本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物rnai表达载体及其构建方法和应用。
背景技术：
植物突变体很难获得，有些基因的突变对植物可能是致死的，基因沉默相对容易获得，rna干扰(rnainterference,rnai)是一种转录后基因沉默技术，是一种有效的研究功能基因的反向遗传学工具。rnai是由双链rna(dsrna)介导的由特定酶参与的转录后基因沉默现象，该现象是andrewfire和craigmello等首先在线虫中发现的，是一种在真核生物中非常保守且普遍存在的机制，它是通过将与靶基因的转录产物mrna存在同源互补序列的具有部分双链结构的rna(dsrna)导入细胞后，然后将与之同源的mrna高效特异的降解成21～23nt的小片段，促使细胞内特定基因缺失，最后达到阻止基因表达的目的。rnai基因沉默实验中，双链rna往往以发夹结构rna的形式存在。
传统构建植物rnai表达载体，常规采用的方法是酶切和连接，对目的基因片段进行切割并且回收，受制于限制性内切酶的切点，既浪费时间过程又繁琐，并且小片段很难回收，多个片段不容易连接，质粒载体的分子量都比较大，用酶切和连接的方法构建载体成功率不高。
gateway技术是invitrogen已经商业化的技术，它是基于噬菌体的位点特异性重组反应，在目的片段添加重组位点，将pcr产物与含重组位点的供体载体混合进行bp反应获得入门载体(entryclone)，入门载体可以和不同用途的目标载体进行lr反应获得相应的表达载体，也就是说利用该技术获得表达载体通常需要通过bp反应和lr反应两个步骤，实验周期较长，成本较高。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种植物rnai表达载体及其构建方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种植物rnai表达载体，所述植物rnai表达载体含有目的基因片段表达元件，所述目的基因片段表达元件含有camv35s启动子、内含子、ocs终止子、两个方向相反的gateway盒子；所述内含子位于两个方向相反的gateway盒子之间，用于表达发卡rna结构中的环；所述gateway盒子含有attr1位点、attr2位点、cmr基因、ccdb基因和一个ecori酶切位点，gateway盒子用于表达方向相反的目的基因片段，构成发卡rna结构中的臂。
进一步地，所述gateway盒子是ecorⅴ酶切pbs-gateway-rfa载体获得，所述ecorⅰ酶切位点距离attr1位点453bp，距离attr2位点1257bp。
进一步地，所述目的基因片段表达元件以phannibal载体为中间载体获得；所述植物rnai表达载体以pcambia2301载体为骨架，将目的基因片段表达元件插入pcambia2301载体的多克隆位点中获得。
进一步地，所述植物rnai表达载体的核苷酸序列如seqidno.1所示。
本发明还提供了上述植物rnai表达载体的构建方法，包括以下步骤：
步骤1：分别用ecorⅰ和hindⅲ单酶切phannibal载体，纯化酶切后的产物，再利用高保真taq酶补平切点，得到e片段和h片段；
步骤2：用ecorⅴ酶切pbs-gateway-rfa载体，回收得到gateway盒子，所述gateway盒子含有attr1位点、attr2位点、cmr基因、ccdb基因和一个ecori酶切位点；
步骤3：将步骤1中所述e片段和h片段分别与步骤2中所述gateway盒子连接，再经筛选获得phannibal-gw1.1载体和phannibal-gw1.2载体；所述phannibal-gw1.1载体的gateway盒子中的attr1位点与camv35s启动子连接，attr2位点与内含子连接；所述phannibal-gw1.2载体的gateway盒子中的attr1位点与ocs终止子连接，attr2位点与内含子连接；
步骤4：用kpnⅰ和xhoⅰ对phannibal-gw1.1载体和phannibal-gw1.2载体进行双酶切，将从phannibal-gw1.1载体切出的含有kpnⅰ和xhoⅰ粘性末端的gateway盒子，与用kpnⅰ和xhoⅰ双酶切phannibal-gw1.2载体后的片段连接，获得含有两个方向相反的gateway盒子的重组载体phannibal-gw2；
步骤5：用sacⅰ和speⅰ双酶切phannibal-gw2载体，回收得到目的基因片段表达元件，然后与用sacⅰ和xbaⅰ双酶切pcambia2301载体后的片段连接，得到pcambia2301-gw-rnai载体，即为植物rnai表达载体，speⅰ和xbaⅰ为同尾酶，切出的粘性末端之间可以进行连接。
进一步地，步骤3中所述筛选包括以下步骤：首先选择含有e片段和gateway盒子的重组载体、含有h片段和gateway盒子的重组载体，然后对含有e片段和gateway盒子的重组载体用ecorⅰ和kpnⅰ酶切检测，电泳结果中含有1300bp左右大小片段的为phannibal-gw1.1载体；对含有h片段和gateway盒子的重组载体用ecorⅰ单酶切检测，电泳结果中含有2000bp左右大小片段的为phannibal-gw1.2载体。
本发明还提供了含有上述植物rnai表达载体的宿主细胞。
本发明还提供了上述植物rnai表达载体在构建目的基因rnai沉默载体中的应用。
进一步地，所述植物rnai表达载体在构建目的基因rnai沉默载体中的应用，包括以下步骤：
步骤1：以含有目的基因cds的dna序列为模板，使用正向引物和反向引物进行pcr扩增得目的基因片段，所述正向引物和所述反向引物的5'端含有接头序列，其核苷酸序列分别如seqidno.2和seqidno.3所示；
步骤2：以任一入门载体为模板，以l1-f和l1-r为引物扩增含有attl1位点的dna片段，以l2-f和l2-r为引物扩增含有attl2位点的dna片段，l1-f、l1-r、l2-f和l2-r的核苷酸序列如seqidno.4～7所示；
步骤3：将步骤1所得的目的基因片段和步骤2所得的含有attl1位点的dna片段、含有attl2位点的dna片段混合，进行融合pcr，得到含有attl重组位点的目的基因片段；
步骤4：将步骤3所得的含有attl重组位点的目的基因片段与所述植物rnai表达载体进行lr反应，得到目的基因rnai沉默载体。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供一个gateway盒子改造后的植物rnai表达载体，使用该空载体进行一步lr反应即可完成目的基因rnai沉默载体的构建：将含有attl重组位点的目的基因片段与本发明的植物rnai表达载体进行一步lr反应，即可获得目的基因rnai沉默载体。
2、本发明以pcambia2301载体为骨架构建植物rnai表达载体，pcambia2301载体本身携带有gus基因的表达元件，在利用目的基因rnai沉默载体转化植物后可以用gus染色来鉴定转基因植株。
3、本发明中扩增目的基因片段所用正向引物和反向引物的5'端含有接头序列，均为22bp，比常规gateway反应的29个碱基的接头序列略短。该方法能极大的缩短实验周期，节省实验成本一半左右。
4、本发明利用融合pcr得到含有attl位点的目的基因片段，进而直接进行gateway的lr反应而不需通过bp反应，简化了目的基因rnai沉默载体的构建步骤。
附图说明
图1为融合pcr得到含有attl重组位点的目的基因片段示意图。
图2为phannibal载体示意图。
图3为实施例1中phannibal载体分别用ecorⅰ和hindⅲ单酶切回收后的电泳检测图，m为marker，泳道1代表ecorⅰ单酶切phannibal载体后得到的e片段，泳道2代表hindⅲ单酶切phannibal载体后得到的h片段。
图4为pbs-gateway-rfa载体中gw盒子两端酶切位点示意图。
图5为实施例1中phannibal-gw1.1载体示意图。
图6为实施例1中phannibal-gw1.2载体示意图。
图7为实施例1中phannibal-gw1.1和phannibal-gw1.2载体的电泳检测图，m为marker，泳道1～4为正确的phannibal-gw1.1载体，泳道5～6为正确的phannibal-gw1.2载体，7～9为反向插入的重组质粒1.2。
图8为实施例1中phannibal-gw2载体示意图。
图9为实施例1中phannibal-gw2载体的酶切电泳图，m为marker，泳道1～8均为phannibal-gw2载体。
图10为实施例1中pcambia2301-gw-rnai载体示意图。
图11为实施例1中pcambia2301-gw-rnai载体的酶切电泳图，m为marker。
图12为实施例2中融合pcr获得的含有attl重组位点的cebip基因片段电泳检测图，m为marker，泳道1～2均为含有attl重组位点的cebip基因片段扩增产物。
图13为实施例2中不同菌液浓度时蛋白表达积累水平检测图，0.7代表od600=0.7的含有35ss-cebip-3ha质粒的农杆菌重悬菌液，0.35代表od600=0.35的含有35ss-cebip-3ha质粒的农杆菌重悬菌液。
图14为实施例2中cebip基因沉默载体pcambia2301-cebip-rnai和过表达载体35ss-cebip-3ha转化本生烟叶片时蛋白积累水平检测图；α-ha表示ha的抗体，rubisco表示内参蛋白，-表示未转化，+表示转化。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1植物rnai表达载体pcambia2301-gw-rnai的构建
pcambia2301载体，phannibal载体，pbs-gateway-rfa载体均为商业化载体。
植物rnai表达载体pcambia2301-gw-rnai的构建包含以下步骤：
步骤1：单酶切phannibal载体
phannibal载体是常用来构建rnai表达载体的中间载体，如图2所示。传统的方法是将目的基因的200～300bp长的片段以相反的方向插入到phannibal载体中内含子两侧的多克隆位点，然后用notⅰ把从camv35s启动子到ocs终止子的片段切下来，与植物表达载体连接，构建成最终的rnai表达载体。本发明以phannibal载体为中间载体来构建植物rnai表达载体。首先分别用ecorⅰ和hindⅲ单酶切phannibal载体，ecorⅰ和hindⅲ单酶切phannibal载体后形成突出的粘性末端，为了方便连接反应，将单酶切后的产物纯化后利用高保真taq酶对切点补平，分别得到e片段和h片段，回收后电泳检测如图3所示。
步骤2：酶切pbs-gateway-rfa载体获取gateway盒子
pbs-gateway-rfa载体含有gateway盒子，所述gateway盒子含有attr1位点、attr2位点、cmr基因、ccdb基因和一个ecorⅰ酶切位点，ecorⅰ酶切位点距离attr1位点453bp，距离attr2位点1257bp，紧靠attr1和attr2位点的位置有ecorⅴ的切点，如图4所示，用ecorⅴ酶切pbs-gateway-rfa载体，电泳回收约1.7kb大小的片段。
步骤3：phannibal载体单酶切补平后产物与gateway盒子连接
pbs-gateway-rfa载体经ecorⅴ切后回收的片段为平末端，可以和步骤1中的e片段和h片段连接。利用t4dna连接酶，将e片段和h片段分别与gateway盒子连接。gateway盒子中含有ccdb毒基因，该基因产物对普通大肠杆菌细胞致死，含有该基因的载体只能存在于db3.1菌株中，另外gateway盒子含有氯霉素的抗性基因，能赋予宿主菌株氯霉素抗性，同时phannibal载体含有氨苄青霉素抗性基因，赋予宿主菌株氨苄青霉素抗性。因此将连接产物分别转化大肠杆菌db3.1感受态细胞，转化后的菌液分别涂布在含有氨苄青霉素和氯霉素的lb平板上，将平板倒置37℃培养12小时以上至长出单克隆，挑取单克隆在含有氨苄青霉素的液体lb培养基培养过夜，提取质粒，标记为重组质粒1.1和重组质粒1.2。
在含有氯霉素抗性的培养基上长出的单克隆理论上均含有gateway盒子，但是平末端连接方向不定，因此需要筛选出具有正确连接方向的载体。phannibal-gw1.1载体的gateway盒子正确连接方向是：attr1位点与camv35s启动子连接，attr2位点与内含子连接，如图5所示；phannibal-gw1.2载体中的gateway盒子正确连接方向是：attr1位点与ocs终止子连接，attr2位点与内含子连接，如图6所示。因gateway盒子中含有一个ecorⅰ的酶切位点，该酶切位点距attr1末端453bp，距attr2末端1257bp，另外在phannibal载体上camv35s启动子和内含子间有kpnⅰ、ecorⅰ和xhoⅰ的切点，所以用ecorⅰ和kpnⅰ酶切重组质粒1.1，切出约1300bp片段的为phannibal-gw1.1载体，切出约500bp的为反向插入，对重组质粒1.2用ecorⅰ单酶切，切出约2000bp片段的为phannibal-gw1.2载体，切出约1300bp的为反向插入，如图7所示。
步骤4：phannibal-gw1.1载体和phannibal-gw1.2载体双酶切后连接
用kpnⅰ和xhoⅰ分别对phannibal-gw1.1载体和phannibal-gw1.2载体进行双酶切，从phannibal-gw1.1载体切出含有kpnⅰ和xhoⅰ粘性末端的gateway盒子，与用kpnⅰ和xhoⅰ双酶切phannibal-gw1.2载体后的片段连接即可得到含有两个方向相反的gateway盒子的中间载体。将得到的中间载体转化大肠杆菌db3.1感受态细胞，转化后的菌液涂布在含有氨苄青霉素和氯霉素的lb平板上，对长出的单克隆在含有氨苄青霉素的液体lb培养基中培养过夜，提取质粒，即为phannibal-gw2，如图8所示。
上述phannibal-gw2载体含有一个kpnⅰ切点和两个ecorⅰ切点，用kpnⅰ和ecorⅰ进行双酶切，得到三个片段，分别约为6000bp、2000bp和1300bp，如图9所示。
步骤5：pcambia2301-gw-rnai载体的构建
将phannibal-gw2载体用sacⅰ和speⅰ酶切，回收6300bp处的片段，该片段即为目的基因片段表达元件，包含了camv35s启动子、两个方向相反的gateway盒子、一个内含子、一个ocs终止子，所述内含子位于两个方向相反的gateway盒子之间。用sacⅰ和xbaⅰ酶切pcambia2301载体，然后与回收的目的基因片段表达元件连接，speⅰ和xbaⅰ为同尾酶，得到的粘性末端可以进行连接。接着将连接产物转化大肠杆菌db3.1，涂布在含卡那霉素和氯霉素的双重抗生素的lb平板上，37℃培养过夜，挑单菌落摇菌（37℃250rpm10h），提取质粒，即为pcambia2301-gw-rnai载体。
pcambia2301-gw-rnai载体有三个ecorⅰ的切点，用ecorⅰ酶切载体切出三个条带，约12800bp、3300bp和1800bp，如图10和11所示。
实施例2大麦cebip基因的rnai沉默载体的构建及检测
1.植物材料和培养条件：
植物材料：本生烟；培养条件：温室培养；16h光照(150μmol/(m2s))、温度21℃；8h黑暗、温度19℃；相对湿度55%。
2.实验载体：
pcambia2301载体，phannibal载体，pbs-gateway-rfa载体，pdonr207载体均为商业化载体。利用gateway技术，将cebip基因片段整合到供体载体pdonr207上获得入门载体penty-cebip；然后将入门载体penty-cebip和载体ctapi-35ss-gw-3ha进行lr反应得到载体35ss-cebip-3ha，载体35ss-cebip-3ha将cebip与3ha标签融合表达，便于后期检测，其中ha为抗原标签，为来自流感病毒的一段氨基酸序列，所述3ha表示3个ha抗原标签串联重复，35ss表示两个35s串联。
3.大麦cebiprnai基因rnai沉默载体的构建：
以过表达载体35ss-cebip-3ha为模板扩增大麦cebip基因片段，正向引物序列为5’-actttgtacaaaaaagcaggctccaaagaccctcaagaagga-3’，如seqidno.8所示，反向引物序列如seqidno.9所示，为5’-actttgtacaagaaagctgggtagccgttggaataaccactg’。
以l1-f和l1-r为引物扩增含有attl1的dna片段，以l2-f和l2-r为引物扩增含有attl2的dna片段，模板为入门载体penty-cebip。pcr反应使用kapahifipcrkits(kapabiosystems)，pcr反应体系（50μl）按照试剂盒说明书配制，每管0.5μl模板，正向引物、反向引物各2.5μl。pcr反应条件：95℃预变性3min；98℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。扩增片段经电泳检测为单一条带，然后纯化备用。
上面扩增得到的大麦cebip基因片段、含有attl1的dna片段和含有attl2的dna片段各取1μl，如图1所示，利用融合pcr获得含有attl位点的cebip基因片段，电泳检测结果如图12所示，扩增片段为单一条带，纯化备用。融合pcr反应使用kapahifipcrkits(kapabiosystems)，pcr反应体系（50μl）按照试剂盒说明书配制，大麦cebip基因片段、含有attl1的dna片段和含有attl2的dna片段各取1μl，先不加引物。pcr反应条件：95℃预变性3min；98℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，5个循环；72℃延伸5min；打开pcr仪，在反应体系中加入引物l1-f和l2-r各2.5μl进行pcr程序，95℃预变性3min；98℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，25个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
用含有attl位点的cebip基因片段和实施例1得到的pcambia2301-gw-rnai载体在lr酶的催化下进行lr反应，反应条件为含有attl位点的cebip基因片段3μl，本发明得到的pcambia2301-gw-rnai载体1μl，lr酶1μl，25℃反应3h，反应产物转化大肠杆菌，涂布在含有卡那霉素的lb固体培养基上，37℃过夜倒置培养至长出单克隆，菌液pcr鉴定，得到大麦cebip基因rnai沉默载体pcambia2301-cebip-rnai，保菌提质粒备用。
4.农杆菌转化培养：
将35ss-cebip-3ha质粒、pcambia2301-cebip-rnai质粒通过冻融法分别转化于农杆菌gv3101，涂布lb平板（含有利福平50mg/l，卡那霉素50mg/l，庆大霉素50mg/l）培养，28℃倒置培养3天后长出单菌落，挑单克隆到1.5ml含有抗生素（利福平50mg/l，卡那霉素50mg/l，庆大霉素50mg/l）的lb液体培养基，28℃200rpm过夜培养，菌液pcr鉴定，得到农杆菌gv3101阳性菌株，保菌备用。
5.本生烟叶片瞬时转化和检测：
将含有35ss-cebip-3ha质粒的农杆菌和含有pcambia2301-cebip–rnai质粒的农杆菌保存菌液分别在含有抗生素（利福平50mg/l，卡那霉素50mg/l，庆大霉素50mg/l）的lb平板上划线，28℃倒置培养3天至长出单克隆，分别挑取农杆菌单克隆，于含有抗生素（利福平50mg/l，卡那霉素50mg/l，庆大霉素50mg/l）、乙酰丁香酮（终浓度20μm）和mes（终浓度10mm）的lb液体培养基中28℃培养过夜，然后将菌液分别与lb液体培养基按照1:200体积比混合，继续培养至od600=1.0～1.5。
接着将菌液分别在3000rpm/min下离心15min，收集菌体，用重悬液悬起至od600=0.7，然后将od600=0.7的含有35ss-cebip-3ha质粒的农杆菌重悬菌液和重悬液等体积混合使od600=0.35。所述重悬液成分为：2%重量比的蔗糖，5g/lms盐，200μm乙酰丁香酮，10mm的mes。重悬后的菌液在暗处放置1～3小时，用于本生烟叶片瞬时转化。
将上述od600=0.7、含有35ss-cebip-3ha质粒的农杆菌重悬菌液和od600=0.7、含有pcambia2301-cebip–rnai质粒的农杆菌重悬菌液1:1混合，得混合菌液。取1ml注射器，除去针头，分别吸取od600=0.7、od600=0.35的含有35ss-cebip-3ha质粒的农杆菌重悬菌液和上述混合菌液，从本生烟叶片的背面注射，做好标记，弱光培养三天。三天后提取注射叶片的蛋白，用ha抗体进行westernblot检测。结果如图13所示，不同浓度（od600=0.7和od600=0.35）的含有35ss-cebip-3ha质粒的农杆菌重悬菌液注射本生烟叶片，叶片中cebip的积累量没有明显差异。说明本发明所用菌液浓度范围内叶片中cebip的积累量不以含有35ss-cebip-3ha质粒的农杆菌重悬菌的浓度变化而变化。如图14所示，混合菌液注射的叶片中cebip的积累量显著降低，说明cebip基因被成功沉默。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
sequencelisting
<110>周口师范学院
<120>一种植物rnai表达载体及其构建方法和应用
<130>无
<160>9
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>17965
<212>dna
<213>人工序列
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<400>6
acccagctttcttgtacaaac21
<210>7
<211>24
<212>dna
<213>人工合成
<400>7
gtaacatcagagattttgagacac24
<210>8
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<400>8
actttgtacaaaaaagcaggctccaaagaccctcaagaagga42
<210>9
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actttgtacaagaaagctgggtagccgttggaataaccactg42