一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其应用的制作方法

本发明涉及反向遗传学应用领域，具体涉及一种表达新型鸭细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒及其应用。

背景技术：

2014年以来，在我国山东、安徽、江苏等地鸭群中大面积爆发了一种以生长迟缓、鸭(上下)喙变短、舌头外露下垂、跛行、瘫痪、拉稀以及翅、腿易折断为主要临床特征的传染性疾病，俗称“鸭短喙-侏儒综合征”或“鸭大舌病”。经鉴定该病病原为一种新型鸭细小病毒(novelduckparvovirus，ndpv)，与小鹅瘟病毒亲源关系较近，但二者不处于同一进化分支。鸭短喙-侏儒综合征主要发生于10-25日龄肉鸭，发病鸭常因采食和饮水困难而消瘦，甚至死亡，发病率20％-30％，甚至高达50％，给养鸭业造成了巨大的经济损失。因此，迫切需要开发相关疫苗用于该病的防控。

新城疫(newcastledisease，nd)是危害养禽业的重要传染病之一，近年来，新城疫对鸭的危害日趋严重。疫苗接种和严格的生物安全措施是控制新城疫的主要措施。新城疫病毒在靶器官中定向增殖，分为嗜呼吸道毒株和嗜消化道毒株，嗜呼吸道毒株主要有mukteswar株、hb1株、f株、lasota和lasota克隆株等。嗜消化道毒株主要有v4株、vg/ga株、ulster2c株和phy.lmv42株等。一些新城疫弱毒株如lasota、b1、vg/ga已被广泛用于新城疫的防控。

随着反向遗传操作技术的深入发展，新城疫病毒活载体疫苗得到广泛的研究和应用。重组新城疫病毒作为活载体疫苗具有突出的优点，不仅可以诱导体液免疫和细胞免疫，还可在体内增殖并长期表达抗原基因，且不会与宿主基因组整合，安全性要优于dna病毒载体。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种表达新型鸭细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒及其应用，以解决现有技术中缺乏一种ndpv-vp3蛋白制备方法的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是采用基于重组技术制备ndpv-vp3蛋白时，该蛋白基因在重组载体上的表达效率较低。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术在制备ndpv、ndv二联疫苗时需要分别制备抗原。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种表达新型鸭细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒，该重组新城疫病毒是通过以下方法构建的：

1)取鸭细小病毒，利用rt-pcr方法扩增得到ndpv-vp3基因，回收pcr产物，连接至pmd18-t-vector；

2)将ndpv-vp3基因与plmv-rfp线性化载体相连接，并将连接产物转化至stbl2感受态细胞，筛选出阳性克隆，即得到重组ndv病毒质粒；

3)将表达t7聚合酶的重组痘病毒vtf7-3以moi＝3的滴度接种于单层bhk-21细胞的24孔板内，孵育1h后，将plmv-vp3、pcdna-np、pcdna-p及pcdna-l质粒共转染bhk-21细胞，转染72h后，将收获拯救的重组病毒接种10日龄spf鸡胚，收获ha、hi检测均为阳性的鸡胚尿囊液，即得到重组新城疫病毒rlmv-ndpv-vp3。

作为优选，步骤1)中rt-pcr扩增的引物序列分别如seqidno.4、seqidno.5所示。

作为优选，步骤2)中所述将ndpv-vp3基因与plmv-rfp线性化载体相连接，具体包括以下操作：

a)以含有phy.lmv42全长cdna的重组质粒plmv-rfp为模板，利用引物在质粒plmv-rfp的rfporf的两端通过反向pcr扩增得到含phy.lmv42全长cdna的线性化载体；

b)利用引物扩增ndpv-vp3基因，得到的基因末端含有与phy.lmv42线性化载体末端相相同的15bp扩展序列；经qiaexiigelextractionkit回收后，通过cloningkit将ndpv-vp3基因与phy.lmv42线性化载体连接。

作为优选，步骤a)中所述引物序列分别如seqidno.6、seqidno.7所示。

作为优选，步骤b)中所述引物序列分别如seqidno.8、seqidno.9所示。

作为优选，vp3基因位于新城疫病毒p基因和m基因之间非编码区。

作为优选，步骤b)中将连接产物转化至stbl2感受态细胞后30℃培养24h，而后通过引物vp3-f、vp3-r进行pcr鉴定，筛选出阳性克隆。

作为优选，所述的重组新城疫病毒为phy.lmv42嗜肠道型毒株。

作为优选，所述的vp3基因来源于新型鸭细小病毒山东分离株。

同时，本发明提供了上述重组新城疫病毒用于制备鸭细小病毒病、鸭新城疫疫苗抗原的应用。

本发明提供了一种表达新型鸭细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒及其应用，该技术方案利用已建立的新城疫病毒phy.lmv42株的反向遗传操作平台，将新型鸭细小病毒的vp3基因orf插入ndv全长转录载体plmv-rfp，构建出重组质粒plmv-ndpv-vp3，该重组质粒与三个辅助质粒共转染bhk-21细胞后，获得了具有较高繁殖性能的表达ndpv-vp3蛋白的重组疫苗株rlmv-ndpv-vp3。该重组新城疫病毒株为phy.lmv42株，其为嗜肠道型毒株。ndpv-vp3基因位于新城疫病毒p基因和m基因之间非编码区，经反向遗传技术获得重组病毒rlmv-ndpv-vp3。本发明的表达新型鸭细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒可用于新型鸭细小病毒病和鸭新城疫的预防，达到一针防多病的效果。

附图说明

图1是本发明具体实施方式中plmv-rfppcr线性化电泳图；其中m为dnamarkerdl15000、1为plmv-rfppcr线性化的结果。

图2是本发明具体实施方式中重组病毒的ndpv-vp3基因的rt-pcr电泳图；其中m为dnamarkerdl15000、1为重组病毒rlmv-ndpv-vp3的结果。

图3是本发明具体实施方式中间接免疫荧光检测ndpv-vp3蛋白的表达结果(×200倍)。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

1、表达ndpv-vp3重组新城疫病毒的构建

以新型鸭细小病毒山东分离株为材料，利用rt-pcr方法扩增得到ndpv-vp3基因。参照genbank收录的新型鸭细小病毒vp3基因核苷酸序列(genbankno.kt343253)设计引物vp3-f、vp3-r，利用trizol试剂提取ndpv病毒rna，其扩增产物ndpv-vp3的片段大小为1605bp；扩增产物ndpv-vp3的核苷酸序列如seqidno:1所示。将回收的pcr产物，连接至pmd18-t-vector，经测序鉴定，ndpv-vp3正确插入到载体中。引物设计如下表：

将ndpv-vp3基因与plmv-rfp线性化载体相连接，并将连接产物转化至stbl2感受态细胞，筛选出阳性克隆，得到表达ndpv-vp3的重组ndv病毒质粒。以含有phy.lmv42全长cdna的重组质粒plmv-rfp(p基因和f基因间插有rfp报告基因)为模板，利用自行设计的引物lmv-p-up和lmv-f-down在质粒plmv-rfp的rfporf的两端通过反向pcr扩增得到含phy.lmv42全长cdna的线性化载体(结果见图1)，扩增产物片段大小为18,307kb。

利用特异性引物plant-vp3-f和plant-vp3-r扩增ndpv-vp3基因，得到的基因末端含有与phy.lmv42线性化载体末端相相同的15bp扩展序列：扩增产物的片段大小为1638bp；所述扩增产物的核苷酸序列如seqidno:2所示。经qiaexiigelextractionkit回收后，通过cloningkit将ndpv-vp3基因与phy.lmv42线性化载体连接；并将连接产物转化stbl2感受态细胞，30℃培养24h，通过引物vp3-f、vp3-r进行pcr鉴定，筛选出阳性克隆，命名为plmv-ndpv-vp3。所述重组质粒plmv-ndpv-vp3的核苷酸序列如seqidno：3所示。引物设计如下表：

^a小写字母表示的序列为与载体末端同源的序列

2、重组病毒rlmv-ndpv-vp3的拯救及鉴定

2.1重组病毒rlmv-ndpv-vp3的拯救

将表达t7聚合酶的重组痘病毒vtf7-3(moi＝3)接种于单层bhk-21细胞的24孔板内，孵育1h后，将0.5μgplmv-vp3、0.25μgpcdna-np、0.125μgpcdna-p及0.025μgpcdna-l质粒共转染bhk-21细胞。转染72h后，将收获的细胞反复冻融3次，接种10日龄spf鸡胚，收获ha、hi检测均为阳性的鸡胚尿囊液，用0.22μm的过滤器过滤除去痘病毒连续传3代后，所测ha效价为9log2。将重组病毒命名为rlmv-ndpv-vp3。

2.2重组病毒的鉴定

(1)重组病毒的rt-pcr鉴定。采用trizol法提取e5代鸡胚尿囊液重组病毒rna，利用引物vp3-f、vp3-r进行rt-pcr扩增，对扩增的pcr产物进行测序分析(结果见图2)。

(2)间接免疫荧光试(ifa)。将e5代重组病毒rlmv-ndpv-vp3和亲本病毒phy.lmv42毒株(moi＝1.0)分别感染cef单层细胞，37℃培养24h，用预冷的丙酮:乙醇(3:2)混合液室温固定7min，以鼠抗ndpv高免血清为一抗，以fitc标记羊抗小鼠igg为二抗，进行ifa检测ndpv-vp3基因的表达(结果见图3)。3、重组病毒的生物学特性测定

3.1eid50的测定

取重组毒rlmv-ndpv-vp3和rlmv-rfp做10倍梯度稀释，取稀释度10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰接种10日龄spf鸡胚各5枚，0.1ml/枚，另取两枚接种无菌生理盐水作对照，置于37摄氏度温箱中培养120h，每日观察，取出24h内死胚，按reed-muench法计算重组毒的eid50效价，结果：rlmv-ndpv-vp3和rlmv-rfp的eid50分别为10^8.0/0.1ml、10^8.5/0.1ml。

3.2鸡胚最小致死量的平均死亡时间(mdt)

将新收获的重组病毒rlmv-ndpv-vp3和rlmv-rfp的含毒鸡胚尿囊液用无菌生理盐水做10倍系列稀释，取10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹5个稀释度，分别接种10日龄spf鸡胚，上午8点每个稀释度接种5个鸡胚，0.1ml/枚，作标记“a”。将接种后剩余的重组病毒稀释液置于4℃保存，下午5点每个稀释度分别再接种5枚鸡胚，作标记“p”。接种后，每天上午和下午a、p组各照蛋一次，弃去24h内死亡的鸡胚，记录每一鸡胚的死亡时间，并测定每枚鸡胚尿囊液的血凝(ha)活性。将鸡胚置于37℃温箱中，连续观察7日后，将剩余的所有活胚置于4℃冰箱中冷却，收取鸡胚尿囊液，测定每胚的ha活性。上午和下午接种的鸡胚全部死亡的最高稀释度即为最小致死量。然后计算最小致死量的平均死亡时间。结果：该毒株的mdt值大于120h。

3.3脑内致病指数(icpi)的测定

将新收获的重组病毒rlmv-ndpv-vp3和rlmv-rfp的含毒鸡胚尿囊液，于4℃、9,000rpm离心20min，吸取上清于新的离心管中重复离心一次，使尿囊液中的杂质充分沉淀。取25只1日龄spf健康雏鸡，将其分为3组，第一组10只雏鸡，分别将每只雏鸡脑内注射10^-1稀释的重组病毒rlmv-ndpv-vp3的含毒鸡胚尿囊液0.05ml(使用规格为1ml的一次性灭菌注射器)。第二组10只雏鸡，每只雏鸡脑内注射10^-1稀释的重组病毒rlmv-rfp的含毒鸡胚尿囊液0.05ml。第三组5只脑内注射用于病毒稀释的无菌生理盐水各0.05ml。每日观察记录雏鸡的情况，分正常(鸡只活动灵活、无共济失调现象)、发病(麻痹、卧地不起、表现迟钝的鸡不包括在内)和死亡。连续观察8日，统计正常、发病、死亡鸡的总数，根据权值正常为0、发病为1、死亡为2累计总分数。将累计总分数除以正常、发病、死亡鸡的累计总数的平均值得到脑内致病指数。结果：icpi的测定值为0，表明获救病毒的毒力完全符合弱毒株的标准。

3.4静脉致病指数(ivpi)的测定

取20只6周龄的spf鸡，分为两组，每组各10只。将新收获的重组病毒rlmv-ndpv-vp3和rlmv-rfp的含毒鸡胚尿囊液做10倍稀释，静脉接种6周龄spf鸡，每一种重组毒接种10只spf鸡，0.1ml/只，另取2只接种生理盐水作对照。每日观察，记录接种情况，分正常、发病(鸡只表现为蜷缩不愿运动，采食或饮水减少，但无明显的翅、腿麻痹表现)、麻痹(腿、翅明显不协调、翅膀下垂)和死亡。连续观察10日，累计正常、发病、麻痹和死亡动物数，根据权值正常为0、发病为1、麻痹为2、死亡为3累计总分数。将累计总分除以正常、发病、麻痹和死亡动物的累计总数得到静脉致病指数。结果：ivpi测定值为0，以上结果表明rlmv-ndpv-vp3仍为弱毒株，且保持了原重组疫苗株rlmv-rfp对鸡胚的高滴度生长适应和低致病的特性，为开发预防新型鸭细小病毒、鸭新城疫病毒感染二联弱毒苗奠定了基础。

实施例2

一种表达新型鸭细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒，该重组新城疫病毒是通过以下方法构建的：

1.表达ndpv-vp3重组新城疫病毒的构建

(1a)以新型鸭细小病毒山东分离株为材料，利用rt-pcr方法扩增得到ndpv-vp3基因。将回收的pcr产物，连接至pmd18-t-vector，经测序鉴定，ndpv-vp3正确插入到载体中。

(1b)将ndpv-vp3基因与plmv-rfp线性化载体相连接，并将连接产物转化至stbl2感受态细胞，筛选出阳性克隆，得到表达ndpv-vp3的重组ndv病毒质粒。

更优的，所述步骤(1a)中，

所述ndpv-vp3基因pcr扩增的引物为：

上游引物：5’-atggcagagggaggaggcggagc-3’，

下游引物：5’-ttacagattttgagttagatatctg-3’；

其扩增产物ndpv-vp3的片段大小为1605bp；扩增产物ndpv-vp3的核苷酸序列如seqidno:1所示。

更优的，所述步骤(1b)中：

所述反向pcr扩增得到含有phy.lmv42全长cdna的线性化载体步骤的引物为：

上游引物：5’-ggtggcattctacccgtattttttc-3’，

下游引物：5’-cccactcacccagatcatcatg-3’；

扩增产物片段大小为18,307kb；其扩增产物的核苷酸序列如seqidno:3所示。

所述步骤(1b)中，所述pcr扩增ndpv-vp3基因末端含有与phy.lmv42线性化载体末端相同的15bp扩展序列引物为：

上游引物：5'-gggtagaatgccaccatggcagagggaggaggc-3’，

下游引物：5'-atctgggtgagtgggctattacagattttgagttag-3’；

扩增产物的片段大小为1638bp；所述扩增产物的核苷酸序列如seqidno:2所示。

2.重组病毒rlmv-ndpv-vp3的拯救

将表达t7聚合酶的重组痘病毒vtf7-3(moi＝3)接种于单层bhk-21细胞的24孔板内，孵育1h后，将plmv-vp3、pcdna-np、pcdna-p及pcdna-l质粒共转染bhk-21细胞。转染72h后，将收获拯救的重组病毒接种10日龄spf鸡胚，收获ha、hi检测均为阳性的鸡胚尿囊液。将重组病毒命名为rlmv-ndpv-vp3。

3.重组病毒的鉴定

(3a)重组病毒的rt-pcr鉴定。采用trizol法提取e5代鸡胚尿囊液重组病毒rna，进行rt-pcr扩增，对扩增的pcr产物进行测序分析。

(3b)间接免疫荧光试(ifa)。将e5代重组病毒rlmv-ndpv-vp3和亲本病毒phy.lmv42毒株(moi＝1.0)分别感染cef单层细胞，37℃培养24h，用预冷的丙酮:乙醇(3:2)混合液室温固定7min，以鼠抗ndpv高免血清为一抗，以fitc标记羊抗小鼠igg为二抗，进行ifa检测ndpv-vp3基因的表达。

4.重组病毒生物学特性测定

重组病毒效价和滴定分别通过ha、鸡胚半数感染量(50％egginfectivedose，eid50)和组织半数感染量(50％tissuecultureinfectivedose，tcid50)来测定。致病性分析按oie标准分别通过平均鸡胚致死时间(mdt)、脑内致病指数(icpi)及静脉内致病指数(ivpi)等致病性试验来评估。将重组病毒(moi＝0.01)感染单层cef细胞，每间隔24h收获上清，测定其生长曲线。每个时间点有两个独立的重复实验，且每个时间点收集的样品检测时有两个重复，其平均值以log10来表示。

实施例3

一种表达新型鸭细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒，该重组新城疫病毒是通过以下方法构建的：

1)取鸭细小病毒，利用rt-pcr方法扩增得到ndpv-vp3基因，回收pcr产物，连接至pmd18-t-vector；

2)将ndpv-vp3基因与plmv-rfp线性化载体相连接，并将连接产物转化至stbl2感受态细胞，筛选出阳性克隆，即得到重组ndv病毒质粒；

3)将表达t7聚合酶的重组痘病毒vtf7-3以moi＝3的滴度接种于单层bhk-21细胞的24孔板内，孵育1h后，将plmv-vp3、pcdna-np、pcdna-p及pcdna-l质粒共转染bhk-21细胞，转染72h后，将收获拯救的重组病毒接种10日龄spf鸡胚，收获ha、hi检测均为阳性的鸡胚尿囊液，即得到重组新城疫病毒rlmv-ndpv-vp3。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)中rt-pcr扩增的引物序列分别如seqidno.4、seqidno.5所示。

步骤2)中所述将ndpv-vp3基因与plmv-rfp线性化载体相连接，具体包括以下操作：

a)以含有phy.lmv42全长cdna的重组质粒plmv-rfp为模板，利用引物在质粒plmv-rfp的rfporf的两端通过反向pcr扩增得到含phy.lmv42全长cdna的线性化载体；

b)利用引物扩增ndpv-vp3基因，得到的基因末端含有与phy.lmv42线性化载体末端相相同的15bp扩展序列；经qiaexiigelextractionkit回收后，通过cloningkit将ndpv-vp3基因与phy.lmv42线性化载体连接。

步骤a)中所述引物序列分别如seqidno.6、seqidno.7所示。

步骤b)中所述引物序列分别如seqidno.8、seqidno.9所示。

vp3基因位于新城疫病毒p基因和m基因之间非编码区。

步骤b)中将连接产物转化至stbl2感受态细胞后30℃培养24h，而后通过引物vp3-f、vp3-r进行pcr鉴定，筛选出阳性克隆。

所述的重组新城疫病毒为phy.lmv42嗜肠道型毒株。

所述的vp3基因来源于新型鸭细小病毒山东分离株。

实施例4

一种表达新型鸭细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒，该重组新城疫病毒是通过以下方法构建的：

1)取鸭细小病毒，利用rt-pcr方法扩增得到ndpv-vp3基因，回收pcr产物，连接至pmd18-t-vector；

2)将ndpv-vp3基因与plmv-rfp线性化载体相连接，并将连接产物转化至stbl2感受态细胞，筛选出阳性克隆，即得到重组ndv病毒质粒；

3)将表达t7聚合酶的重组痘病毒vtf7-3以moi＝3的滴度接种于单层bhk-21细胞的24孔板内，孵育1h后，将plmv-vp3、pcdna-np、pcdna-p及pcdna-l质粒共转染bhk-21细胞，转染72h后，将收获拯救的重组病毒接种10日龄spf鸡胚，收获ha、hi检测均为阳性的鸡胚尿囊液，即得到重组新城疫病毒rlmv-ndpv-vp3。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤2)中所述将ndpv-vp3基因与plmv-rfp线性化载体相连接，具体包括以下操作：

a)以含有phy.lmv42全长cdna的重组质粒plmv-rfp为模板，利用引物在质粒plmv-rfp的rfporf的两端通过反向pcr扩增得到含phy.lmv42全长cdna的线性化载体；

b)利用引物扩增ndpv-vp3基因，得到的基因末端含有与phy.lmv42线性化载体末端相相同的15bp扩展序列；经qiaexiigelextractionkit回收后，通过cloningkit将ndpv-vp3基因与phy.lmv42线性化载体连接。

步骤b)中将连接产物转化至stbl2感受态细胞后30℃培养24h，而后通过引物vp3-f、vp3-r进行pcr鉴定，筛选出阳性克隆。

实施例5

一种表达新型鸭细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒，该重组新城疫病毒是通过以下方法构建的：

1)取鸭细小病毒，利用rt-pcr方法扩增得到ndpv-vp3基因，回收pcr产物，连接至pmd18-t-vector；

2)将ndpv-vp3基因与plmv-rfp线性化载体相连接，并将连接产物转化至stbl2感受态细胞，筛选出阳性克隆，即得到重组ndv病毒质粒；

3)将表达t7聚合酶的重组痘病毒vtf7-3以moi＝3的滴度接种于单层bhk-21细胞的24孔板内，孵育1h后，将plmv-vp3、pcdna-np、pcdna-p及pcdna-l质粒共转染bhk-21细胞，转染72h后，将收获拯救的重组病毒接种10日龄spf鸡胚，收获ha、hi检测均为阳性的鸡胚尿囊液，即得到重组新城疫病毒rlmv-ndpv-vp3。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>天津瑞普生物技术股份有限公司

<120>一种表达新型鸭细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒及其应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1605

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggcagagggaggaggcggagctatgggcgactcttcagggggtgccgatggagtgggt60

aatgcctcgggaaattggcattgcgattcccaatggatgggaaacacagtcatcacaaag120

accaccagaacctgggtcctgccaagctacaacaatcacatctacaaagcaattaccagt180

ggaacctctcaagatgcaaatgtccagtatgctggatacagtaccccctgggggtacttt240

gatttcaatcgcttccactgccacttctcccctagagactggcagagacttatcaacaac300

cattggggaatcagacccaagtctcttaaattcaagatcttcaatgttcaagtcaaggaa360

gtcacaacgcaggatcagacaaagaccattgcaaacaatctcacctcaacaatccaagtt420

tttacggatgatgagcaccaactcccgtatgtcctgggctcggctacggaagggaccatg480

ccgccgttcccgtcggatgtatatgccctgccgcagtacgggtactgcacaatgcacacc540

aaccagaatggagcacggttcaatgaccgtagcgcattctactgcttagagtacttccct600

agtcagatgctgagaacaggtaacaactttgagttcacatttgactttgaagaagttcct660

ttccacagcatgttcgctcattcacaggacttagacaggcttatgaaccccctagtggat720

caatacctctggaatttcaatgaggtagacagcaacagaaatgctcaatttaaaaaagct780

gtgaaaggggcttatggcaccatgggccgcaattggctgccgggacctaaattcctggat840

cagagagttagggcctacacaggaggaacagacaattatgcaaactggaacatctggaat900

aatgggaacaaggtgaatttaaaggacaggcagtatctcctacaacccggacctgtgtca960

gctactcacacagaaggggaggcttccagcatcccagctcagaatattttagggatagct1020

aaagatccatacagatctggcagcactacagcaggaataagtgatattatggtcacggac1080

gagcaggaagtagcacccacgaatggagtagggtggaaaccatatggtaggactgtaacg1140

aatgaacaaaacactactacagctcctacaagttcagatctggatgttcttggagcttta1200

ccaggaatggtgtggcagaacagagatatatatctgcagggacctatttgggcaaaaata1260

ccgaagactgatggcaaattccatccttctccaaatctcggaggatttggcctgcacaat1320

ccaccaccacaggtcttcatcaagaatacaccagtacctgcagaccctccagtagaatat1380

gtgaaccagaagtggaactcctacataactcaatactctacaggccagtgtacagtagaa1440

atggtgtgggagctgagaaaagagaattcaaagagatggaacccagaaatccagttcacc1500

agcaatttcagtaacagaactagtataatgtttgcacctaatgaaactggtggatatgta1560

gaagatagattgattggaaccagatatctaactcaaaatctgtaa1605

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gggtagaatgccacccccactcacccagat30

<210>3

<211>124

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

taagagcacaaccctcttctgctccctctgccccattaaacgatcgcgcagctgcaatta60

atccagctatattaagaattaagaaaaaatacgggtagaatcagagtaccccgattgtgc120

caag124

<210>4

<211>0

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

<210>5

<211>0

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

<210>6

<211>0

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

<210>7

<211>0

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

<210>8

<211>15

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gggtagaatgccacc15

<210>9

<211>15

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

atctgggtgagtggg15