本发明属于肿瘤研究领域，本发明涉及一种条件性诱导敲除chd1l基因的chd1l-egfp肝癌细胞系及其构建方法。
背景技术：
chd1l(chromodomainhelicase/atpasednabindingprotein1-likegene)基因位于染色体1q21区，含有保守的snf2-n功能域、解旋酶功能域及macro功能域，属swi2/snf2相关atp酶超家族，与染色质解链及dna修复等过程有关。该基因除了在肝癌中特异性高表达外，在多种实体瘤中有异常扩增和高表达，并与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关。在肝细胞癌(hcc)中，用sirna干扰技术使chd1l表达降低后在其治疗中显示出巨大的治疗潜能，特别是显示出对5-fu化疗的敏感性，成为治疗肝癌的一个潜在治疗靶点。
crispr-cas9基因编辑技术已成为功能基因组学研究的有力工具。将crispr-cas9系统与四环素诱导表达系统(tet-on系统)相结合形成tet-on-crispr-cas9系统，可以实现对动物和细胞模型进行基因的时空编辑，进而更好的研究基因功能。该系统不仅能避免敲除基因后细胞系由于发生凋亡而无法后续研究，且诱导敲除前后的两组细胞(对照组和实验组)相比数据准确性好。
tet-on系统因具有极为严密的开/关调控功能，在制作转基因动物方面得到了广泛的应用。该系统可以在体外对转入的外源基因进行时间上和组织特异性的调控表达。在动物的胚胎期，不需要目的基因表达时，添加dox会对胎儿的生长和发育带来负面影响。tet-on系统在不添加诱导剂的情况下处于关闭状态，避免了添加诱导剂对胎儿发育的影响。由于tet-on系统对基因的表达进行时间和组织特异性的精确调控，已被越来越多的科学家用做制备转基因细胞系或动物的工具。该系统在细胞模型上研究某些关键基因功能时，可条件性的掌控基因表达，防止基因敲除后细胞出现凋亡，对后期在体研究基因功能具有重要的意义。
crispr-cas9系统最早在细菌基因组上发现，随后crispr-cas9系统被广泛应用于各种研究模型上，逐渐成为功能基因组学研究的有力工具。将crispr-cas9系统与tet-on诱导表达系统相结合，实现了crispr-cas9对多种细胞模型和动物模型进行基因的时空敲除、敲入及修饰作用，可按研究者意愿及需求为动物模型建立及探索研究全基因组基因功能分析提供技术支持。
技术实现要素：
基于上述该系统的特点，本发明提供了一种条件性诱导敲除chd1l基因的chd1l-egfp肝癌细胞系及其构建方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种条件性诱导敲除过表达chd1l基因的肝癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：
1)、通过慢病毒介导的转基因方法将cas9基因转入过表达chd1l-egfp的肝癌细胞系中，随后添加puro抗生素进行筛选，2周后获得条件性诱导表达cas9的过表达chd1l-egfp的肝癌细胞系；
2)、构建表达红色荧光蛋白的plvx-mcherry-hu6-sgrna载体
通过t2a连接在灭稻菌素blast基因后面构建多顺反子表达载体，以seqidno:1和seqidno:2为引物，pcr扩增得到blast-t2a片段，以seqidno:3和seqidno:4为引物，pcr扩增得到t2a-mcherry片段，然后以seqidno:1和seqidno:4为引物，blast-t2a片段和t2a-mcherry片段为模板，pcr扩增获得blast-t2a-mcherry，再将blast-t2a-mcherry通过spei和ecori两个酶切位点连入去除blast序列的plvx-hu6-sgrna载体骨架中，获得plvx-mcherry-hu6-sgrna载体；
3)、构建plvx-mcherry-hu6-chd1l-sgrna慢病毒载体
以seqidno:10和seqidno:11为引物，pcr扩增得到hu6，以seqidno:12和引物seqidno:13为引物，pcr扩增得到chd1l-sgrna片段，然后以hu6和chd1l-sgrna片段为模板，以seqidno:10和seqidno:13为引物，pcr扩增获得hu6-chd1l-sgrna片段，再通过xhoi和nhei两个酶切位点将hu6-chd1l-sgrna片段连入到步骤2)获得的plvx-mcherry-hu6-sgrna载体中，得到plvx-mcherry-hu6-chd1l-sgrna慢病毒载体；
4)、通过慢病毒介导的转基因方法将plvx-mcherry-hu6-chd1l-sgrna载体转入到步骤1)所述条件性诱导表达cas9的过表达chd1l-egfp的肝癌细胞系中，然后添加puro和blast两种抗生素进行筛选，最终获得条件性敲除chd1l基因的chd1l-egfp肝癌细胞系。
在其中一些实施例中，步骤2)中所述pcr的反应体系均为：2×primestarbuffer/premix25μl；上游引物f1.5μl；下游引物r1.5μl；模板2μl和ddh2o20μl。
在其中一些实施例中，步骤2)中所述反应程序为：预变性95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃40s，循环35个；最后总延伸72℃7min。
在其中一些实施例中，步骤3)中所述pcr的反应体系均为：2×primestarbuffer/premix25μl；上游引物f1.5μl；下游引物r1.5μl；模板2μl和ddh2o20μl。
在其中一些实施例中，步骤3)中所述反应程序为：预变性95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃40s，循环35个；最后总延伸72℃7min。
在其中一些实施例中，步骤4)中所述puro的浓度为1±0.5μg/ml，所述blast的浓度为3±0.5μg/ml。
本发明还提供了利用上述构建方法得到的条件性诱导敲除chd1l基因的chd1l-egfp肝癌细胞系。
在上述构建好的chd1l-egfp肝癌细胞系(7703)基础上，通过利用tet-on-crispr-cas9技术构建过表达cas9的条件性敲除细胞系，该敲除细胞系在强力霉素(dox)诱导前chd1l基因高表达，诱导后chd1l基因敲除。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明的细胞系是一种过表达和敲除兼备的细胞系，添加药物诱导前为chd1l过表达的细胞系；而当添加dox药物诱导后，7703肝癌细胞系则为chd1l-ko的细胞系。前期研究结果显示，当chd1l-ko后，细胞出现凋亡，提示chd1l在肝癌细胞增殖中发挥重要作用，该发明解决了chd1l敲除后因细胞凋亡而无法继续深入研究的就、困境。通过添加药物开关，在适当的条件下诱导敲除，可开展敲除后凋亡相关机制研究，有望被临床上作为一个肿瘤治疗的靶点；
2、本发明利用基因编辑技术和tet-on技术等，建立一株同时满足chd1l过表达和敲除的细胞系，该细胞系由药物开关决定chd1l是否表达；同时，该细胞系的建立能有效减少细胞体外操作过程中由于表观遗传学变化造成的实验误差，此方法操作简单、对照性好；其次，该细胞系的成功构建也可有效减少细胞株培养数目，简化科研工作，节省实验材料，是基因功能研究的理想工具。本发明不仅为研究chd1l基因在肿瘤中的作用机制提供重要的实验材料，且对于功能基因组学研究提供较好的参考作用。
附图说明
图1为本发明实施例1中条件性诱导敲除过表达的chd1l基因的肝癌细胞系的建立方法的流程图；
图2为本发明实施例1中过表达chd1l基因的7703肝癌细胞系的结果，其中a和b为白光和荧光的筛选结果；c为western-blotting的检测结果；
图3平板克隆分析过表达chd1l基因的肝癌细胞系克隆能力和致瘤能力的情况，结果显示过表达chd1l基因的肝癌细胞系克隆能力明显增强。a为过表达chd1l基因的肝癌细胞系，b为对照组。
图4为本发明实施例1中条件性诱导cas9的7703细胞系的建立结果，其中，a为筛选获得的稳转cas9的7703细胞团；b为诱导前后检测细胞中cas9的表达情况；
图5为本发明实施例1中扩增的blast-t2a片段(713bp)、t2a-mcherry片段(764bp)、和blast-t2a-mcherry片段(1457bp)的电泳图；
图6为本发明实施例1中chd1l-sgrna的设计与其位置；
图7为本发明实施例1中chd1l-sgrna靶点筛选结果图，其中，a：扩取部分hu6启动子序列(177bp)；b：扩增剩下hu6、chd1l靶序列和sgrna(85bp)片段共(377bp)；c：利用重叠pcr，以hu6和sgrna序列为模板获取hu6-chd1l-sgrna片段(490bp)；
图8为本发明为条件性诱导chd1l-ko7703肝癌细胞系的构建结果图，其中，a：筛选获得的稳转mcherry-hu6-chd1l-sgrna的7703-cas9细胞团；b：7703肝癌稳转细胞系的传代与增殖；c：在添加强力霉素(dox)诱导后，7703肝癌稳转细胞数量逐渐减少；d：不添加dox诱导培养的7703肝癌稳转细胞系；e：测序分析添加与不添加dox，基因组中chd1l发生切割的情况；f、western-blotting检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来对本发明作进一步说明。以下实施例中的实验操作，如无特殊说明，均为本领域常规技术操作。实验用品如无特殊说明，均来源于市售。
实施例1条件性诱导敲除chd1l基因的chd1l-egfp肝癌细胞系的建立方法
请参阅图1，为本实施例一种条件性诱导敲除chd1l基因的chd1l-egfp肝癌细胞系的建立方法，包括以下步骤：
1)、建立过表达chd1l基因的chd1l-egfp的7703肝癌细胞系
根据chd1l基因序列(nm_004284)，构建cmv启动携带egfp的表达载体，通过转基因和药物筛选最终建立起表达egfp的过表达chd1l的chd1l-egfp的7703肝癌细胞系(如图2)，经检测分析，该7703肝癌细胞系具有如下特征：表达egfp荧光、致瘤性增加能力增加(如图3)。
2)、条件性诱导表达cas9的chd1l-7703肝癌细胞系的构建
通过慢病毒介导转基因方法将cas9基因转入已建立的chd1l过表达的chd1l-egfp的7703肝癌细胞系中，通过添加1μg/mlpuro抗生素(sigma)进行筛选，最终获得条件性诱导表达cas9的chd1l-egfp的7703肝癌细胞系(图3a和3b)；在添加强力霉素(dox)时，细胞中cas9蛋白开始表达，不添加不表达(如图4)。
3)、构建表达红色荧光蛋白的plvx-mcherry-hu6-sgrna载体
由于7703肝癌细胞过表达chd1l时，引入了egfp荧光，因此在
构建chd1l-ko(敲除chd1l基因)时，sgrna载体中要改用其他荧光蛋白，因此选用了红色的mcherry基因，首先通过sgrna-blast-1f：aagccgcacgtctcactagtaccctcgcagacggac(seqidno:1)和sgrna-t2a-1r：cgacgtcaccgcatgttagcagacttcctctgccctcgccctcccacacataaccagag(seqidno:2)扩取blast-t2a片段(该步骤的模板是plvx-hu6-sgrna，购自addgene)，以sgrna-t2a-mcherryf：gctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggcccagtgagcaagggcgaggaggata(seqidno:3)和sgrna-t2a-mcherryr：tcaagatctagaattcttacttgtacagctcgtcc(seqidno:4)扩取t2a-mcherry片段(该步骤的模板是plvx-hu6-sgrna，购自addgene)，然后通过sgrna-blast-1f(seqidno:1)和sgrna-t2a-mcherry2r(seqidno:4)为引物、blast-t2a片段和t2a-mcherry片段为模板，通过重叠pcr获得blast-t2a-mcherry片段(如图5a～c)，然后将blast-t2a-mcherry通过(spei-ecori)两个酶切位点连入去除blast序列的plvx-hu6-sgrna载体(addgene50662)骨架中，成功获得plvx-mcherry-hu6-sgrna载体。
以上pcr的反应体系(50μl)均为：2×primestarbuffer/premix25μl；上游引物f1.5μl；下游引物r1.5μl；模板2μl和ddh2o20μl。
pcr的反应程序均为：预变性95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃40s，循环35个；最后总延伸72℃7min。
其中不同的是引物和模板。
4)、构建plvx-mcherry-hu6-chd1l-sgrna慢病毒载体
根据sgrna靶序列预测网站http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetfinder/index.php)和参考chd1l基因序列(nm_004284)，共预测5个chd1l基因的sgrna靶序列(表1和图6)。
表1chd1l-sgrna靶点预测表
备注：atg：起始密码子序列；正向：正义链序列；反向：指的是反义链的序列。
将上述预测的靶序列，选取评分网站预测评分最高的seqidno:5进行构建到plvx-mcherry-hu6-sgrna载体中，采用表2的引物表，通过重叠pcr方法扩取hu6-chd1l-sgrna片段。
表2sgrna载体构建引物表
备注：f：上游引物；r：下游引物；下横线的序列为靶序列。
具体步骤为：
以seqidno:10和seqidno:11为引物，以plvx-hu6-sgrna载体(addgene50662)为模板，第一次pcr扩增得到hu6(图7a)，以seqidno:12和引物seqidno:13为引物，以plvx-hu6-sgrna载体(addgene50662)为模板，第二次pcr扩增得到chd1l-sgrna片段(其中包含chd1l靶序列，扩增出来构建到载体中去，以达到靶向chd1l-ko的目的)(图7b)，然后以hu6和chd1l-sgrna片段为模板，以seqidno:10和seqidno:13为引物，第三次pcr扩增获得hu6-chd1l-sgrna片段(图7c)，再通过xhoi和nhei两个酶切位点将hu6-chd1l-sgrna片段连入到步骤3)获得的plvx-mcherry-hu6-sgrna载体中，得到plvx-mcherry-hu6-chd1l-sgrna慢病毒载体；
以上pcr的反应体系(50μl)均为：2×primestarbuffer/premix25μl；上游引物f1.5μl；下游引物r1.5μl；模板2μl和ddh2o20μl。
pcr的反应程序均为：预变性95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃40s，循环35个；最后总延伸72℃7min。
其中不同的是引物和模板。
5)、条件性诱导chd1l-ko的chd1l-egfp7703肝癌细胞系的构建
通过慢病毒介导的转基因方法将plvx-mcherry-hu6-chd1l-sgrna转入到条件性诱导表达cas9和过表达chd1l-egfp的7703肝癌细胞系中，通过添加1μg/mlpuro和3μg/mlblast两种抗生素进行筛选，最终获得稳转mcherry-hu6-chd1l-sgrna(图8a和b)；整合的7703稳转肝癌细胞系(即条件性诱导敲除chd1l基因的chd1l-egfp肝癌细胞系)；该细胞系具有红色荧光标记(mcherry)(如图8a和b)；在添加强力霉素(dox)诱导时，试验组细胞在培养1w时，细胞数量逐渐减少，细胞形态变形(图8c)；而对照组不添加dox时，细胞生长快速，折光性强(图8d)；通过提取细胞基因组，进行chd1l-ko测序分析，测序结果显示添加dox试验组基因组中的chd1l基因发生了切割；而对照组未发生切割(图8e)，蛋白变化相一致(如图8f)。
试验例1获得的条件性诱导敲除chd1l基因的chd1l-egfp7703肝癌细胞系的western-bloting分析
1、western-blot免疫印迹测定所需试剂
牛血清白蛋白、40％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液(40％acr/bis)、pmsf、十二烷基硫酸钠(sds)、过硫酸(ap)、三羟甲基氨基甲烷(tris)、甘氨酸(购自上海生工生物公司)、蛋白酶抑制剂cocktail、temed、二硫苏糖醇(购自sigma公司)、bca蛋白定量试剂盒、ecl化学发光液(购自美国thermofisherscientific公司)、pvdf膜(购自美国bio-rad公司)、ripa裂解液(北京鼎国公司)。
2、western-blot免疫印迹测定所需溶液配制
1)1.5mol/ltris.hcl(ph＝8.8)溶液：tris181.72g溶解于800ml超纯水，调ph至8.8后定容至1000ml，高压灭菌后室温保存；
2)0.5mol/ltris.hcl(ph＝6.8)溶液：tris60.56g溶解于800ml超纯水，ph至6.8后定容至1000ml，高压灭菌后室温保存；
3)10％过硫酸胺(ap)：0.1g过硫酸溶解于1ml超纯水，现用现配；
4)10％sds溶液：称取10gsds至100ml超纯水中，55℃溶解后室温保存；
5)10mmol/lpmsf：pmsf0.174g溶解于100ml异丙醇，分装，-20℃保存；
6)5×sds上样缓冲液：0.5mol/ltris.hcl(ph＝6.8)2.5ml、二硫苏糖醇0.39g、sds0.5g、溴酚蓝0.025g、甘油2.5ml，分装，4℃保存；
7)电泳缓冲液：tris3.03g、甘氨酸18.77g、sds1g溶解于1000ml超纯水中，室温保存；
8)转移缓冲液：tris5.8g、甘氨酸2.9g、sds0.37g、甲醇200ml加超纯水定容至1000ml，溶解后室温保存；
9)1mol/ltris.hcl(ph＝8.0)溶液：tris121.14g加入到800ml超纯水中，调ph至8.0，定容至1000ml，室温保存；
10)tbst缓冲液：1mol/ltris.hcl(ph＝8.0)20ml、nacl8.8g加入800ml超纯水，溶解后加入0.5mltween20，定容至1000ml，混匀后室温保存；
11)15％分离胶：超纯水1.725ml、40％acr/bic1.875ml、1.5mol/ltris.hcl(ph＝8.8)1.3ml、10％sds0.05ml、10％ap0.05ml、tmemd0.002ml。5％浓缩胶：超纯水1.48ml、40％acr/bis0.25ml、0.5mol/ltris.hcl(ph＝6.8)0.5ml、10％sds0.02ml、10％ap0.02ml、tmemd0.002ml；
3、western-blotting免疫印迹测定步骤
1)细胞蛋白提取：收集实施例1的条件性诱导敲除chd1l基因的7703肝癌细胞，用pbs洗两遍，然后加入ripa裂解液(含110μl/mlpmsf和5μl/ml蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30min，每隔5min振荡次，12000rpm、4℃离心并收集上清；
2)蛋白浓度测定：采用bca蛋白定量试剂盒进行测定，详细操作参照说明书进行。根据测得蛋白浓度，用ripa裂解液将样品蛋白浓度调成一致，分装后于-80℃冰箱保存；
3)sds-page蛋白电泳：配制15％分离胶和5％浓缩胶。蛋白上样前进行sds变性处理，裂解样品以4：1加入5×sds上样缓冲液于95℃恒温振荡5min，上样量为20μg；电泳条件为：恒压80v40min、120v1h；
4)转膜：恒流250ma-2.5h，冰上湿转；
5)封闭：3％bsa溶液中室温封闭30min；
6)一抗(兔源actb和兔源chd1l多克隆抗体)孵育抗体用封闭液稀释，4℃过夜孵育后，用1×tbst洗4×5min/次。
7)二抗(羊抗兔的igg)孵育：将对应的igg用封闭液以1：5000稀释，室温孵育1h，用1×tbst洗4×5min/次。
8)显影和灰度分析：采用ecl化学发光试剂于化学发光凝胶成像系统中进行成像显影，并采用imagelab(美国bio-rad公司)软件进行图像编辑和quantityone(美国bio-rad公司)软件进行灰度分析。试验例2获得的过表达chd1l-egfp的肝癌细胞系的致瘤性能力分析
平板克隆形成实验
1.取对数生长期过表达chd1l的7703肝癌细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞悬液，将细胞悬液稀释，每组细胞以每孔500个细胞的密度分别接种六孔板中，37℃预温培养液，每孔加2ml培养基，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃5％co2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周，每3-4d换液。
2.当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用pbs小心浸洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞，固定15min。然后去固定液，加适量gimsa应用染色液染10～30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
3.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％。
结果如图3所示，过表达chd1l明显增加7703肝癌细胞的克隆数量，显示chd1l可促进细胞增殖。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>广州医科大学
<120>一种条件性诱导敲除过表达chd1l基因的肝癌细胞系及其构建方法
<130>13
<160>13
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>36
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
aagccgcacgtctcactagtaccctcgcagacggac36
<210>2
<211>59
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<210>3
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<210>4
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<400>4
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<210>5
<211>20
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<400>5
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