【
技术领域：
】本发明涉及复合材料
技术领域：
，具体涉及一种氧化石墨烯促菌复合材料。
背景技术：
：石墨烯是一种sp2杂化、具有蜂窝结构、单原子厚度的二维碳纳米材料，可以看作是平面芳族大分子。石墨烯还可以看作是其他碳纳米材料的基本组成部分，石墨烯可以通过包裹形成零维的富勒烯，卷起形成一维的碳纳米管，通过堆叠形成三维石墨。氧化石墨烯(go)是石墨烯的一种重要的衍生物，一般由石墨经强酸氧化而制得，常用为hummer’s合成法。以石墨粉为原料，用浓硫酸、高锰酸钾进行氧化，再经洗涤透析等步骤得到边缘有含氧基团的石墨薄片，最后通过超声等物理方法实现氧化石墨的完全剥离，得到单层氧化石墨烯材料。其表面含有丰富的活性含氧基以及π共轭结构，为氧化石墨烯材料进行共价/非共价修饰或者进行药物包载提供了结构基础，同时因其良好的水溶性以及可修饰性。石墨烯材料及其衍生物已经被广泛的用于生物工程和生物医药领域的研究中，尤其在药物输送、肿瘤治疗、生物检测以及微生物工程中都有突破性的发现。2008年戴宏杰教授课题组首次报道了可以利用聚乙二醇修饰的氧化石墨烯作为难溶性芳香类抗肿瘤药物sn38的给药载体。研究还发现经聚乙二醇修饰的氧化石墨烯还可以用于阿霉素(dox)的靶向运输，能够通过ph响应释放装载的抗肿瘤药物，大大提高了抗肿瘤药物的治疗效果以及治疗效率。同时碳材料在近红外区有较强的吸收，可以转换光能为热能，近红外光具有穿透能力强且生物组织对这一范围光的吸收较少的特点，这样氧化石墨烯材料可以对肿瘤进行光热和药物的联合治疗。在生物检测领域，因为石墨烯材料表面具有大量的π共轭结构，即可以通过π-π堆垛作用与单链dna、血红蛋白相互作用，能够明显降低在进行激光飞行时间质谱(seldi)时的背景噪音。负载银纳米颗粒的石墨烯材料，可以通过拉曼光谱实现最低限为9nm的叶酸检测。另一方面，氧化石墨烯材料被证实了具有优秀的生物相容性，有报道表明氧化石墨烯薄膜能够促进l-929细胞、成骨细胞、肾脏细胞和胚胎细胞的附着和增殖。在微生物领域，中国专利申请号cn201410306950.7(cn104068058a)公开了一种纳米银颗粒吸附的氧化石墨烯复合材料，达到了良好的抑菌作用。在现有技术中，中国专利申请号cn200510111874.5(cn1986443)和中国专利申请号cn200510111877.9(cn1986446)都提出了利用金属盐(亚铁盐、锰盐、钙盐和镁盐)、糖蜜和吸附物以促进硝化菌的生长。中国专利申请号cn201410141638.7(cn103898026a)公布了一种添加多种微量元素的促进剂，以促进亚硝酸细菌的生长。以上细菌生长促进剂需要多种原材料，工艺较为复杂且仅针对一种或少数几种细菌发挥生长促进作用，不能适应促进多种细菌生长的需求。技术实现要素：本发明的发明目的在于：针对现有细菌生长促进剂需要原料较多、工艺复杂、作用细菌单一的问题，提供一种氧化石墨烯促菌复合材料。本发明对以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌和以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌均有促进作用，且需要原料较少，合成工艺简单，此外本发明还提供了该氧化石墨烯促菌复合材料的制备方法，该方法具有可操作性，需要实验设备简单，可以进行扩大生产。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种氧化石墨烯促菌复合材料的制备方法，包括以下步骤：a.按重量份比，取氧化石墨烯，加水稀释，配制成质量浓度为0.9～1.2mg/ml的氧化石墨烯水溶胶，然后向所述氧化石墨烯水溶胶中缓慢加入碱，经水浴搅拌后，得到碱性氧化石墨烯溶液；b.向所述碱性氧化石墨烯溶液中加入盐酸调节溶液ph≤1，离心，取下层液体，经水洗、离心直至下层液体ph值为6.5～6.8，得到碱化氧化石墨烯溶液；c.向所述碱化氧化石墨烯溶液中加水稀释，配制成质量浓度为0.9～1.2mg/ml的碱化溶液，再向所述碱化溶液中加入八臂聚乙二醇，混合均匀并进行超声处理，然后用碳酸氢钠调节ph至7.5～7.8，加入碳二亚胺，最后进行超声处理并在室温下搅拌，得到反应混合溶液；d.取反应混合溶液用超滤管反复离心水洗不少于5次，得到氧化石墨烯促菌复合材料。进一步的，步骤a中，按重量比，所述氧化石墨烯和所述碱的比为1:30～1:40。进一步的，步骤a中，所述碱所采用的材料选自氢氧化钠或氢氧化钾。进一步的，步骤a中，所述超声处理的时间为30～150分钟；所述水浴的温度为50～60℃，时间为4～6小时。进一步的，步骤c中，所述八臂聚乙二醇为链端为氨基的八臂聚乙二醇，分子量为10000。进一步的，步骤c中，所述碳二亚胺为水溶性碳二亚胺；所述碳二亚胺的加入方法为分两次加入，第一次碳二亚胺加入后进行超声处理，然后再加入第二次碳二亚胺。进一步的，步骤c中，按重量比，碱化氧化石墨烯：八臂聚乙二醇：第一次碳二亚胺：第二次碳二亚胺的比为1:0.5～5:1～1.2:2.5～3.5。进一步的，步骤c中，所述超声处理的时间均为15～30分钟。进一步的，步骤c中，所述室温搅拌的时间为8～20小时。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：1.相比传统细菌生长促进剂，本发明所述的制备方法需要原料较少，合成工艺简单，制备条件温和，且需要实验设备简单，可以进行扩大生产。2.本发明所述的氧化石墨烯促菌复合材料在制备的过程中，经历强酸和强碱条件，不具备细菌生长条件，使用前不需要进行高温灭菌，使用时不会引入其他细菌污染底物或培养体系。在制备的过程中，本发明分两次加入水溶性碳二亚胺，避免了单次加入碳二亚胺过多，从而导致氧化石墨烯复合材料出现大量聚沉、无法分散均匀的问题。3.本发明所制备的氧化石墨烯促菌复合材料中，氧化石墨烯的羧基的碳原子与八臂聚乙二醇链端的氨基的氮原子相连构成酰胺键，相比物理吸附，本发明制备的氧化石墨烯促菌复合材料的结构和性质具有更好的稳定性，且不会与其他生长促进剂发生反应，可以与其他种类的生长促进剂同时使用，进一步促进细菌生长。4.本发明所述的氧化石墨烯促菌复合材料可以为细菌生长提供附着或进入细胞内，提高细菌胞外聚合物的分泌，对以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌和以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌均有促进细菌生长作用，以空白对照组为100％基准细菌活性的话，本发明制备的氧化石墨烯促菌复合材料最高可以达到160.6％的细菌促进作用。【具体实施方式】下面结合实施例对本发明作进一步说明。一、制备实施例实施例1一种氧化石墨烯促菌复合材料的制备方法，包括以下步骤：a.按重量份比，取氧化石墨烯，加水，接着进行超声处理30分钟，配制成质量浓度为0.9mg/ml的氧化石墨烯水溶胶，然后向所述氧化石墨烯水溶胶中缓慢加入氢氧化钠，经50℃水浴搅拌4小时后，得到碱性氧化石墨烯溶液，按重量份比，所述氧化石墨烯和氢氧化钠的比为1:30；b.向所述碱性氧化石墨烯溶液中加入盐酸调节ph＝1，离心，取下层液体，经水洗、离心至下层液体ph值为6.5，得到碱化氧化石墨烯溶液；c.向所述碱化氧化石墨烯溶液中加水稀释，接着进行超声处理15分钟，配制成质量浓度为0.9mg/ml的碱化溶液，再向所述碱化溶液中加入八臂聚乙二醇，混合均匀并进行超声处理15分钟，用碳酸氢钠调节ph至7.5，加入第一次碳二亚胺，进行超声处理15分钟，然后加入第二次碳二亚胺，接着进行超声处理15分钟，并在室温下搅拌8小时，得到反应混合溶液；其中，按重量比，所述碱化氧化石墨烯：八臂聚乙二醇：第一次碳二亚胺：第二次碳二亚胺的比为1:0.5:1.2:2.5；d.将所述反应混合溶液用超滤管反复离心水洗6次，得到氧化石墨烯促菌复合材料样品。其中，在步骤c中，所述的聚乙二醇为链端为氨基的八臂聚乙二醇，分子量为10000；所述的碳二亚胺为水溶性碳二亚胺，为羧基活化剂。实施例2一种氧化石墨烯促菌复合材料的制备方法，包括以下步骤：a.按重量份比，取氧化石墨烯，加水，接着进行超声处理50分钟，配制成质量浓度为1mg/ml的氧化石墨烯水溶胶，然后向所述氧化石墨烯水溶胶中缓慢加入氢氧化钠，经54℃水浴搅拌5小时后，得到碱性氧化石墨烯溶液，按重量份比，所述氧化石墨烯和氢氧化钠的比为1:34；b.向所述碱性氧化石墨烯溶液中加入盐酸调节ph＝0.9，离心，取下层液体，经水洗、离心至下层液体ph值为6.6，得到碱化氧化石墨烯溶液；c.向所述碱化氧化石墨烯溶液中加水稀释，接着进行超声处理20分钟，配制成质量浓度为1mg/ml的碱化溶液，再向所述碱化溶液中加入八臂聚乙二醇，混合均匀并进行超声处理20分钟，用碳酸氢钠调节ph至7.6，加入第一次碳二亚胺，进行超声处理20分钟，然后加入第二次碳二亚胺，接着进行超声处理20分钟，并在室温下搅拌12小时，得到反应混合溶液；其中，按重量比，所述碱化氧化石墨烯：八臂聚乙二醇：第一次碳二亚胺：第二次碳二亚胺的比为1:1:1:3；d.将所述反应混合溶液用超滤管反复离心水洗5次，得到氧化石墨烯促菌复合材料样品。实施例3一种氧化石墨烯促菌复合材料的制备方法，包括以下步骤：a.按重量份比，取氧化石墨烯，加水，接着进行超声处理80分钟，配制成质量浓度为1.1mg/ml的氧化石墨烯水溶胶，然后向所述氧化石墨烯水溶胶中缓慢加入氢氧化钾，经57℃水浴搅拌6小时后，得到碱性氧化石墨烯溶液，按重量份比，所述氧化石墨烯和氢氧化钾的比为1:37；b.向所述碱性氧化石墨烯溶液中加入盐酸调节ph＝0.8，离心，取下层液体，经水洗、离心至下层液体ph值为6.7，得到碱化氧化石墨烯溶液；c.向所述碱化氧化石墨烯溶液中加水稀释，接着进行超声处理25分钟，配制成质量浓度为1.1mg/ml的碱化溶液，再向所述碱化溶液中加入八臂聚乙二醇，混合均匀并进行超声处理25分钟，用碳酸氢钠调节ph至7.7，加入第一次碳二亚胺，进行超声处理25分钟，然后加入第二次碳二亚胺，接着进行超声处理25分钟，并在室温下搅拌16小时，得到反应混合溶液；其中，按重量比，所述碱化氧化石墨烯：八臂聚乙二醇：第一次碳二亚胺：第二次碳二亚胺的比为1:2:1.1:3.2；d.将所述反应混合溶液用超滤管反复离心水洗7次，得到氧化石墨烯促菌复合材料样品。其中，在步骤c中，所述的聚乙二醇为链端为氨基的八臂聚乙二醇，分子量为10000；所述的碳二亚胺为水溶性碳二亚胺，为羧基活化剂。实施例4一种氧化石墨烯促菌复合材料的制备方法，包括以下步骤：a.按重量份比，取氧化石墨烯，加水，接着进行超声处理100分钟，配制成质量浓度为1.2mg/ml的氧化石墨烯水溶胶，然后向所述氧化石墨烯水溶胶中缓慢加入氢氧化钾，经60℃水浴搅拌6小时后，得到碱性氧化石墨烯溶液，按重量份比，所述氧化石墨烯和氢氧化钾的比为1:40；b.向所述碱性氧化石墨烯溶液中加入盐酸调节ph＝0.7，离心，取下层液体，经水洗、离心至下层液体ph值为6.8，得到碱化氧化石墨烯溶液；c.向所述碱化氧化石墨烯溶液中加水稀释，接着进行超声处理30分钟，配制成质量浓度为1.2mg/ml的碱化溶液，再向所述碱化溶液中加入八臂聚乙二醇，混合均匀并进行超声处理30分钟，用碳酸氢钠调节ph至7.8，加入第一次碳二亚胺，进行超声处理30分钟，然后加入第二次碳二亚胺，接着进行超声处理30分钟，并在室温下搅拌20小时，得到反应混合溶液；其中，按重量比，所述碱化氧化石墨烯：八臂聚乙二醇：第一次碳二亚胺：第二次碳二亚胺的比为1:5:1.2:3.5；d.将所述反应混合溶液用超滤管反复离心水洗7次，得到氧化石墨烯促菌复合材料样品。对比实施例1按照实施例2中的实验方法，在步骤c中，改为一次性加入碳二亚胺，按重量比，碱化氧化石墨烯：八臂聚乙二醇：碳二亚胺的比为1:1:4，其余实验步骤、条件均相同。加入碳二亚胺后，氧化石墨烯出现大量聚沉的现象，经60分钟超声处理，仍然无法分散均匀，故无法进行后续测试。对比实施例2按照实施例2中的实验方法，在步骤d中，改为使用超滤管反复水洗离心2次，其余实验步骤、条件均相同。二、物理性质测试实施例实施例5对实施例1-4和对比实施例2得到的氧化石墨烯促菌复合材料以及实施例2步骤b中得到的碱化氧化石墨烯进行zeta电位测试。取各样品稀释至0.005mg/ml的浓度，使用马尔文纳米粒度电位测试仪(malvernzetasizer)进行zeta电位测试，测试结果为表1。表1zeta电位测试结果样品名称zeta电位(mv)碱化氧化石墨烯-44.9实施例1-27.5实施例2-20.1实施例3-15.4实施例4-4.7对比实施例2-17.1从表1可以看出，实施例2步骤b中得到的碱化氧化石墨烯，其表面含有大量的羧基，带有最多负电荷，zeta电位最低为-44.9mv；而经链端为氨基的八臂聚乙二醇修饰后的氧化石墨烯促菌复合材料，其表面氨基的数量随着加入八臂聚乙二醇重量的增加而增加，其zeta电位也在升高，证实了氧化石墨烯促菌复合材料的生成。另一方面，与实施例2相比，对比实施例2的电位有略微升高，主要是样品中残余的碳二亚胺和八臂聚乙二醇导致的。三、实施效果实施例实施例6使用mtt法对氧化石墨烯促菌复合材料进行细菌活性测试。以10％的浓度接种对数期大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌，分别按0.02mg/ml的终浓度加入实施例1-4和对比实施例2中制备的氧化石墨烯促菌复合材料，对照组加入等量的灭菌水，加入lb培养基配成2ml体系，放入37℃恒温摇床中，以155rpm转速孵育2.5小时，随后用pbs溶液将孵育后的菌液稀释6倍，加入至96孔板中，按终浓度为1mg/ml加入mtt溶液，用铝箔纸完全包裹避光，放入37℃恒温培养箱中孵育5.5小时后，吸出每孔中的上清液，每孔再加入0.1ml的二甲亚砜，放入恒温摇床中，以155rpm的转速孵育15分钟，之后使用酶标仪的mtt模式检测。细菌活性按下列公式计算：细菌相对活性(％)＝(od实验组570nm/od对照570nm)*100％，其中od值均为平行孔的平均值。细菌活性测试结果见表2。表2氧化石墨烯促菌复合材料细菌活性测试结果从表2可以看出，实施例1-4制备的氧化石墨烯促菌复合材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的生长促进作用，其中实施例2制备的氧化石墨烯促菌复合材料的生长促进作用最好，对大肠杆菌的促进效果达到了160.6％；与实施例2相比，对比实施例2制备的复合材料由于含有残留的碳二亚胺、八臂聚乙二醇等，并未表现出细菌生长促进作用，实验结果具有显著性差异。上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。当前第1页12