛选高产菌株，得到yjbd038。以此递推，第三轮得到yjbd048，第四轮得到yjbd057，第5轮得到yjbd069。结果发酵分析(图16)，相比与yjbd000，yjbd038，yjbd048，yjbd057和yjbd069的类胡萝卜素生产增加到12.37mg/l(12.8x)，29.98mg/l(31.1x)，35.83mg/l(37.2x)和37.39mg/l(38.8x)。生产力在前四个周期中有较大的增长，最后一个周期只有稍微的生产力增加，这可能是由于达到了当前系统的上限，高水平类胡萝卜素积累引起的生长缺陷的最大能力所致。这些结果表明，多轮迭代基因组重排是一种有效的筛选方法，可以不断的富集优势遗传性状，持续的增加基因型多样性提升生产力。
实施例7：高温培养辅助筛选优势表型的进化菌株
依靠颜色筛选来进行高通量筛选时会遇到一个普遍存在的问题，即当要被筛选的菌株颜色很深的时候，肉眼很难再区分出其中颜色更深的菌株。以yjbh000酿酒酵母或yjbd000酿酒酵母为出发菌株筛选高类胡萝卜素产量的进化菌株时，相对于yjbh000酿酒酵母或yjbd000酿酒酵母(均为浅黄色)，潜在高产优势表型的进化菌株颜色表现为红色、橙红、橙色或黄色，颜色越深代表高产的可能越大。
现有研究中，keaslin在利用类胡萝卜素颜色筛选酵母单敲库寻找靶点的工作中为了解决该问题，选择使用yb/i/bts1来显著降低出发菌的颜色。但是筛选优势表型菌株的目的就是为了优势表型持续存在，不能通过改变基因永久降低颜色来筛选。因此本发明提供了一种通过高温培养辅助筛选优势表型酵母菌株的方法
如图17中a所示，将利用实施例5方法基因组重排后的酵母菌涂到四个sc-his葡萄糖琼脂平板上，并分别在30℃，33℃，35℃和37℃培养3天；图13中b中，将同一个平板分别翻印到四个sc-his葡萄糖琼脂平板上，也分别放入在30℃，33℃，35℃和37℃培养3天。
可以观察到，随着培养温度的升高，菌落颜色整体呈现出下降趋势，而在37℃产类胡萝卜素酵母几乎接近于白色。表明在高温下培养可以降低菌群的背景颜色，通过肉眼可以准确分辨之前颜色较深不易分辨的潜在优势表型菌株。酿酒酵母最适生长温度是30℃，温度身高对细胞代谢不利，因此在高于30度培养时菌落颜色会变浅，但本发明这个方法是让酵母细胞暂时降低了产量，当重新在30度培养时，又可以恢复正常颜色。
实施例8：基因敲除试验
对实施例5中的yjbh000中yel013w，yel014c(用于对照)和yer042w这三个基因分别进行单独敲除和组合敲除，获得yjbn009(敲除yel013w基因)，yjbn010(敲除yel014w基因，yjbn006(敲除yel014c和yel013w基因)，yjbn007(敲除yer042w基因)和yjbn008(敲除yel014c、yel013w和yer042w基因)五种试验菌株。然后按照如下方法发酵生产：
取菌株接种到5mlypd培养基中活化培养24小时，然后以od600为0.1接种与40ml的ypd培养基(40g/l葡萄糖)，在30℃，250rpm摇床中发酵培养60小时。
离心收集2ml发酵培养物，并用1ml丙酮从沉淀中提取类胡萝卜素。通过hplc分析样品。流动相由甲醇-乙腈-二氯甲烷(9：40：1v/v)组成，流速为30ml/min。
结果见图18，yjbn009，yjbn010，yjbn006，yjbn007和yjbn008的类胡萝卜素总产量分别是：10.97mg/l，18.94mg/l，9.63mg/l，16.05mg/l，12.73mg/l和17.56mg/l。和未敲除任何基因的yjbh000菌株相比，yjbn009，yjbn006和yjbn008的产量均有显著提升，从而证明yel013w靶点的删除可以提升类胡萝卜素的合成，此外还可以看出yer042w的删除在高产类胡萝卜素酵母中可以提高beta胡萝卜素的比例。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>天津大学
<120>一种精确控制基因重排的基因元件及其重组质粒和应用
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