一种利用流式细胞仪进行细胞单克隆化的方法与流程

本发明属于生物制药和生物
技术领域：
，具体涉及一种利用流式细胞仪进行细胞分选、单克隆化以及生产用细胞株的构建的方法。
背景技术：
：生物制药是指综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品，以单克隆抗体、重组蛋白、酶、疫苗为主要代表。单克隆抗体等生物药的生产通常借助于哺乳动物表达系统(如cho，即中国仓鼠卵巢细胞)，即将单克隆抗体的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞系中，筛选稳定高效表达目标产物的细胞株。生产用稳定细胞株的构建通常包括以下步骤，(1)转染，即将目的蛋白的表达载体通过脂质体或者电穿孔的方法转染到宿主细胞中，表达载体上除目的基因序列外，还含有抗生素或者代谢相关的筛选基因；(2)筛选，即使用抗生素等对转染后的细胞进行加压筛选，理论上只有表达目的蛋白的细胞才能存活下来；(3)单克隆化，筛选完成后得到的细胞群需进行单克隆化，对于每一个单克隆细胞株，所有的细胞均来源于同一个母细胞。(4)克隆筛选，得到众多单克隆细胞株后，需评估其表达量、产品质量、细胞株稳定性、反应器可放大性等，最终选出一个用于生产的稳定细胞株。细胞单克隆化是稳定细胞株构建过程中的关键步骤。单克隆化的过程，一方面需要高效地筛选出表达量高的克隆，另一方面需要保证单克隆率达到足够高的水平。目前，监管部门为了保证生物药品的安全性，对生产用稳定细胞株的单克隆性有着严格的要求。细胞单克隆化的常用的方法包括有限稀释法、半固体培养基铺板、流式细胞仪分选等。有限稀释法是最为传统的方法，通常的操作方法是将细胞梯度稀释，以很低的密度(一般为0.3～0.8细胞/孔)接种到96孔板中(或384孔板)。目前，借助于成像仪器，一轮有限稀释即可到达较高的单克隆率。在有限稀释实验中，细胞在96孔板中满足泊松分布。当铺板密度很低时，存在大量的空孔以及非单克隆孔，同时考虑到细胞的恢复情况，最终每块96孔板可供选择的生长良好的单克隆孔比较有限。因此，有限稀释法是一种效率较低的单克隆化方式，比较耗时耗力。半固体培养基铺板，是将细胞接种到半固体培养基中，生长数天后，单个细胞形成一个群落。如果在半固体培养基中预先加入识别目标产物的荧光标记的抗体，借助于clonepix等仪器，可以有效地挑选出表达量高的克隆。然而，半固体培养基铺板通常至少需要两轮实验才可以达到足够高的单克隆率，因此增加了时间和经济成本。流式细胞仪单细胞分选是一种高效的单克隆化的手段，它是通过借助于细胞内的荧光标记，或者对细胞分泌产物进行荧光染色，来分选出表达量高的克隆。使用流式细胞仪将单细胞分选至96孔板，相对于有限稀释法，空孔率大大降低，同时单克隆率得到提升。目前，流式细胞仪单细胞分选技术在稳定细胞株构建过程中已经得到了广泛的应用。由于监管部门对于细胞株单克隆性有着严格的要求，因此在实际应用中，需要优化并验证流式细胞仪分选的单克隆率。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于，提供一种利用流式细胞仪进行细胞单克隆化的方法，能够解决现有技术中单克隆率不高的问题。为解决上述技术问题，本发明提供一种利用流式细胞仪进行细胞单克隆化的方法，包括步骤：步骤一、细胞分选：使用清洁后的流式细胞仪进行细胞分选，利用fsc和ssc的信号进行细胞粘连体去除，孔板中每孔分选1个细胞。步骤二、细胞培养：将分选后的目标细胞在二氧化碳培养箱静置培养，培养条件为36.5℃和5～6％co2，培养5～15天，待克隆恢复。本发明提供一种利用流式细胞仪进行细胞分选的方法，以解决现有单细胞克隆技术中单克隆率不高，难以满足监管部门对于细胞株单克隆性要求的缺陷。本发明中利用流式细胞仪进行细胞分选的方法，包括步骤：1.分选细胞准备：将目标细胞进行离心，使用传代培养基重悬，使细胞密度为1e5～1e6cells/ml，将细胞用滤网过滤后上样。2.分选参数设置：设置喷嘴尺寸为85或100μm，windowextension设置为1～3ms，上样流速设置为1～11。3.单细胞分选：利用fsc和ssc的信号进行细胞粘连体去除，孔板中每孔分选1个细胞。具体的，所述步骤1目标细胞为传代培养的cho-k1细胞。优选的，所述步骤1细胞密度为1e5～1e6cells/ml。具体的，所述步骤2中调节侧液流的偏转角度以及孔板a1孔的位置，使侧液流位于a1孔的正中位置。具体的，所述步骤2中分选参数设置时需要调节fsc(前向散射光)和ssc(侧向散射光)的电压值、fsc和蓝激光的面积因子。具体的，所述步骤3中孔板每孔加入50～200μl培养基；优选的，每孔加入100μl培养基。具体的，所述孔板为96孔板。采用发明提供的分选方法进行单细胞分选，80.3％的孔为单克隆，19.3％的孔为空孔，0.4％的孔含有2个或2个以上细胞，单克隆率达到99.5％。本发明的有益效果在于，使用流式细胞仪进行单细胞分选，80.3％的孔为单克隆，19.3％的孔为空孔，0.4％的孔含有2个或2个以上细胞，单克隆率达到99.5％。相对于现有技术的单克隆率大大提高。附图说明图1为fsc-a(前向散射光-面积)和ssc-a(侧向散射光-面积)散点图，通过scattergate排除死细胞和细胞碎片。图2为ssc-h(侧向散射光-高度)和ssc-w(侧向散射光-宽度)散点图，通过sscgate排除细胞粘连体。图3为fsc-h(前向散射光-高度)和fsc-w(前向散射光-宽度)散点图，通过fscgate进一步排除细胞粘连体。具体实施方式下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1本发明所开发的利用流式细胞仪进行细胞单克隆化的方法，可应用于cho-k1等生产用稳定细胞株的构建，以facsariaii(bdbiosciences)流式细胞仪为代表，其具体实施方法如下：1、仪器性能检测与液流调节：打开流式细胞仪主电源和激光器电源，打开电脑，最后打开facsdiva软件。启动液流，调节振幅和频率值，使液流稳定，drop1和gap值合适。使用bdfacsdivatmcs&tbeads对仪器进行性能检测。使用bdfacstmaccudropbeads调节dropdelay的值。2、分选细胞准备：将传代培养的cho-k1细胞离心，使用传代培养基重悬，使细胞密度为1e5～1e6cells/ml。将细胞使用滤网过滤后上样分选。3、分选参数设置：喷嘴尺寸为85或100μm。细胞上样检测，调节fsc(前向散射光)和ssc(侧向散射光)的电压值、fsc和蓝激光的面积因子。windowextension设置为1～3ms，上样流速设置为1～11。4、96孔板位置调节：调节侧液流的偏转角度，以及96孔板a1孔的位置，使侧液流位于a1孔的正中位置。5、单细胞分选：利用fsc和ssc的信号进行细胞粘连体去除。96孔板预先每孔加入50～200μl培养基，每孔分选1个细胞。6、分选后细胞培养：分选后，细胞在二氧化碳培养箱静置培养(36.5℃、5～6％co2)，分选后进行拍照。待克隆恢复后，将克隆扩增，进行后续的筛选。实施例2流式细胞仪单细胞分选效率预先在96孔板每孔加入100μl含有乙醇的培养基，使用流式细胞仪进行单细胞分选，每孔分选1个细胞。培养基加入乙醇，目的是使细胞不再分裂。分选完成后，96孔板静置2～3h使细胞充分沉降，然后进行拍照，以判断96孔板每孔是否为单克隆。检测结果如下：分选次数96孔板数空孔数单细胞孔数2个或2个以上细胞孔数14733012224614203267121044842893522915816212175172151730汇总18326(19.3％)1359(80.3％)7(0.4％)试验结果显示，采有本发明的分选方法，可得到80.3％的孔为单克隆，19.3％的孔为空孔，0.4％的孔含有2个或2个以上细胞，单克隆率达到99.5％，相对于现有技术的单克隆率大大提高。综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。当前第1页12