本发明涉及一种利用三角褐指藻生产多不饱和脂肪酸和岩藻黄质的兼养培养方法，属生物工程技术领域。
背景技术：
岩藻黄质（fucoxanthin），又名岩藻黄素或褐藻黄素，属于类胡萝卜素的含氧衍生物，常见于褐藻和硅藻中。岩藻黄质在藻类细胞中主要行使光合系统中捕捉光能的作用。岩藻黄质与叶绿素a和叶绿素c组成岩藻黄质-叶绿素蛋白复合体（fucoxanthin-chlorophyllprotein，fcp）。在近年的研究中，岩藻黄质已被证明是一种安全有效的膳食补充剂，它可以促进新陈代谢并且不对神经系统造成影响，具有抗肥胖、抗糖尿病、抗氧化，抗炎、抗肿瘤等多种生理活性[1]。大量实验研究表明，岩藻黄质的减肥机理是由于它可以激活对脂肪分解有促进作用的ucp1线粒体解偶联蛋白的表达，达到分解脂肪细胞，防止脂肪堆积的作用[2]。
岩藻黄质具有抗氧化的活性。抗氧化作用是类胡萝卜素的重要特征之一，其许多生物效应都涉及到清除活性氧的能力，这是其具有疾病预防作用的因素之一。最近研究发现岩藻黄质还可以通过调节na+/k+-atp酶的活性防止细胞膜过氧化。该试验还证实了由于岩藻黄质的作用，给缺乏视黄醇的老鼠喂养岩藻黄质可以逐渐提高过氧化氢酶和谷胱甘肽转移酶的活性，从而达到抗氧化的作用[3]。
二十碳五烯酸（eicosapentaenoicacid，epa，c20h30o2）是含五个双键的多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacid，pufa），属于ω-3脂肪酸。该脂肪酸家族主要包括α-亚麻酸（α-linolenicacid，ala）、二十碳五烯酸（epa）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid，dha）。epa对婴儿大脑发育及成人心血管系统疾病的防治具有很好的效果，同时还具有防止血栓、防止血小板凝结，舒张血管、降低胆固醇和血压等作用[4]。目前用于食品和保健品的天然epa主要从海洋鱼油中提取，epa占鱼油的比例可达到20%~30%。然而，鱼油中epa的产量受到捕鱼种类、捕鱼季节和地点的影响；另外，鱼油中高含量的胆固醇及异味严重影响着鱼油的质量。
海洋微藻在海洋生态系统中具有重要的作用，作为初级生产者，它们是海洋生物的重要食物来源。海洋微藻细胞内含有大量的长链不饱和脂肪酸，其中epa含量丰富。微藻油脂中的pufas组成简单、胆固醇低。因此，利用微藻生产epa等不饱和脂肪酸具有广阔的市场前景。在海洋微藻中，三角褐指藻（phaeodactylumtricornutum）、微拟球藻（nannochloropsisoceanica）、等鞭金藻（isochrysisgalbana）和新月菱形藻（nitzschiaclosterium）等含有较高的epa，能达到油脂含量的20%以上[5]。并且海洋微藻中还富含色素特别是岩藻黄质。其中三角褐指藻由于其生长速率快，油脂含量高等特点被人们所关注。其生长速率可达到0.38g/l/d，收获后油脂含量能达到48%以上，epa产率可达到36mg/l/d，近年来作为新的epa生产来源。同时，作为典型的硅藻，三角褐指藻中富含fcp复合体，岩藻黄质含量在15.42-16.51mg/g之间。
微藻的营养方式具有多样性，大多数微藻采用光合自养（phetoautotrophy）方式，许多微藻具有利用有机碳进行兼养（mixotrophy）和异养（heterotrophy）生长的能力。自养的光限制因素严重制约了微藻生物量，兼养和异养能够部分或全部消除光限制[6]，成为提高微藻产量和胞内活性物质含量的有效途径，因此微藻的兼养和异养研究成为近年来国内外藻类生物学关注的热点问题。
兼养是利用co2和有机碳，同时进行光合作用和呼吸作用，因此在光限制条件下，大多数微藻的兼养比生长速率约等于自养和异养比生长速率之和[7]，如：卡德藻（tetraselmissp.）、雨生红球藻（haematococcuspluvialis）和小球藻（chlorellavulgaris）等。兼养为微藻高密度培养提供了一条有效途径，兼养和异养有利于胞内活性物质的积累，对于开发微藻生产胞内活性物质提供了很好的途径。
但选择一种适合兼养微生物利用的碳源，是决定兼养生长速度和经济性高于其他培养方式的最关键因素。《三角褐指藻的自养、兼养和异养特性研究》（刘晓娟等，暨南大学，2008.）公开了硅藻门经济微藻三角褐指藻能够利用多种有机碳源进行兼养培养，但是在兼养过程中仍然存在易污染，兼养效果不显著等不足，限制了大规模培养技术的发展。
甘露醇是山梨糖醇的同分异构体，两种醇类物质的二号碳原子上羟基朝向不同，分子式是c6h14o6，分子量为182.17。易溶于水，为白色透明的固体，有类似蔗糖的甜味。目前，利用甘露醇为碳源进行微生物培养的文献已有报道，但更多的集中于异养方式培养异养微生物。如日本专利文献jp2004024121a（申请号jp2002185745）公开了一种短周期的桦褐孔菌菌丝体培养方法，该方法利用液体培养基进行桦褐孔菌菌丝体的培养，液体培养基中涉及的碳源为一种非还原二糖，如海藻糖或蔗糖或糖醇（如甘露醇，山梨糖醇或麦芽糖醇），液体培养基的初始ph值为3.5-6.5。但并未对甘露醇是否适合做为兼养微生物的碳源以及如何利用甘露醇使其达到大幅提高兼养微生物生长速度目的的报道。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用三角褐指藻生产多不饱和脂肪酸和岩藻黄质的兼养培养方法。本发明通过使用新的兼养碳源达到提高生物量的目的，同时添加使用生物活性物质促进兼养碳源的利用和提高三角褐指藻在生长过程中的抗逆性，达到提高三角褐指藻生产产率的目的。
本发明其中的一个技术方案如下：
甘露醇在兼养培养硅藻生产多不饱和脂肪酸和/或岩藻黄质中的应用。
根据本发明优选的，上述甘露醇作为碳源配制成培养基，兼养培养硅藻生产多不饱和脂肪酸和岩藻黄质；进一步优选的，所述甘露醇的添加量为每升培养基添加1～20g；最优的，所述甘露醇的添加量为每升培养基添加2g；进一步优选的，所述培养基，每升组份如下：
1～20g甘露醇，0.1～10gnano3，10～40g海水盐，2～10mgna2edta，1～9mgfecl3•6h2o，2～12mgnah2po4•12h2o，10～60mgna2sio3•7h2o，0.001～0.1mgcuso4•5h2o，0.002～0.2mgmgso4•7h2o，0.001～0.1mgcocl2•6h2o，0.02～2mgmncl2•4h2o，0.001～0.01mgna2moo4•2h2o，0.0001～0.01mg生物素（biotin）；更优的，所述培养基，每升组份如下：
2g甘露醇，1gnano3，30g海水盐，4.37mgna2edta，3.65mgfecl3•6h2o，6.7mgnah2po4•12h2o，30mgna2sio3•7h2o，0.01mgcuso4•5h2o，0.022mgmgso4•7h2o，0.01mgcocl2•6h2o，0.18mgmncl2•4h2o，0.006mgna2moo4•2h2o，0.0005mg生物素（biotin）。
根据本发明优选的，所述培养基还包括茶多酚或茶多酚活性成分，浓度0.05～2g/l；进一步优选的，茶多酚或茶多酚活性成分浓度为0.2g/l。
根据本发明优选的，所述硅藻选自小环藻属（cyclotella）、菱形藻属（nitzschia）、舟形藻属（navicula）、筒柱藻属（cylindrotheca）或褐指藻属（phaeodactylum）；进一步优选的，所述褐指藻属（phaeodactylum）为三角褐指藻，小环藻属（cyclotella）为小环藻。
根据本发明优选的，上述应用，步骤如下：
（1）将硅藻培养至对数生长期，制得种子液；
（2）将步骤（1）制得的种子液按5～50%的体积比接种至上述培养基中，在温度20～30℃、50～300μmolphotons·m−2·s−1光照条件下培养3～5天，然后维持培养体系中甘露醇浓度为1～20g/l，继续培养4～8天，制得含有多不饱和脂肪酸和岩藻黄质的发酵液。
进一步优选的，所述步骤（2）中，培养条件为：温度23～25℃、光照条件80μmolphotons·m−2·s−1；更优的，光照条件的光周期为16h光照、8h黑暗；进一步优选的，所述步骤（2）中，维持甘露醇浓度为2g/l；进一步优选的，所述步骤（2）中，维持nano3浓度为0.1～10g/l；更优的，所述步骤（2）中，维持nano3浓度为1g/l。
本发明另一个技术方案如下：
茶多酚或茶多酚活性成分在兼养培养硅藻生产多不饱和脂肪酸和/或岩藻黄质中的应用。
根据本发明优选的，所述的茶多酚中儿茶素类化合物质量百分比含量为65%～85%；优选的，所述茶多酚活性成分选自儿茶素类（黄烷醇类）、黄酮及黄酮醇类、花青素类、酚酸及缩酚酸类和/或聚合酚类化合物；进一步优选的，所述儿茶素类化合物选自：儿茶素（ec）、没食子儿茶素（egc）、儿茶素没食子酸酯（ecg）和/或没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）。
茶多酚为普通市售产品，包括了多种化合物的混合物，化学成分为儿茶素类（黄烷醇类）、黄酮及黄酮醇类、花青素类、酚酸及缩酚酸类、聚合酚类等化合物的复合体。其中儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分。儿茶素类化合物主要包括儿茶素（ec）、没食子儿茶素（egc）、儿茶素没食子酸酯（ecg）和没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）4种物质。本技术方案包含以上4种儿茶素类化合物的单独添加应用。
根据本发明优选的，上述茶多酚或茶多酚活性成分作为生物活性物质添加入培养基，兼养培养三角褐指藻生产多不饱和脂肪酸和岩藻黄质；进一步优选的，所述茶多酚为含有儿茶素类化合物占茶多酚总质量的65%～85%；进一步优选的，所述茶多酚或茶多酚活性成分的添加量为每升培养基添加0.05～2g；最优的，所述茶多酚或茶多酚活性成分的添加量为每升培养基添加0.2g；进一步优选的，所述培养基，每升组份如下：
1～20g碳源，0.1～10gnano3，10～40g海水盐，2～10mgna2edta，1～9mgfecl3•6h2o，2～12mgnah2po4•12h2o，10～60mgna2sio3•7h2o，0.001～0.1mgcuso4•5h2o，0.002～0.2mgmgso4•7h2o，0.001～0.1mgcocl2•6h2o，0.02～2mgmncl2•4h2o，0.001～0.01mgna2moo4•2h2o，0.0001～0.01mg生物素（biotin），茶多酚或茶多酚活性成分0.05～2g；更优的，所述培养基，每升组份如下：
2g碳源，1gnano3，30g海水盐，4.37mgna2edta，3.65mgfecl3•6h2o，6.7mgnah2po4•12h2o，30mgna2sio3•7h2o，0.01mgcuso4•5h2o，0.022mgmgso4•7h2o，0.01mgcocl2•6h2o，0.18mgmncl2•4h2o，0.006mgna2moo4•2h2o，0.0005mg生物素（biotin），茶多酚或茶多酚活性成分0.2g。
根据本发明优选的，所述培养基中碳源选自：甘露醇、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇、甘氨酸和/或乙酸；进一步优选的，所述培养基中碳源选自：甘露醇和/或甘油；最优的，所述培养基中碳源为甘露醇。
根据本发明优选的，所述硅藻选自小环藻属（cyclotella）、菱形藻属（nitzschia）、舟形藻属（navicula）、筒柱藻属（cylindrotheca）或褐指藻属（phaeodactylum）；进一步优选的，所述褐指藻属（phaeodactylum）为三角褐指藻，小环藻属（cyclotella）为小环藻。
根据本发明优选的，上述应用，步骤如下：
（1）将硅藻培养至对数生长期，制得种子液；
（2）将步骤（1）制得的种子液按5～50%的体积比接种至上述培养基中，在温度20～30℃、50～300μmolphotons·m−2·s−1光照条件下培养3～5天，然后维持培养体系中碳源浓度为1～20g/l，继续培养4～8天，制得含有多不饱和脂肪酸和岩藻黄质的发酵液。
进一步优选的，所述步骤（2）中，培养条件为：温度23～25℃、光照条件80μmolphotons·m−2·s−1；更优的，光照条件的光周期为16h光照、8h黑暗；进一步优选的，所述步骤（2）中，维持碳源浓度为2g/l；进一步优选的，所述步骤（2）中，维持nano3浓度为0.1～10g/l；更优的，所述步骤（2）中，维持nano3浓度为1g/l。
经检测，采用本发明所述的方法兼养培养三角褐指藻，培养12天所得的三角褐指藻藻粉干重>2.5g/l，岩藻黄质含量>16mg/g，多不饱和脂肪酸含量>125mg/g。单位体积培养体系内岩藻黄质相对最大产率>3.33mg/l/天；多不饱和脂肪酸相对最大产率>26mg/l/天。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明首次采用甘露醇做为兼养碳源，甘露醇是海洋环境中的主要碳水化合物之一，在海洋中分布广泛，硅藻作为海洋微藻，能够适应甘露醇的渗透压力，并具有潜在的代谢途径来利用甘露醇，通过实验发现，甘露醇较其他碳源能够有效提高三角褐指藻的生长速度和产量（提高了80%），并且兼养培养在光合系统色素合成水平上较异养培养有更好的合成效率；
2.本发明使用甘露醇作为兼养碳源，在放大培养过程中，由于甘露醇并不是一个广泛被微生物利用的有机碳源，因此，使用该碳源能够较有效的避免环境中杂菌的污染，使得在短期的兼养培养周期中，不会因为菌的污染而造成培养过程的失败；
3.本发明首次使用茶多酚作为生物活性物质培养硅藻，茶多酚能够有效的促进碳源的吸收和利用，经实际检测，对三角褐指藻生物量可以提高108%，岩藻黄质含量提高96%，epa含量提高122%；
4.本发明在使用茶多酚作为生物活性物质培养三角褐指藻的过程中，还发现添加茶多酚的培养体系具有很好地环境抗逆效果。
附图说明
图1.不同浓度甘露醇条件下三角褐指藻的生长曲线；
图中：ct为对照组不添加甘露醇，其他分别为添加浓度为0.5、1、2、4、10和15g/l的甘露醇；
图2.不同茶多酚条件下的三角褐指藻生长曲线；
图中：ct为对照不添加茶多酚的情况，其他分别为添加浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0g/l的茶多酚；
图3.是三角褐指藻在兼养培养条件下的岩藻黄质的含量变化，tp为茶多酚（teapolyphenols）；
图4.是三角褐指藻在兼养培养条件下的epa的产量柱状图，tp为茶多酚（teapolyphenols）；
图5.培养2天后的甘露醇的利用情况的柱状图，tp为茶多酚（teapolyphenols）；
图6.在培养过程中使用hplc分析茶多酚主要成分的利用情况曲线图；
图中：1、egc，表没食子酸儿茶素；2、右旋儿茶素(+)-catechin；3、egcg，表没食子儿茶素没食子酸酯；4、ec，表儿茶素；5、ecg，表儿茶素没食子酸酯；
图7a.甘油和甘露醇分别作为碳源培养三角褐指藻，在茶多酚的添加条件下三角褐指藻的生长曲线，tp为茶多酚（teapolyphenols）；
图7b.甘油和甘露醇分别作为碳源培养三角褐指藻，在茶多酚的添加条件下岩藻黄质的积累量，tp为茶多酚（teapolyphenols）。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
三角褐指藻（phaeodactylumtricornutum），购自中国海洋大学微藻种质库，编号macc/b228；
小环藻（cyclotellacryptica），购自美国ncma藻种库，编号：ccmp333。
其他原料来源
茶多酚购自山东西唐生物科技有限公司，普通市售产品；
甘露醇购自山东西唐生物科技有限公司，普通市售产品；
海水盐为购自青岛海之盐水族科技有限公司的蓝色珍品bluetreasure海盐，普通市售产品。
检测方法
1.岩藻黄质的测定：
将三角褐指藻藻细胞在4000×g速度下离心收集，用蒸馏水洗一遍，再次离心并收集藻细胞。将藻细胞重悬在乙醇中进行色素的提取（乙醇:藻液体积=1:1；v/v），45℃孵育2小时，每半小时震荡一次，最后，通过高速离心将提取的色素与藻渣分离。
提取出的色素中岩藻黄质含量的测定使用日立高效液相色谱仪检测系统，选择反相安捷伦c18色谱柱（2.7μm，100×4.6mm）。检测波长为445nm，流动相流速为1ml/min，进样量：5μl。流动相为乙腈和水进行梯度洗脱。乙腈比例在8min内由80%升至100%,维持这个比例洗脱3min后,将乙腈比例在5min内线性降至80%，然后再将乙腈浓度升至100%并维持15分钟。
2.epa的测定
将三角褐指藻藻细胞在4000×g速度下离心收集5-20ml，弃上清。加入6ml氯仿-甲醇（4ml和2ml），随后加入2mlkcl（0.9%）充分震荡。震荡后5000g离心5min分离脂质与藻渣。将下层清液转移到一个新的预先称重的小玻璃管中，用氮吹仪吹干后得到藻油随即称量记录。
将吹干后的藻油，加入1.5ml正己烷和4.5ml2%h2so4（溶于甲醇），85℃甲酯化反应3小时，冷却后加0.9%kcl溶液2ml，充分震荡。震荡后静置5分钟，取上层有机相于离心管中备用。若epa浓度低，可以用旋蒸仪浓缩。最后取200μl用于气相色谱（gc）分析。
利用安捷伦7890a气相色谱法分析样品中的脂肪酸甲酯组成，色谱柱为hp-5（30m×320µm×0.25µm）。气相色谱分析程序如下：进样口温度：250℃，进样体积：1μl；载气使用高纯度氮气；升温程序设置：120℃维持5min，然后以3.5℃/min升至240℃，保持10min。
3.甘露醇的测定
将三角褐指藻培养基在12000×g速度下离心，收集上清培养液，根据样品浓度稀释，使用安捷伦高效液相色谱仪示差检测器检测系统，选择bio-radaminexhpx-87h色谱柱(300mm×7.8mm)，进样量为10μl，柱温箱55℃，流动相流速为5mol/lh2so4，流速为0.5ml/min，等强度洗脱30分钟。
4.茶多酚的测定
将三角褐指藻培养基在12000×g速度下离心，收集上清培养液，根据样品浓度稀释，使用日立高效液相色谱仪检测系统，选择反相安捷伦c18色谱柱(2.7μm，100×4.6mm)。检测波长为280nm，进样量为10μl，流动相为甲醇:水=24:76，流动相流速为1ml/min，等强度洗脱30分钟。
实施例1甘露醇浓度实验
兼养培养三角褐指藻生产多不饱和脂肪酸和岩藻黄质的方法，步骤如下：
（1）将三角褐指藻培养至对数生长期（温度24℃、80μmolphotons·m−2·s−1光照条件下培养3天），制得种子液；
（2）将步骤（1）制得的种子液按5～50%的体积比接种至培养基中，在温度23～25℃、100μmolphotons·m−2·s−1光照条件下培养10天，光周期为16h光照、8h黑暗；
所述步骤（2）中的培养基，分别配制碳源为甘露醇的浓度为0.5、1、2、4、10和15g/l的培养基，以不加甘露醇为对照，上述培养基其他成分每升含量如下：
1gnano3，30g海水盐，4.37mgna2edta，3.65mgfecl3•6h2o，6.7mgnah2po4•12h2o，30mgna2sio3•7h2o，0.01mgcuso4•5h2o，0.022mgmgso4•7h2o，0.01mgcocl2•6h2o，0.18mgmncl2•4h2o，0.006mgna2moo4•2h2o，0.0005mg生物素（biotin）；
经检测，结果如图1所示：三角褐指藻在不同甘露醇浓度下的最大生物量呈现先上升后下降的趋势。甘露醇浓度在1～10g/l的范围内，最大生物量均超过对照，但各组之间无显著差异（p>0.05）。甘露醇浓度为15g/l时，抑制了三角褐指藻的生长。根据经济适用的原则，选取2g/l甘露醇浓度作为最佳的培养浓度。
实施例2茶多酚浓度实验
兼养培养三角褐指藻生产多不饱和脂肪酸和岩藻黄质的方法，步骤如下：
（1）将三角褐指藻培养至对数生长期（温度24℃、80μmolphotons·m−2·s−1光照条件下培养3天），制得种子液；
（2）将步骤（1）制得的种子液按5～50%的体积比接种至培养基中，在温度23～25℃、100μmol·photons·m−2·s−1光照条件下培养8天，光周期为16h光照、8h黑暗；
所述步骤（2）中的培养基，分别配制含有茶多酚浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0g/l的培养基，以不加茶多酚为对照，上述培养基其他成分每升含量如下：
2g甘露醇，1gnano3，30g海水盐，4.37mgna2edta，3.65mgfecl3•6h2o，6.7mgnah2po4•12h2o，30mgna2sio3•7h2o，0.01mgcuso4•5h2o，0.022mgmgso4•7h2o，0.01mgcocl2•6h2o，0.18mgmncl2•4h2o，0.006mgna2moo4•2h2o，0.0005mg生物素（biotin）；
经检测，结果如图2所示：三角褐指藻在甘露醇浓度为2g/l的条件下，最大生物量为添加0.2g/l茶多酚时；但是茶多酚浓度在0.1-2g/l的范围内，生长速率均超过对照。茶多酚浓度为5g/l时，抑制了三角褐指藻的生长。
实施例3
如实施例1所述的方法，不同之处在于，培养基成分每升含量如下：
2g甘露醇，0.2g/l茶多酚，10gnano3，10g海水盐，10mgna2edta，1mgfecl3•6h2o，12mgnah2po4•12h2o，10mgna2sio3•7h2o，0.1mgcuso4•5h2o，0.002mgmgso4•7h2o，0.1mgcocl2•6h2o，0.02mgmncl2•4h2o，0.01mgna2moo4•2h2o，0.0001mg生物素。
实施例4
如实施例1所述的方法，不同之处在于，培养基成分每升含量如下：
2g甘露醇，0.2g/l茶多酚，0.1gnano3，40g海水盐，2mgna2edta，9mgfecl3•6h2o，2mgnah2po4•12h2o，60mgna2sio3•7h2o，0.001mgcuso4•5h2o，0.2mgmgso4•7h2o，0.001cocl2•6h2o，2mgmncl2•4h2o，0.001mgna2moo4•2h2o，0.01mg生物素。
经检测，在实施例3、4的培养基培养下，细胞仍然能够生长，但最优条件为实施例2的培养基条件。
实施例5
如实施例1所述的方法，不同之处在于，采用其他硅藻门微藻（小环藻，cyclotellacryptica，购自美国ncma藻种库，藻种编号：ccmp333），培养基成分每升含量如下：
2g甘露醇，0.2g/l茶多酚，1gnano3，30g海水盐，4.37mgna2edta，3.65mgfecl3•6h2o，6.7mgnah2po4•12h2o，30mgna2sio3•7h2o，0.01mgcuso4•5h2o，0.022mgmgso4•7h2o，0.01mgcocl2•6h2o，0.18mgmncl2•4h2o，0.006mgna2moo4•2h2o，0.0005mg生物素（biotin）；
经检测，近源硅藻门微藻使用该培养基同光合自养培养相比，能够显著提高生物量。
实施例6
如实施例1所述的方法，不同之处在于，使用不同组分进行比较：同时添加甘露醇和茶多酚的最优条件下进行培养（含2g/l甘露醇和0.2g/l茶多酚）；仅添加甘露醇的最优条件下进行培养（含2g/l甘露醇）；光合自养条件下进行培养。分别检测各个实验组的最终岩藻黄质含量和epa含量。通过液相色谱检测甘露醇在培养2天后的残留情况；通过高效液相色谱检测茶多酚在培养2天后的残留情况。其他培养基成分每升含量如下：
1gnano3，30g海水盐，4.37mgna2edta，3.65mgfecl3•6h2o，6.7mgnah2po4•12h2o，30mgna2sio3•7h2o，0.01mgcuso4•5h2o，0.022mgmgso4•7h2o，0.01mgcocl2•6h2o，0.18mgmncl2•4h2o，0.006mgna2moo4•2h2o，0.0005mg生物素（biotin）；
经检测，通过添加甘露醇，实验组的岩藻黄质和epa含量都有所提高，并且进一步添加活性添加剂茶多酚的情况下，岩藻黄质（图3）和epa（图4）的含量都能够进一步提高，因此，该方案能够有效的促进三角褐指藻的兼养效率，达到提高岩藻黄质和多不饱和脂肪酸产量的目的。
经检测，甘露醇在培养两天后具有不同的消耗水平，存在茶多酚的实验组具有更快的甘露醇使用效率，说明茶多酚能够促进甘露醇的利用，达到促进生长的目的（图5）。
经检测，茶多酚在培养两天后，儿茶素类化合物（主要包括儿茶素（ec）、没食子儿茶素（egc）、儿茶素没食子酸酯（ecg）和没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）等物质）逐步减少和消耗（图6），说明茶多酚的主要活性成分参与了细胞的生理活动，或者在培养过程中存在降解过程。依据此结果，需要在培养过程中半连续补充茶多酚进行培养，以达到最快生长的目的。
实施例7
如实施例2所述的方法，不同之处在于同时配制碳源为2g/l甘油的实验组，以光合自养培养组为对照。
结果显示，使用甘油作为碳源，在添加茶多酚的情况下也具有较好的兼养效果，同光合自养培养相比，具有较快的生长速率，但是稍低于以甘露醇为碳源的情况（图7a）。说明在添加茶多酚的情况下，能促进三角褐指藻的兼养效率，多种有机碳源可以用于三角褐指藻的兼养培养。在具有较高的生长速率的同时，兼养培养组的岩藻黄质含量也显著提高（图7b）。
实施例8
如实施例1所述的方法，不同之处在于在培养过程中半连续的添加有机碳源、茶多酚和无机氮源至初始培养浓度（有机碳源：2g/l；茶多酚：0.2g/l；nano3：1g/l）。
结果显示，半连续添加有利于提高生长速率，在生产中可结合生产成本进行适当的半连续添加，以达到最佳生产效率。
实施例9
如实施例2所述的方法，不同之处在于，将茶多酚替换为没食子儿茶素没食子酸酯（egcg），浓度为0.2g/l，用于比较茶多酚和茶多酚的主要化合物在培养过程中的作用。
结果显示，只添加egcg会在一定程度上提高兼养效率，可以作为兼养培养的复配活性添加剂。但是综合培养成本和效率，添加茶多酚作为复配活性添加剂为最优选择。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例及实施过程中的优化建议而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
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