本发明属于植物基因工程领域，涉及一种杨树的遗传转化方法。
背景技术：
杨树是杨属(populus)树种的统称，分布十分广泛，目前全世界约有杨树100多种。因杨树具有生长速度快、种子成熟快、基因组较小等生物学特点，被广泛用于开展生物学基础研究。又因杨树是根癌农杆菌的天然寄主，便于农杆菌介导法进行遗传转化，所以杨树被认为是林木基因工程研究的模式植物。
近年来，杨树基因功能的研究越来越受到人们的关注，主要是围绕着性状改良、树种转化及抗性新品种的培育等方面展开的。然而，过去杨树的转化效率比较低，而且过程比较繁琐。因此，建立高效的杨树遗传转化体系具有重要的生物学意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种杨树的遗传转化方法。
本发明所提供的杨树的遗传转化方法，具体可包括如下步骤：
(a1)采用含有目的基因表达载体的农杆菌侵染液侵染杨树无菌叶片，将侵染后的杨树叶片置于共培养培养基上进行共培养。
本发明中，所使用的遗传转化受体是无菌组培苗叶片，通常取顶端幼嫩的叶片，除去发黄老叶，以保证外植体的较强分裂和转化能力。
(a2)将在所述共培养培养基上的叶片撕开后接种到筛选培养基上进行培养，得到愈伤组织。
(a3)将所述愈伤组织接种到分化培养基上进行培养，得到不定芽。
(a4)将所述不定芽接种到生根培养基上进行培养，得到生根的幼苗。
(a5)对所述生根的幼苗进行鉴定。
在步骤(a1)中，所述共培养培养基中含有浓度为100μm的乙酰丁香酮(as)。
在步骤(a2)中，所述筛选培养基中含有浓度为0.1mg/l的激动素(kt)和浓度为1.0-2.0mg/l(如1.0mg/l)的2,4-d。
在步骤(a3)中，所述分化培养基中含有浓度为0.05-0.1mg/l(如0.05mg/l)的naa和浓度为0.5-1.0mg/l(如0.5mg/l)的6-ba。
进一步地，所述共培养培养基是在wpm培养基中加入mes、蔗糖、凝固剂、乙酰丁香酮(as)后得到的培养基；所述共培养培养基中mes的终浓度为0.5g/l、蔗糖的终浓度为20g/l、乙酰丁香酮(as)的终浓度为100μm。其中，所述凝固剂可为琼脂或植物凝胶。琼脂在所述共培养培养基中的终浓度可为7.8g/l。植物凝胶在所述共培养培养基中的终浓度可为4.5g/l。
进一步地，所述筛选培养基是在wpm培养基中加入mes、蔗糖、凝固剂、2,4-d、kt和抗生素后得到的培养基；所述筛选培养基中mes的终浓度为0.5g/l、蔗糖的终浓度为20g/l、2,4-d的终浓度为1.0-2.0mg/l(如1.0mg/l)、kt的终浓度为0.1mg/l。
其中，所述抗生素可为所述目的基因表达载体上携带的抗性筛选标记所对应的抗生素，和能够抑制农杆菌生长的抗生素(如特美汀和/或头孢霉素)。在本发明的一个实施例中，所述抗生素具体为潮霉素、头孢霉素和特美汀。在所述筛选培养基中，潮霉素b的终浓度为1mg/l或2mg/l、头孢霉素的终浓度为200mg/l、特美汀的终浓度为200mg/l。其中，潮霉素b为所述目的基因表达载体上携带的抗性筛选标记所对应的抗生素；而特美汀和头孢霉素的作用是抑制农杆菌生长的。其中，所述凝固剂可为琼脂或植物凝胶。琼脂在所述筛选培养基中的终浓度可为7.8g/l。植物凝胶在所述筛选培养基中的终浓度可为4.5g/l。
进一步地，所述分化培养基是在wpm培养基中加入mes、蔗糖、凝固剂、naa、6-ba和抗生素后得到的培养基；所述分化培养基中mes的终浓度为0.5g/l、蔗糖的终浓度为20g/l、naa的终浓度为0.05-0.1mg/l(如0.05mg/l)、6-ba的终浓度为0.5-1.0mg/l(如0.5mg/l)。其中，所述凝固剂可为琼脂或植物凝胶。琼脂在所述分化培养基中的终浓度可为7.8g/l。植物凝胶在所述分化培养基中的终浓度可为4.5g/l。其中，所述抗生素可为所述目的基因表达载体上携带的抗性筛选标记所对应的抗生素，和能够抑制农杆菌生长的抗生素(如特美汀和/或头孢霉素)。在本发明的一个实施例中，所述抗生素具体为潮霉素、头孢霉素和特美汀。在所述分化培养基中，潮霉素b的终浓度为1.5mg/l、头孢霉素的终浓度为200mg/l、特美汀的终浓度为200mg/l。其中，潮霉素b为所述目的基因表达载体上携带的抗性筛选标记所对应的抗生素；而特美汀和头孢霉素的作用是抑制农杆菌生长的。
进一步地，所述生根培养基是在wpm培养基中加入mes、蔗糖、凝固剂和抗生素后得到的培养基；所述生根培养基中mes的终浓度为0.5g/l、蔗糖的终浓度为20g/l。其中，所述凝固剂可为琼脂或植物凝胶。琼脂在所述生根培养基中的终浓度可为7.8g/l。植物凝胶在所述生根培养基中的终浓度可为4.5g/l。其中，所述抗生素可为所述目的基因表达载体上携带的抗性筛选标记所对应的抗生素，和能够抑制农杆菌生长的抗生素(如特美汀和/或头孢霉素)。在本发明的一个实施例中，所述抗生素具体为潮霉素、头孢霉素和特美汀。在所述生根培养基中，潮霉素b的终浓度为1.5mg/l、头孢霉素的终浓度为200mg/l、特美汀的终浓度为200mg/l。其中，潮霉素b为所述目的基因表达载体上携带的抗性筛选标记所对应的抗生素；而特美汀和头孢霉素的作用是抑制农杆菌生长的。
进一步地，步骤(a1)中，所述含有目的基因表达载体的农杆菌侵染液可按照包括如下步骤的方法制备获得：向含有目的基因表达载体的农杆菌菌悬液中加入乙酰丁香酮(as)至其终浓度为100μm；所述含有目的基因表达载体的农杆菌菌悬液为含有所述目的基因表达载体的农杆菌菌体用重悬液重悬至od600为0.3后所得。所述重悬液具体为wpm培养基(液体)(具体配方为：向表1所示wpm培养基中加入蔗糖至其终浓度为20g/l)。
更加具体的，取50ml含有目的基因表达载体的农杆菌菌液(od600值在0.6左右)至50ml离心管中进行离心，离心的条件为18℃(常温也可)、3500rpm、15min。弃上清，加入重悬液(液体wpm培养基)重悬，重悬液最终加入至约100ml体积(od600约0.3左右)，再加入100μl100μm的as即得所述含有目的基因表达载体的农杆菌侵染液，其中as的终浓度约为100μm。
进一步地，步骤(a1)中，可按照包括如下步骤的方法采用所述含有目的基因表达载体的农杆菌侵染液侵染杨树无菌叶片：将待侵染的杨树无菌叶片用手术刀在滤纸上划出伤口，然后置于所述含有目的基因表达载体的农杆菌侵染液中侵染10-15min，期间不时摇晃。因为侵染时间过长易引起叶片萎蔫，状态变差，侵染时间过短又造成转化率低。
进一步地，步骤(a1)中，将侵染后的杨树叶片置于所述共培养培养基上进行共培养可按照包括如下步骤的方法实现：将侵染后的杨树叶片用滤纸吸干菌液，但不要让叶片过干，然后倒置铺在所述共培养培养基上，24-25℃避光放置1-2天(如2天)。
进一步地，步骤(a2)可按照包括如下步骤的方法获得愈伤组织：将在所述共培养培养基上的叶片撕开后接种到所述筛选培养基上，24-25℃黑暗培养，每两到三周(如两周)继代一次，直至得到愈伤组织(大约一个月会长出愈伤)。
进一步地，步骤(a3)可按照包括如下步骤的方法获得不定芽：将所述愈伤组织接种到所述分化培养基上，在24-25℃(如25℃)、每天光照时间为14-16h(如16h)的条件下进行培养，每两到三周(如三周)继代一次，直至得到不定芽(本阶段大约两个月左右)。
进一步地，步骤(a4)可按照包括如下步骤的方法获得不定芽：将长度大于1cm的不定芽接种到所述生根培养基上，在24-25℃(如25℃)、每天光照时间为14-16h(如16h)的条件下进行培养，得到生根的幼苗。
进一步地，步骤(a5)中，对所述生根的幼苗进行鉴定的方法可包括如下中任一种或多种(最好几种方法结合起来鉴定阳性幼苗)：pcr、qrt-pcr以及表型观察。
其中pcr和qrt-pcr可针对所述目的基因进行。
本发明还要求保护如下培养基或成套培养基。
所述培养基为前文任一所述的共培养培养基。
所述成套培养基由前文任一所述的共培养培养基、前文任一所述的筛选培养基、前文任一所述的分化培养基和前文任一所述的生根培养基组成。
另外，包括前文所述的含有目的基因表达载体的农杆菌侵染液和所述“培养基或成套培养基”的试剂盒也属于本发明的保护范围。
所述“培养基或成套培养基”或所述试剂盒在杨树遗传转化中的应用也属于本发明的保护范围。
在本发明的一个实施例中，所述杨树为84k杨、毛白杨或者南林895。所述目的基因为mirna156的编码基因。
在本发明中，所述wpm培养基的溶剂为水；溶质及浓度如下：
(1)大量元素：
k2so4990mg/l；mgso4·7h2o370mg/l；kh2po4170mg/l；nh4no3400mg/l；
(2)微量元素：
mnso4·h2o22.3mg/l；znso4·7h2o8.6mg/l；h3bo36.2mg/l；cuso4·5h2o0.25mg/l；na2moo4·2h2o0.25mg/l；
(3)钙盐：
ca(no3)2·4h2o556mg/l；cacl2·2h2o96mg/l；葡萄糖酸钙65mg/l；
(4)铁盐：
feso4·7h2o27.8mg/l；na2edta37.3mg/l；
(5)有机：
肌醇100mg/l；甘氨酸2.0mg/l；vb11.0mg/l；vb60.5mg/l；vb30.5mg/l。
本发明提供了一种缩短杨树转化周期，提高杨树转基因效率的方法。本方法具有以下优点：1)优化了农杆菌介导的叶片转化技术体系，使转化周期缩短，经过体细胞胚胎发生过程，转化率提高；2)选用无菌的幼嫩叶片为外植体，保证外植体的较强分裂和转化能力；3)操作简单，易于掌握，省时省力；4)重复性高。同时，本发明的遗传转化体系不受天气和季节等环境因素的影响，极大地提高了杨树转基因效率，对杨树转基因育种，基因功能验证等具有重要的技术支撑作用。
附图说明
图1为本发明实施例中整体转化流程图，其中依次为：无菌苗、侵染叶片、共培养、筛选培养、分化培养、生根培养。
图2为本发明实施例中再生植株阳性苗dna电泳检测图。wt为未经转化的84k杨树。3、4为阴性株系，1、2、5-18为阳性株系。
图3为本发明实施例中再生植株阳性苗qrt-pcr检测结果。wt1和wt2为未经转化的84k杨树；1-6为阳性株系。
图4为本发明实施例中野生型植株与转基因植株表型对比。左侧为野生型植株；右侧为转基因植株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用到的wpm培养基的具体配方如表1所示。
表1wpm培养基
注：*此处的含量为最终wpm培养基中的含量
下面以84k杨树为例，进一步说明本发明所提供的杨树再生体系的建立方法。
实施例1、84k杨树过表达mirna156的快速高效遗传转化过程
84k杨树过表达mirna156的快速高效遗传转化过程的流程图见图1。
1、首先将需要转化的目的基因进行载体构建，构建成功后转化到农杆菌中，使用液体lb进行摇菌。其中卡那霉素的终浓度为50mg/l、利福平的终浓度为25mg/l，使其od600值在0.6左右。将菌液于50ml离心管中18℃3500rpm条件下离心15min，加入重悬液(液体wpm培养基)(即向表1所示wpm培养基中加入蔗糖至其终浓度为20g/l)重悬，重悬液最终加入至约100ml体积(od600约0.3左右)，再加入100μl100mm的as即可进行侵染。
其中，含有mirna156表达基因的重组载体是按照包括如下步骤的方法构建的：以84k杨树的cdna为模板，采用引物mirna156f和mirna156r进行pcr扩增，将扩增产物以同源重组的方式插入到pcxsn载体(由中国科学院青岛生物能源与过程研究所提供，携带潮霉素b抗性基因)的m13通用引物之间，得到重组载体pcxsn-mirna156。pcxsn-mirna156的结构描述为：在pcxsn载体的m13通用引物之间插入seqidno.1所示dna片段后得到的重组质粒。
mirna156f：5’-caccctcctcagacaacaacaag-3’；
mirna156r：5’-ctggtggtaggatttttgtca-3’。
2、选择生长健壮、生命力旺盛的杨树无菌组培苗作为实验材料，以保证外植体的较强分裂和转化能力。将组培苗顶端幼嫩的叶片取下，用手术刀在滤纸上划出伤口用于侵染，叶片在侵染液中侵染10-15min，期间不时摇晃。
3、将侵染后的叶片用滤纸吸干菌液，但不要让叶片过干，倒置铺在共培养培养基上，25℃避光放置2天(时间长短视情况而定，叶片边缘有菌出现但不应该有大面积的菌群即可，最多不超过2天)。
其中，所述共培养培养基为是在wpm培养基中加入mes、蔗糖、琼脂、乙酰丁香酮(as)后得到的培养基；所述共培养培养基中mes的终浓度为0.5g/l、蔗糖的终浓度为20g/l、琼脂的终浓度为7.8g/l、乙酰丁香酮(as)的终浓度为100μm。
4、将叶片撕开并转移到筛选培养基上(潮霉素b为1mg/l)，继续25℃暗培养约两周，愈伤长出后，继代到新的筛选培养基(潮霉素b为2mg/l)两周继代一次，大约一个月会长出愈伤。
其中，所述筛选培养基是在wpm培养基中加入mes、蔗糖、植物凝胶、2,4-d、kt、潮霉素b、头孢霉素和特美汀后得到的培养基；所述筛选培养基中mes的终浓度为0.5g/l、蔗糖的终浓度为20g/l、植物凝胶的终浓度为4.5g/l、2,4-d的终浓度为1.0mg/l、kt的终浓度为0.1mg/l、潮霉素b的终浓度为1mg/l或2mg/l、头孢霉素的终浓度为200mg/l、特美汀的终浓度为200mg/l。
5、愈伤至指甲盖大小时，转移到分化培养基上，在25℃，每天16小时光照(8小时黑暗)的条件下进行培养，约三周继代一次。期间愈伤会变绿，变硬，长出不定芽。本阶段大约两个月左右。
其中，所述分化培养基是在wpm培养基中加入mes、蔗糖、植物凝胶、naa、6-ba、潮霉素b、头孢霉素和特美汀后得到的培养基；所述分化培养基中mes的终浓度为0.5g/l、蔗糖的终浓度为20g/l、植物凝胶的终浓度为4.5g/l、naa的终浓度为0.05mg/l、6-ba的终浓度为0.5mg/l、潮霉素b的终浓度为1.5mg/l、头孢霉素的终浓度为200mg/l、特美汀的终浓度为200mg/l。
6、待不定芽生长至约1cm后，切下，放入生根培养基，在25℃，每天16小时光照(8小时黑暗)的条件下进行培养，约一周生根。
其中，所述生根培养基是在wpm培养基中加入mes、蔗糖、植物凝胶、潮霉素b、头孢霉素和特美汀后得到的培养基；所述生根培养基中mes的终浓度为0.5g/l、蔗糖的终浓度为20g/l、植物凝胶的终浓度为4.5g/l、潮霉素b的终浓度为1.5mg/l、头孢霉素的终浓度为200mg/l、特美汀的终浓度为200mg/l。
7、将生根得到的幼苗进行pcr、qrt-pcr鉴定和表型观察。
pcr使用引物为35s的正向引物即：5’-gacgcacaatcccactatcc-3’和156的反向引物即：5’-ctggtggtaggatttttgtca-3’。
qrt-pcr使用的内参基因是ptef1β，检测的是mirna156的成熟序列，具体方法可以参考文章“quantitativert-pcrmethodsformaturemicrornaexpressionanalysis”进行。引物序列如下：
sl156rt：
5’-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacgtgctc-3’；
sl168rt：
5’-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacttcccg-3’；
mir156rt-f：5’-cggcggtgacagaagagagt-3’；
mirnart-r：5’-gtgcagggtccgaggt-3’；
mir168rt-f：5’-tgctcgcttggtgcagat-3’。
pcr结果显示，18株植株中有16株为阳性苗，结果如图2所示。随后从16株阳性苗中随机选取6株进行目的基因表达量即qrt-pcr验证，结果也符合预期及pcr的结果(图3)，同时表型观察也符合pcr、qrt-pcr的结果(过表达mir156会使植株分枝增多)(图4)。
<110>北京林业大学
<120>一种杨树的遗传转化方法
<130>gncln180137
<160>1
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<210>1
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<400>1
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aggaagggtgatggacgcatatcagattcaatcgagagtaagggaggtgacagaagagag240
tgagcacacatggtactttcgtgtatgatgtttcattctcgaagctatgtgtgctcactc300
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tgttttctaatactatgcatatctgtttatgcatcatatctcatattatgcatctcagct420
acattttcttttcatatcatatatcattctttatatatatggggtactttttaggctgat480
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