本发明属于酶分离纯化技术领域，涉及一种桑叶中diels-alderase酶的分离纯化方法及其用途。
背景技术：
diels-alder反应是一种由共轭双烯和亲双烯体通过单环周的过渡态形成环己烯的一种[4+2]环加成反应。diels-alder型加合物是具有环己烯结构的复杂化合物，diels-alder型加合物在自然界中大量存在，但其生物合成途径鲜被阐明。
桑科植物中含有大量的diels-alder加合物，如kuwanong,kuwanonh,kuwnonj，chalcomoracin等。其中chalcomoracin被证实具有抗肿瘤、抗炎症等多种药理活性(zhangetal.,“threenewcytotoxicdiels-alder-typeadductsfrommorusaustralis”.chemistry&biodiversity,2007,4(7):1533.)。但是天然桑叶中chalcomoracin含量很低，提取工艺复杂且效率低，又因其复杂的分子结构，化学合成难度大。与此同时，已有学者证明桑叶中存在的chalcomaricin是由diels-alderase酶催化合成(nomuraetal.,“chemistryandbiosynthesisofisoprenylatedflavonoidsfromjapanesemulberrytree”,p.jpn.acad.b-phys.,2009,85(9),391-408.)，且紫外诱导桑叶中diels-alder型加合物如chalcomoracin，其含量显著提高(gu,xida,etal."uv-binducedchangesinthesecondarymetabolitesofmorusalbal.leaves."molecules，2010(15):2980-93)。一方面，酶催化反应的高效和高选择性决定了diels-alderase酶可以用于大规模生物合成chalcomoracin，对于实际生产具有重要意义；另一方面，分离纯化出diels-alderase酶，充分研究其酶学性质，催化机制，具有重要的价值。目前，国内外对于微生物中的diels-alderase酶纯化已有报道，但是仅限于催化分子内diels-alder环加成，植物中的diels-alderase酶分离纯化尚未见报道。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提出一种从紫外诱导桑叶中分离纯化diels-alderase酶(d-a合酶)的方法。
为了实现上述发明目的，本发明所采用的具体技术方案如下：
紫外诱导桑叶中diels-alderase酶的分离纯化方法，其包括如下步骤：
步骤1：取经过紫外光照射后的诱导桑叶，以1:5～1:10g/ml的比例加入ph为6.5～8.0的pbs缓冲液，匀浆后于3～5℃条件下浸提1.5～2.5h，离心得到上清液；
步骤2：向步骤1得到的上清液中加入硫酸铵，然后离心收集上清液，向上清液中继续加入硫酸铵，再次离心获得沉淀，将沉淀加入含0.7～0.9m硫酸铵的pbs缓冲液复溶；所述pbs缓冲液复溶ph为7.0～8.0的浓度为50～100mm；
步骤3：将步骤2复溶得到的溶液经过疏水性凝胶层析，收集具有diels-alderase酶活性的组分并合并；
步骤4：将步骤3中合并后的活性组分经过阴离子离子交换层析，再次收集具有diels-alderase酶活性的组分并合并；
步骤:5：将步骤4中合并后的活性组分经过阳离子离子交换层析，再次收集具有diels-alderase酶活性的组分并合并；
步骤:6：将步骤5中合并后的活性组分进行凝胶过滤层析，最终获得diels-alderase酶。
作为优选，步骤1中，所述的pbs缓冲液浓度为100mm，离心条件为11000～13000×g离心15～25min。
作为优选，步骤1中，所述的诱导桑叶的制备方法具体为：将新鲜采摘的桑叶经紫外光照射，紫外光为uva波段、uvb波段、uvc波段的一种或多种组合，紫外光照射强度为10～1000w，紫外光照时间为0.05～3h，照射过程中保持湿度在10％～100％；所述的新鲜桑叶优选为4～10月份采摘的新鲜桑叶。制备方法具体可参照申请号为201710252959.8的发明专利。
作为优选，步骤2中，第一次向上清液中加入硫酸铵后，需使硫酸铵的饱和度(本发明中，均以0℃下的硫酸铵饱和浓度计，下同)达到40％；继续加入硫酸铵后，需使硫酸铵的饱和度达到60％。
作为优选，步骤3具体采用如下方法：将步骤2复溶得到的样品上样到预平衡好的phenyl-hp柱上，柱的内径1.6cm，高度12cm，以ph7.5的含有0.8m硫酸铵的浓度为50mm的pbs缓冲液为buffera，以ph7.5的浓度50mm的pbs缓冲液为bufferb，阶段洗脱时，先用70％buffera和30％bufferb混合进行洗脱，再用50％buffera和50％bufferb混合进行洗脱，收集30～50％bufferb的洗脱液(注完30％bufferb混合液后再注入50％bufferb混合液得到的洗脱液)，洗脱液总体积为150～250ml，置换缓冲液至ph7.5的浓度为50mm的pbs缓冲液并浓缩至1.25ml。
作为优选，步骤4具体采用如下方法：将步骤3处理得到的样品上样到预平衡好的monoqtm5/50gl柱上，以20mm的ph8.0的tris-hcl缓冲液洗脱，以0～1mnacl梯度洗脱，洗脱总体积300～360ml，置换缓冲液至ph6.0的浓度50mm的丁二酸缓冲液并浓缩至1.5ml。
作为优选，步骤5具体采用如下方法：将步骤4处理得到的样品上样到预平衡好的sp-hp柱上，柱内径为1cm，高度为2cm，以ph6.0，浓度50mm的丁二酸缓冲液洗脱，洗脱总体积为10ml，收集流穿液，浓缩并置换缓冲液为含150mmnacl的浓度为50mm的pbs缓冲液，并浓缩至1ml。
作为优选，步骤6具体采用如下方法：将步骤5处理得到的样品上样到superdex200increase10/30gl柱上进行分离，进样量为500μl，以含有150mmnacl的浓度为50mm的pbs缓冲液洗脱，流速为0.45ml/min，2ml/管收集样品检测其活性，收集检测到有diels-alderase酶催化活性的样品，完成diels-alderase酶的分离纯化。
作为优选，diels-alderase酶催化活性的检测方法为：利用待检测样品催化底物moracinc和morachalcone反应，当检测到生成产物chalcomoracin时，表明待检测样品中具有diels-alderase酶催化活性的组分。
利用本发明的上述任一种方法可以获得凝胶电泳检测单一组分的d-a合酶，并且该酶可用于催化合成chalcomoracin。而且，本发明分离纯化得到的酶液不仅纯度高且活性保持良好。
附图说明
图1为实施例4中diels-alderase酶的活性测定液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步阐述。
实施例1：紫外诱导桑叶中diels-alderase酶的分离纯化
取紫外诱导桑叶300g，加入3l浓度为100mm的ph7.5的pbs缓冲液，匀浆后于4℃条件下浸提2h，于4℃条件下12000×g离心20min，获得上清液。在上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到40％，离心分离获得上清，在上清中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到60％，离心分离获得沉淀，加入108ml的ph7.5的含有0.8m硫酸铵的浓度为50mm的pbs缓冲液复溶。过滤后的样品上样到预平衡好的phenyl-hp柱上(柱内径1.6cm，高度12cm)，以ph7.5的含有0.8m硫酸铵的浓度为50mm的pbs缓冲液为buffera，以ph7.5的浓度为50mm的pbs缓冲液为bufferb，利用buffera和bufferb混合进行阶段洗脱，先用70％buffera和30％bufferb混合进行洗脱，再用50％buffera和50％bufferb混合进行洗脱，收集30～50％bufferb的组分，洗脱液总体积为250ml，置换缓冲液至ph7.5的浓度为50mm的pbs缓冲液并浓缩至1.25ml。将上述样品上样到预平衡好的monoqtm5/50gl柱上，以20mm的ph8.0的tris-hcl缓冲液洗脱，以0～1mnacl梯度洗脱，洗脱总体积300ml，置换缓冲液至ph6.0的50mm的丁二酸缓冲液并浓缩至1.5ml。然后上样到预平衡好的sp-hp柱上(柱内径为1cm，高度为2cm)，以ph6.0的50mm的丁二酸缓冲液10ml洗脱，置换缓冲液至含有150mmnacl的浓度为50mm的pbs缓冲液并浓缩至1ml；最后上样到superdex200increase10/30gl柱上进行分离，进样量为500μl,以含有150mmnacl的浓度为50mm的pbs缓冲液洗脱,流速为0.45ml/min,收集2ml/管检测其活性，第8管检测到有diels-alderase催化活性，与光酶诱导桑叶提取的上清酶活相比，纯化倍数为26.1倍。对获得的纯化酶进行了检验，催化底物为moracinc和morachalcone，凝胶电泳检测结果显示其条带单一；催化反应的最适ph为7.5，最适温度为30℃。
实施例2：紫外诱导桑叶中diels-alderase酶的分离纯化
取紫外诱导桑叶300g，加2.5l浓度为100mm的ph7.5的pbs缓冲液，匀浆后于3℃条件下浸提1.5h，于4℃条件下13000×g离心15min，获得上清液。在上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到40％，离心分离获得上清，在上清中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到60％，离心分离获得沉淀，加入90ml的ph7.5的含有0.8m硫酸铵的浓度为50mm的pbs缓冲液复溶，过滤后平均分装至9管中。获得的样品分9次上样到预平衡好的phenyl-hp柱上，柱内径1.6cm，高度12cm)，以ph7.5的含有0.8m硫酸铵的浓度为50mm的pbs缓冲液为buffera，以ph7.5的浓度为50mm的pbs缓冲液为bufferb，利用buffera和bufferb混合进行阶段洗脱，先用70％buffera和30％bufferb混合进行洗脱，再用50％buffera和50％bufferb混合进行洗脱，收集30～50％bufferb的组分，每次洗脱液总体积为150ml，置换缓冲液至ph7.5的浓度为50mm的pbs缓冲液并浓缩至1.25ml。将上述样品分9次上样到预平衡好的monoqtm5/50gl柱上，以20mm的ph8.0的tris-hcl缓冲液洗脱，以0～1mnacl梯度洗脱,每次洗脱总体积40ml,合并9次样品置换缓冲液至ph6.0的50mm的丁二酸缓冲液并浓缩至1.5ml。然后上样到预平衡好的sp-hp柱上(柱内径为1cm，高度为2cm)，以ph6.0的50mm的丁二酸缓冲液10ml洗脱，置换缓冲液至含有0.15mnacl的浓度为50mm的pbs缓冲液并浓缩至1ml；最后上样到superdex200increase10/30gl柱上进行分离，进样量为500μl,以含有0.15mnacl的浓度为50mm的pbs缓冲液洗脱,流速为0.45ml/min,收集2ml/管检测其活性，第8管检测到有diels-alderase催化活性，与光酶诱导桑叶提取的上清酶活相比，纯化倍数为27.5倍。对获得的纯化酶进行了检验，催化底物为moracinc和morachalcone，凝胶电泳检测结果显示其条带单一。
实施例3：紫外诱导桑叶中diels-alderase酶的分离纯化
取紫外诱导桑叶300g，加1.5l浓度为100mm的ph7.5的pbs缓冲液，匀浆后于5℃条件下浸提2.5h，于4℃条件下11000×g离心25min，获得上清液。在上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到40％，离心分离获得上清，在上清中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到40％，离心分离获得沉淀，加入99ml的ph7.5的含有0.8m硫酸铵的浓度为50mm的pbs缓冲液复溶，过滤后平均分装至9管中。获得的样品分9次上样到预平衡好的phenyl-hp柱上，柱内径1.6cm，高度12cm)，以ph7.5的含有0.8m硫酸铵的浓度为50mm的pbs缓冲液为buffera，以ph7.5的浓度为50mm的pbs缓冲液为bufferb，利用buffera和bufferb混合进行阶段洗脱，先用70％buffera和30％bufferb混合进行洗脱，再用50％buffera和50％bufferb混合进行洗脱，收集30～50％bufferb的组分，每次洗脱液总体积为150ml，置换缓冲液至ph7.5的浓度为50mm的pbs缓冲液并浓缩至1.25ml。将上述样品分9次上样到预平衡好的monoqtm5/50gl柱上，以20mm的ph8.0的tris-hcl缓冲液洗脱，以0～1mnacl梯度洗脱，每次洗脱总体积40ml，合并9次样品置换缓冲液至ph6.0的50mm的丁二酸缓冲液并浓缩至1.5ml。然后上样到预平衡好的sp-hp柱上(柱内径为1cm，高度为2cm)，以ph6.0的50mm的丁二酸缓冲液10ml洗脱，置换缓冲液至含有0.15mnacl的浓度为50mm的pbs缓冲液并浓缩至1ml；最后上样到superdex200increase10/30gl柱上进行分离，进样量为500μl,以含有0.15mnacl的浓度为50mm的pbs缓冲液洗脱,流速为0.45ml/min,收集2ml/管检测其活性，第8管检测到有diels-alderase催化活性，与光酶诱导桑叶提取的上清酶活相比，纯化倍数为25.3倍。对获得的纯化酶进行了检验，催化底物为moracinc和morachalcone，凝胶电泳检测结果显示其条带单一。
实施例4：diels-alderase酶催化moracinc和morachalcone生物合成chalcomoracin
在1.5ml的离心管中加入实施例1中获得的480μl的酶液，并加入底物moracinc和morachalcone(浓度均为25mm)各10μl，置于恒温混匀器上振荡反应3h后，加入500μl无水甲醇灭活后，室温，13000xg，离心20min，上清液用高效液相色谱检测。失活酶组为480μl的酶液加入500μl甲醇灭活后，在加入底物moracinc和morachalcone(浓度均为25mm)各10μl，置于恒温混匀器上振荡反应3h后，室温，13000xg，离心20min，上清液经高效液相色谱检测。
检测结果如图1所示，图中：较低的为失活酶反应后的液相色谱峰，较高的为diels-alderase酶活反应后的液相色谱峰，色谱峰1为moracinc，色谱峰2为morachalcone，色谱峰3为chalcomoracin。结果表明，本发明分离纯化得到的酶液不仅纯度高且活性保持良好。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。例如各分离纯化所采用的具体参数、分离柱型号可根据实际情况进行调整。每一步层析分离后，可逐管测试其diels-alderase酶活性，选择酶含量较多的部分组分合并后进行下一步层析分离。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。