一种含油污泥中石油烃类的降解菌株JN1及其应用的制作方法

本发明涉及生物修复技术领域，具体涉及一株含油污泥降解修复的菌株，及其在降解含油污泥中的应用。

背景技术：

自20世纪以来，石油已成为人类最主要的能源之一，而在被大量开采和使用的同时，石油及其加工品对环境及人类造成的危害也日趋严重。我国自改革开放以来原油年产量已超过1亿t，成为世界十大产油国之一的中国拥有400多个勘探、开发的油田和油气田，以约占国土面积3％的比例分布于全国25个省(市)和自治区。然而在经济技术快速发展以及石油需求量不断上升的过程中，我们对油田区域进行采油的技术工艺仍然相对落后，环境影响评价体系相对不完善，同时对石油类污染的修复技术较缺乏，使得我国石油类污染程度远高于发达国家，且呈逐年累积加重态势。

油泥是中国各大油田普遍存在的主要废弃物污染问题，早在1998年国家环保总局就将油泥列为危险废物(废物类别hw08)，要求必须对含油污泥等废弃物进行无害化处理。由于含油污泥的来源不同，其组分、性质也不尽相同。通过对各类含油污泥的取样分析，含油污泥一般含油15％～50％。对环境危害较大。按照《中华人民共和国清洁生产促进法》要求必须对含油污泥进行无害化处理。目前国内外动用了大量人力、物力进行含油污泥有效处理的研究，相继尝试过固化填埋、焚烧、淋洗、化学氧化和生物修复等方法处理含油污泥。生物修复技术具有成本相对较低、安全性高、操作简单、不易造成二次污染、能实施原位处理等优点，被认为是最有前景的修复手段。但由于含油污泥成分复杂难于降解，目前国内外对含油污泥的微生物降解修复研究相对较少。

cn102464438a公开了一种利用微生物降解井场含油污泥的方法；从黄土塬区油田井场含油污泥中通过培养、分离、筛选、驯化、诱变，得到绿脓杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、琼氏不动杆菌4种降解菌，按照重量比为1:1:1:1混合为含油污泥降解微生物菌群；初始ph值＝6，碳氮重量比等于100:3，碳磷重量比等于100:0.6，实验室在72h内，投加混合菌的处理体系中石油类的质量浓度从17214mg/kg降至1257mg/kg，降解率为92.7％；在井场对初始含油率为10.55％的含油污泥经过56天的处理试验，石油类物质去除率可达89.1％，处理效果明显。

cn104031870a公开了一种微生物复合菌剂，并涉及所述微生物复合菌剂与生物表面活性剂组成的联合修复剂，以及所述微生物复合菌剂和所述联合修复剂在修复石油污染土壤中的应用，属于石油污染土壤或含油污泥修复技术领域；所要解决的技术问题是提供一种能够有效降解石油污染土壤或含油污泥中的tph污染物，尤其是正构烷烃、霍烷和芳香烃的微生物复合菌剂，同时提供该微生物复合菌剂与生物表面活性剂联合修复石油污染土壤的方法；基础技术方案为：包括铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌的微生物复合菌剂。

cn104312936a公开了一种油基钻屑降解菌及其制备和应用方法，属含油固体废弃物微生物处理技术领域。油基钻屑降解菌由复合菌群构建组成，通过对石油污染土壤中的细菌进行富集、分离、纯化和筛选，纯化出了3株降解单菌，然后通过发酵培养制备，该油基钻屑降解菌含有拉丁文学名为pseudomonasaeruginosa的铜绿假单胞菌、拉丁文学名为kocuriakristinae的克氏微球菌和拉丁文学名为acinetobactercalcoaceticus的乙酸钙不动杆菌，用于油基钻屑中的石油组分降解，具有除油效率高、处理周期短的显著优势。对于初始油含量小于5％的油基钻屑，在处理5～30d，油含量可降至1％以下，油去除率达80％以上。用于含油土壤、含油污泥的生物修复，也具有良好的应用前景。

cn107299066a公开了一种含油污泥的微生物降解液的制备方法以及降解处理方法，所述的制备方法包括如下步骤：s1：配制微生物菌群第一培养基；s2：将复合微生物菌群在步骤s1的所述第一培养基中进行培养，得到第一菌群降解液，所述的复合微生物菌群为抗辐射不动杆菌、枯草芽孢杆菌、洛菲不动杆菌、琼氏不动杆菌、扁桃假单胞菌和分支节杆菌按照重量比1:1-2:0.3-0.7:1-1.4:1:2-3进行混合；s3：配制微生物菌群第二培养基；s4：将所述第一菌群降解液接种于所述第二培养基中进行培养，得到第二菌群降解液；s5：使用所述第二菌群降解液来降解含油污泥，完成微生物降解处理。所述方法通过独特的微生物菌群选择、培养方法和降解工艺操作等多个技术特征的综合组合和协同，从而取得了良好的降解效果。

生物处理方法分两类，一是向含油污泥中投加营养物质，曝气，促进污泥土著微生物生长增殖，从而实现对污染物的降解。二是向含油污泥中投加高效降解石油烃的微生物菌剂。生物处理技术的优点在于：一是不会形成二次污染或导致污染物转移；二是工艺简单，处理费用低；三是处理效果好，经过生化处理，污染物残留量可以大幅度降低。研究表明，投加石油烃降解菌可使降解率提高到50％以上。利用代谢表面活性剂微生物对含油污泥处理，提高石油烃类溶解度，可提高石油烃类的降解效率，利用生物处理可去除pahs类有害物质，生物处理可同时降解含油污泥中脂肪烃和芳香烃，但是生物处理方法存在受环境因素影响大、处理周期长等局限性，因此生物处理含油污泥的处理技术在国内还没有投入规模化应用。同时，目前的微生物降解菌剂都是复合微生物菌剂，多种菌株需要单独培养活化后按一定比例混合，再进行第二次培养活化后作为降解复合菌剂对污染物进行降解，培养工艺操作繁琐。现有技术中并没有使用单一的菌种实现较为优异的含油污泥中石油烃类的降解的技术方案。

技术实现要素：

本发明目的是提供一株石油烃类降解菌株，并将其在含油污泥降解修复过程中的应用。

本发明所述的一株不动杆菌及其在降解含油污泥中的应用，技术方案为：

一种石油烃类降解菌株，其特征在于，所述菌株为不动杆菌属(acinetobactersp.)，于2017年12月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为cgmccno.14972。

一种如上所述的石油烃类降解菌株来降解含油污泥中的石油烃类污染物的方法，其特征在于具体按照以下步骤实施：

其中，石油烃类降解菌株的筛选方法为

取辽河油田某含油污泥10g放入装有100mllb液体培养基的锥形瓶中，在30℃、120rpm的恒温摇床上进行震荡，富集培养24h。

所述lb培养基的组分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml。

24h后接种静置后的上层菌液于筛选培养基中，筛选培养基初始的正十八烷的加入量为1g/l，其后不断提高筛选培养基中的正十八烷含量直至5d内无菌落生长。

所述无机盐培养基的组分为：nacl30g，nh4no33g，kh2po41g，k2hpo41g，cacl20.02g，mgso40.5g，琼脂粉20g；去离子水1l；微量元素溶液10ml。

微量元素溶液：cuso40.05g，mnso40.05g，feso4·7h2o0.05g，去离子水50ml。

筛选培养基(烷烃培养基)：在无机盐培养基中添加正十八烷作为唯一碳源。

待菌落长出后，观察菌落形态，用无菌接种环从上述无菌落生长的前一浓度的筛选培养基中挑选形态差距大的菌落，采用平板划线分离法接种于lb固体培养基上，置于恒温培养箱中30℃倒置培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至lb固体培养基。重复上述划线分离过程，直至形成形态单一的纯化菌落，将其接种于保存培养基斜面上于4℃的冰箱保存备用。

上述菌株的菌落形态为：菌落呈淡黄色，半透明，表面光滑湿润，边缘整齐，如图1。菌体呈短杆状，细菌形态见扫描电镜图2。

上述菌株的16sribosomalrna基因序列特征，采用分析法将序列与数据库进行比对分析，发现该菌株属于不动杆菌属(acinetobactersp.)，其dna序列表如序列表所示。

使用前将其在lb液体培养基中活化24h制成菌液，将菌液以10％的接种量接种于含油污泥中。

优选的，所述的降解的最佳条件为：10％的接种量，温度30℃、ph为7的条件下降解效果最佳。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明的不动杆菌属(acinetobactersp.)jn1源于含油污泥，因此该菌株进入含油污泥后很快成为优势菌群，占据一定生态位，有效促进石油烃类的降解，优化土壤微生物体系，改善土壤的物理性状，增强土壤的生物活性。

2、本发明的不动杆菌属(acinetobactersp.)jn1是以正十八烷为唯一碳源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变含油污泥中石油烃类物质的性质，使含油污泥中石油烃类的组分发生变化。

3、本发明的不动杆菌属(acinetobactersp.)jn1是以单一的菌种实现较为优异的含油污泥中石油烃类的降解，减少混合菌剂制备过程中各菌株分别活化并按比例混合的复杂步骤，易于控制含油污泥石油烃类降解的最佳反应条件，且单一的菌株降解避免降解后的反应产物复杂，易于联合其他方法对含油污泥中的石油烃类物质进一步降解。

附图说明

图1为菌株jn1的群落形态。

图2为菌株jn1的扫描电镜图。

图3acinetobactersp.jn1对含油污泥中石油烃类的降解曲线。

图4acinetobactersp.jn1在不同ph下对含油污泥中石油烃类的降解曲线。

图5acinetobactersp.jn1在不同温度下对含油污泥中石油烃类的降解曲线。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明内容进行进一步详细说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

一种含油污泥中石油烃类的降解菌株，菌株为不动杆菌属。

(一)材料准备

从辽河油田某地取回含油污泥，4℃保存，运回实验室后将其接种到lb培养基中进行活化。

2.培养基：

无机盐培养基的组分为：正十八烷1g，nacl30g，nh4no33g，kh2po41g，k2hpo41g，cacl20.02g，mgso40.5g，琼脂粉20g；去离子水1l；微量元素溶液10ml。

微量元素溶液：cuso40.05g，mnso40.05g，feso4·7h2o0.05g，去离子水50ml。

lb固体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g、琼脂粉20蒸馏水1000ml，调节ph为7

3.实验仪器和设备

恒温振荡器

电热恒温培养箱

高压灭菌锅,

uv-1750紫外可见分光光度计-----上海棱光技术有限公司,

超净工作台,

oil480红外分光测油仪-----北京华夏科创有限公司，

pcr仪。

(二)菌株的分离筛选与驯化

取含油污泥10g放入装有100mllb液体培养基的锥形瓶中，在30℃、120rpm的恒温要床上进行震荡，富集培养24h；

24h后取1ml培养液用涂布棒涂布到含有正十八烷的固体无机盐培养基中，放入恒温培养箱培养7d；

待菌落长出后，观察菌落形态，用无菌接种环从上述固体无机盐培养基中挑选形态差距大的菌落，采用平板划线分离法接种于lb固体培养基上，置于恒温培养箱中30℃倒置培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至lb固体培养基。重复上述划线分离过程，直至形成形态单一的纯化菌落。将单菌落在液体lb培养基中扩繁，并保存在4℃，备用。使用前将保存的菌株在lb液体培养基中活化。

下面为具体实施例部分。

实施例1：辽河油田含油污泥的降解修复试验

取辽河油田含油污泥，风干研磨、过1mm筛，备用。挑取单菌落于灭菌的lb液体培养基中，用透气封口膜封口，将锥形瓶置于摇床中于120rpm、30℃活化24h。称取上述风干研磨过筛后的含油污泥40g，按照10％的接种量加入od600＝1的acinetobactersp.jn1活化的菌液，并用无机盐培养基调节水土比为2:5，用透气封口膜封口。将所有锥形瓶放置于30℃的恒温培养箱中静置培养，每隔5d取样，采用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量，降解曲线如附图3所示。由图可知该细菌对含油污泥中的石油烃类具有较好的降解效果，30天内对含油污泥中总石油烃(tph)的降解率为58.05％。

acinetobactersp.jn1降解30天前后的含油污泥的gc-ms分析结果可以看出(表1)，原始的含油污泥中的主要成分是萘烷、正十四烷、十八烯、四甲基十五烷、四甲基十六烷、茚烷、高雄烃、n-(2-三氟甲基苯)-3-吡啶甲酰胺肟(c13h10f3n3o)、二十六碳烯、藿烷。acinetobactersp.jn1微生物降解后的含油污泥中含有eicosane(正二十烷)和大量的小分子结构c2h2n2o，说明含油污泥中的石油烃类物质在微生物作用下发生了分子结构的变化，大分子结构的污染物质分解成小分子结构，而后再进一步分解。acinetobactersp.jn1对含油污泥中的烯烃二十六碳烯、芳香烃类物质萘烷(c10h18)和高雄烃(c21h36o2)具有较强的降解能力，降解率达100％。acinetobactersp.jn1降解30天后，含油污泥中仍有部分石油烃类物质残留，可以延长增加微生物降解时间和改变微生物降解条件等方式进一步降解。

表1acinetobactersp.jn1降解30天前后的含油污泥的gc-ms结果

实施例2：acinetobactersp.jn1在不同ph值下对含油污泥中石油烃类的降解效果取辽河油田含油污泥，风干研磨、过1mm筛。称取上述含油污泥40g于锥形瓶中，用稀h2so4和naoh调节土壤的ph分别为1、3、5、7、9、11，按照10％的接种量加入od600＝1的acinetobactersp.jn1活化的菌液，并用蒸馏水调节水土比为2:5，用透气封口膜封口。将所有锥形瓶放置于30℃的恒温培养箱中静置培养并于25天后取样，采用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量。在不同ph条件下菌株acinetobactersp.jn1对含油污泥中的石油烃类的降解效果如图4所示。由图4可知，本发明所述菌株在ph5-7范围内对含油污泥中的石油烃类具有较好的去除效果，ph7的条件下降解效果最佳。

实施例3：acinetobactersp.jn1在不同温度下对含油污泥中石油烃类的降解效果

取辽河油田含油污泥，风干研磨、过1mm筛。称取上述含油污泥40g于锥形瓶中，按照10％的接种量加入od600＝1的acinetobactersp.jn1活化的菌液，并用蒸馏水调节水土比为2:5，用透气封口膜封口。将锥形瓶分别放置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的恒温培养箱中静置培养，并于25天后取样，采用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量。在不同温度下菌株acinetobactersp.jn1对含油污泥中的总石油烃类的降解效果如图5所示。由图5可知，本发明所述菌株在25-50℃范围内对含油污泥中的石油烃类具有一定的降解效果，且降解率随着温度的升高先上升而后下降，30℃条件下降解效果最佳。

实施例4：不动杆菌属acinetobactersp.jn1修复实际含油污泥

在以上实施例的基础上，将不动杆菌属acinetobactersp.jn1用于修复实际含油污泥，实验具体步骤如下：

(1)菌株acinetobactersp.jn1的菌悬液制备：挑取菌株jn1的单菌落于lb液体培养基中，放置于摇床中，于40℃，120rpm条件下培养24h。采用发酵罐进行发酵培养，将上述培养的种子液按5％的接种量接种于lb培养基中，采用空气压缩机进行曝气，搅拌转速为200r/min，定时取样检测od600值，生长至对数生长期后备用。

(2)供试含油污泥：采自辽河油田某处含油污泥，经自然风干，过8目筛(3mm筛)。将含油污泥样品装入有机玻璃容器中，按照10％的接种量加入od600＝1的acinetobactersp.jn1活化的菌液，并用无机盐培养基调节液土比为2:5，用透气封口膜封口。

(3)将添加了菌液和无机盐培养基的含油污泥放置于恒温培养箱中静置培养，为达到最佳的降解效果，调节土壤的ph值为7，并维持温度在30℃。

经过30天的生物降解处理后对含油污泥进行检测，发现对含油污泥中总石油烃(tph)的降解率为57.5％，对含油污泥中的石油烃类具有较好的降解效果。

序列表

<110>北京大学

<120>一种含油污泥中石油烃类的降解菌株jn1及其应用

<130>2018

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1416

<212>dna

<213>不动杆菌(acinetobactersp.)

<400>1

gcttaccatgcaagtcgagcggagatgaggtgcttgcaccttatcttagcggcggacggg60

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