本公开涉及农业生物
技术领域：
，具体地，涉及一种杂交瘤细胞对、一种单克隆抗体对、该单克隆抗体对在检测irre蛋白中的用途以及一种免疫胶体金试纸条。
背景技术：
：耐辐射异常球菌(deinococcusradiodurans)是迄今发现对包括电离辐射、过氧化氢、紫外线辐射、丝裂霉素c和干旱等多种dna损伤试剂都有很强的抗性的细菌菌株。1999年美国基因组研究所完成了耐辐射异常球菌全基因组测序，为其抗性机制的研究打下重要的理论基础。研究发现，耐辐射异常球菌中irre基因编码异常球菌属特异蛋白，是该菌属特有的、极其重要的dna修复保护途径的开关基因，对dna损伤修复起重要的作用。该基因突变造成菌株多种胁迫抗性丧失。研究认为irre基因是一种新型的负责极端胁迫抗性的启动基因，在各种dna损伤修复和保护极端胁迫反应的途径中起中心调控作用。将irre在大肠杆菌中组成型表达，使得大肠杆菌的电离辐射抗性提高近1.6倍。irre对电离辐射后大肠杆菌中reca蛋白的表达起诱导作用。同时增强了电离辐射后细胞中过氧化氢酶katg的活性，进而提高了细胞对氧自由基的清除能力。在3m山梨醇冲击、1％过氧化氢冲击以及53℃高温冲击等非生物胁迫实验结果表明，irre具有提高大肠杆菌渗透胁迫、氧化胁迫和高温胁迫的功能。同时，还发现了irre能提高大肠杆菌的耐盐能力。利用花椰菜花叶病毒35s启动子将irre蛋白在油菜中过量表达。表达irre的转基因油菜在萌发、生长、开花、结子等生长过程与对照植株没有差别，但表现出极好的耐盐抗旱能力。转基因植株能够在350mm氯化钠处理6周后正常的开花结子，而对照植物在处理2周时已全部死亡。研究发现高浓度盐胁迫下表达irre的转基因植株中胁迫诱导蛋白cbf1和cbf3、质膜钠转运蛋白sos1以及超氧化物歧化酶sod表达显著上调。推测全局调控因子irre通过直接或间接上调这些蛋白的表达，从而提高了转基因植株的耐盐抗旱能力。现代生物技术的发展为利用外源基因培育新种农作物提供了途径。在转基因产品的研发、筛选或安全评估时，需要转基因生物检测技术对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。现有的检测技术，如酶免法、放免法等，需要特殊的仪器设备(酶标仪、放免闪烁仪、离心机等)和专用的场地等，检测时间长(酶免检测时间需2h、放免检测需3h左右)，检测成本较高，需要专业的操作人员进行检测，实践推广应用的空间有限。因此，需要有一种操作简便、结果准确可靠、可快速检测转基因植物中irre蛋白的装置。免疫结合胶体金层析法是免疫金标记技术和抗原抗体反应相结合而形成的一种应用形式。免疫结合胶体金层析法利用抗原抗体反应的原理，包括双抗体夹心法、双抗原夹心法、捕获法和竟争抑制法等实施方法，其中，以双抗体夹心法应用最为广泛。双抗体夹心法利用一对针对不同抗原表位的抗体，检测有多个抗原位点的生物分子。具体实施的技术方案如下：首先将已知的特异性抗体(单抗或多抗)按一定的浓度包被于微孔膜上作为检测带，可与金标物结合的二抗包被于膜上作为质控带。使用胶体金标记与包被抗体相配对的另一单抗，形成的金标结合物涂布于金标垫上并进行干燥。干燥的金标垫的两端分别连接膜与样品垫。膜的另一侧粘贴吸水垫。检测时，在样品垫上加入一定量的液体样本，借助毛细管作用，样本向吸水垫的方向移动。首先经过干燥金标垫，复溶金标结合物，如标本中有待测抗原，则发生抗原抗体反应，形成复合物a(金颗粒－抗体－抗原)；样本继续移动到达检测带位置，则与包被抗体再次发生抗原抗体反应，形成复合物b(金颗粒－抗体－抗原－包被抗体)，并于检测带的部位聚集，最终达到肉眼可见的程度，如样本中无待检抗原或待检抗原的浓度低于检测范围，则不能形成肉眼可见的红色条带。游离的金标结合物或复合物a越过检测带到达质控带，与二抗发生反应，形成复合物c(金颗粒－抗体－二抗)，聚集并产生肉眼可见的红色条带。无论样本中是否含有待检物质，质控带都会呈现红色条带。免疫结合胶体金层析法具有操作简单、快速、可单份检验、不需要特殊设备的优点。但目前免疫结合胶体金层析法普遍存在一定缺陷，如敏感度低，质量控制能力不够，批间、批内和不同试剂间变异系数过大等。因此，提高抗单克隆抗体对的敏感度和特异性，是弥补免疫结合胶体金层析法缺陷的重要手段。技术实现要素：本发明的目的是提供一种灵敏特异的免疫结合胶体金层析法检测转irre的转基因农作物的方法。为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞对，其中，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmccno.12270；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmccno.12271。再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmccno.12270；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmccno.12271。再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体对在检测转irre的转基因农作物中的用途。再一方面，本发明还提供了一种免疫胶体金试纸，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有质控线(c线)和检测线(t线)，所述c线上包被有抗鼠igg的抗体，所述t线上包被有第一单克隆抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成单克隆抗体对，其中，所述单克隆抗体对为如上所述的单克隆抗体对。再一方面，本发明还提供了一种检测转irre的转基因农作物的方法，其中，该方法包括如下步骤：s1、从待检测的农作物中提取全蛋白；s2、对所述全蛋白使用如上所述的单克隆抗体对进行免疫胶体金试纸检测或双抗夹心酶连免疫检测；s3、如果免疫胶体金试纸检测或双抗夹心酶连免疫检测的结果中出现irre的阳性结果，则指示待检测的农作物为转irre的转基因农作物。通过上述技术方案，本发明能够通过免疫胶体金试纸，对irre蛋白的检测取得1ng/ml的灵敏度，对28种非转基因作物和16种不同来源的各种非irre转基因作物也不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物材料保藏本发明的第一杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号为cgmccno.12270，保藏日期为2016年04月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗irre单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明的第二杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号为cgmccno.12271，保藏日期为2016年04月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗irre单克隆抗体杂交瘤细胞株。附图说明附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：图1是实施例1中his-tagirre融合蛋白的表达与纯化结果图。图2是实施例2中利用胶体金产生的信号颜色深浅，进行定性或半定量检测的结果图。图3是实施例2中利用胶体金产生的信号颜色深浅，对28种非转基因作物和16种不同来源的各种转基因作物(表1)做了特异性检测实验的结果图。图4是免疫胶体金试纸的组装结构示意图。附图标记说明1样品垫2被衬底板3胶体金垫4t线5c线6纤维素膜7吸收垫具体实施方式以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞对，其中，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmccno.12270；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmccno.12271。再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmccno.12270；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmccno.12271。再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体和如上所述的单克隆抗体对在检测转irre的转基因农作物中的用途。其中，可选地，所述农作物为花椰菜、油菜、棉花、玉米、水稻或大豆。其中，所述irre蛋白是指irre基因所编码的蛋白，irre基因是指ncbigeneid为1798483的基因(基因编号：dr_0167)。再一方面，本发明还提供了一种免疫胶体金试纸，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有c线和t线，所述c线上包被有抗鼠igg的抗体，所述t线上包被有第一单克隆抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成配对单克隆抗体。其中，所述配对单克隆抗体为如上所述的单克隆抗体对。其中，所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmccno.12270；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmccno.12271。其中，免疫胶体金试纸的检测原理可能包括：将待检样品滴入样品垫中，若样品中有irre蛋白，待检样品中irre蛋白先和胶体金标记的第二单克隆抗体结合，由于毛细管作用，irre蛋白和胶体金标记的第二单克隆抗体形成的复合体沿基膜向前泳动，到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素基膜上的第一单克隆抗体，由于第一单克隆抗体和第二单克隆抗体分别能结合irre蛋白的不同抗原表位结合，从而形成“胶体金标记的第二单克隆抗体-irre蛋白-第一单克隆抗体”复合体，从而使得胶体金富集在检测线上，形成特异性的红色层析线；没有和irre蛋白结合的胶体金标记的第二单克隆抗体则会直接通过检测线，达到质控线后被质控线上的羊抗鼠igg捕获，从而使得胶体金富集在质控线上形成红色层析线，即判为阳性结果；若样品中无irre蛋白，由于无法在检测线上形成“胶体金标记的第二单克隆抗体-irre蛋白-第一单克隆抗体”复合体，从而使得检测线上不会产生肉眼可见的颜色反应，没有和irre蛋白结合的胶体金标记的第二单克隆抗体则会直接通过检测线，达到质控线后被质控线上的羊抗鼠igg捕获，从而使得胶体金富集在质控线上形成红色层析线，即判为阴性结果。本发明中，使用保藏编号为cgmccno.12270的杂交瘤细胞株和保藏编号为cgmccno.12271的杂交瘤细胞株分别制备和纯化第一单克隆抗体和第二单克隆抗体的方法可以为本领域常规的方法，例如小鼠腹水法和亲和层析法。本发明中，将单克隆抗体进行胶体金标记的方法可以为本领域常规的方法，例如可以包括：将0.01重量％的haucl4溶液加热煮沸后加入1重量％的柠檬酸三钠溶液直至溶液的颜色完全变为透明的红色时，继续回流10min后停止加热，冷却至室温，即得到胶体金；取1ml制取好的胶体金，用1重量％的k2co3调节ph值到8.0，加入15μg单克隆抗体，混合均匀，室温反应40min；加入5重量％的bsa至终浓度为0.1重量％，静置30min；先用低速(1500×g)离心15分钟，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀；然后用10000×g离心30分钟；仔细吸出上清，沉淀物用0.1ml含1％bsa的0.1mpbs(ph7.4)复溶，加入5％叠氮钠至终浓度为0.05％，4℃保存。本发明中，制备免疫胶体金试纸的方法可以为本领域常规的方法，例如可以包括：用喷金点膜机将第一单克隆抗体和羊抗鼠igg喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测t线和质控c线，然后烘干；将胶体金标记的第二单克隆抗体用喷金点膜机均匀的喷在金标垫上；然后将样品垫、金标垫、喷有t线和c线的基膜(硝酸纤维素膜)和吸水纸依次连接组装，而后裁切包装备用。可选地，其中，所述金标垫中所含有胶体金标记的第二单克隆抗体是由5-100μg/ml胶体金标记的第二单克隆抗体溶液以0.5-5μl/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金标垫上干燥后得到的。可选地，其中，所述t线上包被的第一单克隆抗体是由0.2-5mg/ml的第一单克隆抗体溶液以0.2-4μl/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在t线上干燥后得到的。可选地，其中，所述c线上包被的羊抗鼠igg的抗体是由0.2-5mg/ml的羊抗鼠igg的抗体溶液以0.2-4μl/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在c线上干燥后得到的。再一方面，本发明还提供了一种检测转irre的转基因农作物的方法，其中，该方法包括如下步骤：s1、从待检测的农作物中提取全蛋白；s2、对所述全蛋白使用如上所述的单克隆抗体对进行免疫胶体金试纸检测或双抗夹心酶连免疫检测；s3、如果免疫胶体金试纸检测或双抗夹心酶连免疫检测的结果中出现irre的阳性结果，则指示待检测的农作物为转irre的转基因农作物。根据如上所述的方法，可选地，其中，所述农作物为花椰菜、油菜、棉花、玉米、水稻或大豆。以下通过实施例进一步详细说明本发明：实施例1irre蛋白的诱导表达与纯化。根据已公布的耐辐射异常球菌基因组序列信息，设计特异性引物扩增目的基因片段。利用天根细菌基因组提取试剂盒提取耐辐射异常球菌基因组dna。以提取和纯化后的耐辐射异常球菌基因组dna为模板，利用特异性引物irre(f)/irre(r)进行pcr反应，扩增耐辐射异常球菌irre基因序列，pcr反应中利用高保真聚合酶进行扩增，以确保dna片段的准确性。pcr所用的引物为irre(f)：5’-cacaggaggaccccatatgcccagtgc-3’(seqidno.1)和irre(r):5'-accaagcttagttcactgtg-3'(seqidno.2)。pcr产物上下游分别含有ndei和hindiii限制性内切酶酶切位点。将获得的pcr产物纯化回收后，利用限制性内切酶ndei和hindiii进行双酶切消化。同样的利用限制性内切酶ndei和hindiii进行双酶切消化大肠杆菌高表达载体pet28a。将上述酶切产物进行纯化回收，在t4dna连接酶作用下进行连接，连接产物通过热激转化进入常用蛋白表达宿主菌株bl21(de3)中，并将重组菌株涂布于含有卡那霉素的lb固体培养基上。挑取若干单菌落按顺序转接同样的抗性平板，并同时转接含有抗生素的lb液体培养基中培养，提取菌体中含有的质粒dna进行酶切和pcr验证；实验中同样利用菌落pcr技术对重组菌株进行验证。得到的正确重组质粒pet-irre经过dna测序做进一步验证。测序结果显示irre基因的编码序列如seqidno.3所示，其编码的蛋白氨基酸序列如seqidno.4所示。seqidno.4为：mpsanvsppcpsgvrgggmgpkakaeaskphpqipvklpfvtapdalaaakarmrdlaaayvaalpgrdthslmagvpgvdlkfmplgwrdgafdpehnvilinsaarperqrftlaheighaillgdddllsdihdayegerleqvietlcnvaaaailmpepviaemlerfgptgralaelakraevsassalyalteqtpvpviyavcapgkppreqaasdedagpstekvltvrassstrgvkytlasgtpvpadhpaalalatgmevreesyvpfrsgrkmkaevdaypsrgivavsfefdparlgrkdseqadrdepqdaaq；具体参见序列表。seqidno.3为：atgcccagtgccaacgtcagccccccttgcccctctggggtaaggggcggggggatggggccaaaagctaaagctgaagcctccaagccccacccccaaatccctgttaagctcccattcgtgaccgcccccgacgccctcgccgccgccaaagccaggatgcgcgacctggcggcggcctacgtggcggccctgcccggacgcgacacccacagcctgatggcgggggtgcccggcgtagacctcaaattcatgccgctcggctggcgcgacggggcgttcgaccccgagcacaacgtcatcctcatcaactcggcggcccgccccgaacgccagcgcttcaccctcgcccacgaaatcgggcacgcgattttactcggcgacgacgacctgctctccgacatccacgacgcctacgagggcgagcggctcgaacaggtcatcgaaacgctgtgcaacgtggcggcggcggcgattttgatgcccgaacccgtcatcgcggaaatgctggaacgcttcggccccaccgggcgcgccctcgccgaactcgccaagcgggccgaagtcagcgcgtcgtcggcgctctacgccctgaccgagcagaccccggtgcccgtcatctacgcggtctgtgcgccgggcaagcctccgcgtgagcaggccgcaagcgacgaggacgctggcccaagcacagaaaaagtcctgacggtccgcgccagcagctcgacgcggggcgtcaagtacaccctggcgagcggcacgccggtacccgccgaccacccggcggcgcttgccctcgccacgggcatggaagtgcgcgaggaaagctacgtgccctttcgctcgggccggaaaatgaaggcggaggtggacgcctacccgtcgcgcggcatcgtggccgtcagtttcgagttcgaccccgcccgcctgggccgcaaggacagcgagcaggccgaccgggacgagccgcaggacgctgcacagtga；具体参见序列表。构建的高效表达irre蛋白的载体pet-irre中的基因含有终止密码子，表达的融合irre蛋白的氨基端携带有6his-tag可用于蛋白的分离纯化。将含有重组质粒pet-irre的bl21(de3)菌株活化后转接于新鲜的培养基中。菌株生长到od值为0.6左右，向培养基中加入终浓度分别为0.5mm的iptg，16℃培养12h，诱导细胞表达irre蛋白。利用irre融合蛋白氨基末端含有的his-tag，采用ni-nta偶联的nta树脂进行亲和层析纯化该融合蛋白。收集40mm咪唑洗脱液脱液中的目的蛋白，经过sds-page检测，结果如图1所示。图1中，泳道m为分子量标记，泳道1为对照菌株全细胞蛋白；泳道2为iptg诱导后表达irre细胞可溶性蛋白；泳道3为iptg诱导后表达irre细胞不可溶蛋白；泳道4为可溶蛋白上样流出液；泳道5为nta-0洗脱液；泳道6为纯化后的his-tagirre融合蛋白，可见纯度较高。实施例2irre蛋白单克隆抗体的制备及鉴定将8w+的balb/c雌小鼠按剂量分为四组，按剂量50、100、150、200μg/只(即实施例1得到的irre蛋白)进行免疫，共免疫3次。初次免疫前取眼血作为阴性对照，初次免疫时加等体积福氏完全佐剂皮下多点注射；以后隔四周进行一次免疫，以相同剂量重组抗原加等体积福氏不完全佐剂皮下多点注射。第三次免疫结束后10天左右用重组抗原包被elisa板，用间接elisa测定小鼠血清的抗体效价；融合前三天对抗体效价最高的(1:105以上)小鼠尾静脉注射50μg重组irre蛋白加强免疫。加强免疫三天后进行细胞融合。细胞融合前一天，按照以下方法制备饲养层细胞：1)将8w+健康雄性balb/c小鼠，拉颈处死后，于75％乙醇浸泡3-5min；2)移至超净台内，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，并用75％乙醇消毒其腹膜；3)用止血钳轻轻拉起腹膜，将10ml预温的1640液体培养基用注射器注入腹腔，用棉球轻揉腹腔1-2min，吸出细胞悬液，放入离心管中；4)离心：1000×g，5min，弃上清；5)用10ml含血清hat培养基将细胞混匀，细胞计数，调整细胞密度于2×105/ml；6)将此细胞悬液按100μl/孔加入96孔细胞培养板，则细胞密度为2×104/孔；7)置37℃，5％co2孵箱培养，供次日融合实验用。骨髓瘤细胞sp2/0的制备：1)收获对数生长期sp2/0细胞，用1640液体培养基洗涤3次，1000×g离心5min，弃上清；2)用1640液体培养基重悬细胞。取100μl细胞悬液，以0.2％台盼蓝染色，进行细胞计数，要求细胞活力>95％，并调整细胞密度待用。脾细胞悬液的制备：1)将3天前经过冲击免疫的balb/c小鼠摘除眼球放血，断颈处死，于75％乙醇浸泡2min；2)移至超净台内，剪开腹部皮肤向两侧剥离，暴露腹壁；换剪刀、镊子，剪开腹膜，取出脾脏，去掉脂肪和结缔组织，用1640培养基冲洗；3)将脾脏置于200目的筛网上，一边用注射器芯轻轻地研磨；一边以培养液冲洗，收集脾细胞悬液，离心1000×g，5min，弃上清；4)用1640培养基重悬细胞，离心洗涤2次：1000×g，5min，弃上清；5)用10ml不完全培养基重悬。取100μl细胞悬液，以0.2％台盼蓝染色，要求细胞活力>95％，并计数脾细胞。剩余细胞调整细胞密度待用。细胞融合及培养：1)将脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞以5:1比例混合于50ml离心管中，1000×g离心5min，弃上清，轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散；2)一边均匀转动离心管，一边用吸管滴加37℃预温的1ml50％peg4000，于1min内完成；3)加37℃预热的1640培养基1ml，在1min内完成；4)加37℃预热的1640培养基10ml，在5min内完成；5)800×g离心8min；用100mlhat培养基重悬细胞沉淀；6)按100μl/孔将细胞悬液转移到接种了饲养细胞的细胞培养板中，同时留2孔加未经融合的sp2/0细胞作对照，观察细胞对hat的敏感性。培养板置于37℃、5％co2孵箱中培养；7)融合3天后，每孔补加100μl新鲜的hat培养液。以后每3-5天半量更换hat培养液一次；8)2周后，ht培养基半量换液；9)3-4周后，换完全培养基维持培养。elisa筛选阳性杂交瘤细胞：1)融合后的细胞生长到培养孔底面积的1/4时(培养约12-15天左右)，取上清用间接elisa法检测特异性反应和交叉反应，对杂交瘤细胞进行筛选。重组蛋白irre为包被抗原，包被浓度5μg/ml常规包被elisa板。往包被elisa板中加100μl/孔的细胞培养上清液，用pbs1:100稀释的免疫鼠血清为阳性对照，sp2/0细胞孔培养上清为阴性对照。细胞上清与包被elisa板37℃孵育30min，充分洗涤后加入hrp标记的羊抗鼠igg抗体(1:10000稀释)100μl/孔，37℃孵育30min，弃二抗。充分洗板后每孔加tmb100μl显色15min，每孔再加入50μl1nh2so4终止反应。测定od450值。2)elisa筛选获得98株分泌irre单抗的细胞株；上述98株irre单抗的细胞株所分泌的单克隆抗体均对重组irre蛋白具有阳性反应。选择其中阳性反应最强的37株细胞进一步亚克隆培养，其余细胞株直接扩大培养，冻存和少量生产腹水。有限稀释法进行克隆化培养：1)用移液器将待克隆的细胞吹打混匀，用含20％血清的ht选择培养液稀释至1个细胞/孔的密度，加入已有饲养细胞的细胞板，置5％co2、37℃的培养箱中进行培养；2)培养至第4天时，在倒置显微镜下观察并记录细胞单克隆生长孔；培养1周左右，吸取100μl已变黄的细胞培养液上清，用上述elisa法检测细胞培养上清；3)检测为强阳性的孔内细胞进行2-3次亚克隆，直到最后一次所有仅一个细胞集落生长的培养孔上清elisa检测结果均为阳性为止；4)将最后一次有限稀释后elisa检测结果最好的杂交瘤细胞克隆扩大培养，并冻存。腹水的制备：1)选取10周龄balb/c小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5ml/只；2)7天后，腹腔接种经pbs稀释的培养至对数期的阳性杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/ml杂交瘤细胞；3)5天后观察，当小鼠腹部明显膨胀时，用12号注射针头收集腹水，每隔3天收集一次，直到小鼠死亡；4)将腹水以7000×g，离心10min；留上清分装后-80℃冰箱保存。单克隆抗体的纯化(proteina亲和层析)：1)装柱：用equilibrationbuffer(50mmtris-hcl，150mmnacl，ph8.6)湿润柱子，检查柱子是否堵塞，加5mlproteinaagarose于柱中；2)加入10倍柱体积的equilibrationbuffer平衡柱子；3)缓慢将腹水上样；4)加入10倍柱体积的equilibrationbuffer，按4-5ml/管收集穿透液直至od280<0.1；5)准备收集管，收集洗脱液的试管按500μl/管加入中和缓冲液(20mm磷酸盐缓冲液，ph7.7)；6)用5倍柱体积的elutionbuffer(50mmglycine，0.5mnacl，ph2.3)洗脱，按1.5ml/管收集洗脱液直至od280<0.1；7)用5倍柱体积的equilibrationbuffer洗柱及平衡柱子。单克隆抗体配对筛选：将所获得的98株纯化单抗两两组合，共得到(98×98)对组合，每对组合中的两个抗体分别包被硝酸纤维素膜和标记胶体金，制备胶体金试纸条，通过对irre重组抗原，irre转基因作物的灵敏性筛选，对非转基因作物，非irre转基因作物的特异性筛选，最后筛选出只针对irre高特异性高灵敏性的配对单抗。具体如下：制备胶体金颗粒:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒。具体步骤为:用超纯水将氯金酸配制成0.01％水溶液，取100ml与1.2ml1％的柠檬酸三钠水溶液混合，加热至持续沸腾5min。冷却后用超纯水恢复至原体积，制成颗粒直径约为30nm的胶体金颗粒。确定胶体金标记的抗体最适稳定量：采用经典mey法确定标记1ml胶体金所需要的抗体用量为15μg。硝酸纤维素膜(nc)的包被：用0.0lmph7.2的pbs缓冲液稀释纯化单抗至2mg/ml，用于包被t线，用0.0lmph7.2的pbs缓冲液稀释羊抗鼠igg至lmg/ml，用于包被c线。用biodot公司xyz3050工作系统以30mm/s速度喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测t线和质控c线，37℃烘干。免疫胶体金试纸的组装：将包被了c线5和t线4的硝酸纤维素膜6，吸收垫7，胶体金垫3以及样品垫1依次粘附于不吸水的pvc被衬底板2上，如图4组装成免疫胶体金试纸。单克隆抗体的配对筛选：98株单克隆抗体，一共获得98×98(9604)组配对单克隆抗体，组合成9604种胶体金试纸条。配对筛选时以ddh2o作为阴性样本，重组irre蛋白1μg/ml,转irre油菜种子抽提物0.2g/ml作为阳性样本，转cp4-epsps大豆rrsoybean及转bt玉米bt2836种子抽提物各0.2g/ml作为交叉反应检测样本，对每一种试纸条进行测试。将针对重组irre蛋白，转irre油菜种子抽提物呈阳性反应，而对其它样本呈阴性反应的25株，33对配对单克隆抗体筛选出来作为候选的配对单抗。对于候选的33对配对单抗，进一步筛选检测其对重组irre及转irre作物的检测灵敏度和对其它常见的非转基因作物和非irre的转基因作物的特异性。选择对重组irre蛋白检测灵敏度达到1ng/ml水平，对转irre作物种子检测达到0.2μg/ml水平，与非转基因及非irre转基因作物没有交叉反应的配对单克隆抗体作为制备双抗体夹心法检测试剂盒的配对单克隆抗体。实验最终得到第一单克隆抗体3fk7和第二单克隆抗体6ea2。单克隆抗体亚类的鉴定：利用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒(sigma公司)对各株单抗进行亚类鉴定，具体试验方法如下：1)在酶标板中分别加入1:1000倍pbs稀释的羊抗鼠igg(igm、iga、igg1、igg2a、igg2b和igg3)，100μl/孔，37℃放置1h；2)弃去酶标板中液体，用pbst洗涤3次；3)100μl/孔加入pbs稀释后的纯化单克隆抗体(抗体浓度2-5μg/ml)，室温孵育1h；pbst洗涤3次；4)加入hrp标记的羊抗鼠igg抗体(1:10000稀释)100μl/孔，室温孵育30min。5)充分洗板后每孔加100μltmb，显色15min，每孔再加入50μl1nh2so4终止反应。测定od450值。最终鉴定得到第一单克隆抗体3fk7和第二单克隆抗体6ea2的抗体亚类均为igg1。配对抗体灵敏度评价：筛选到的配对单克隆抗体：第一单克隆抗体3fk7和第二单克隆抗体6ea2，对重组irre蛋白检测灵敏度达1ng/ml；对转irre油菜种子的检测灵敏度可达0.2μg/ml；对转irre油菜叶片有弱反应，如表1，图2所示。表1膜包被抗体(第一单克隆抗体)3fk7胶体金标记抗体(第二单克隆抗体)6ea2ddh2o-rirre1μg/ml+++rirre100ng/ml++rirre10ng/ml++rirre1ng/ml+irre油菜种子0.2g/ml+++irre油菜种子20μg/ml++irre油菜种子2μg/ml+irre油菜种子0.2μg/ml±irre油菜叶片0.2g/ml±配对抗体特异性评价：本实验筛选到的配对单克隆抗体：第一单克隆抗体3kf7和第二单克隆抗体6ea2，对28种非转基因作物和16种不同来源的各种非irre转基因作物(表2)做了特异性检测实验。检测结果如表2及图3示。配对单克隆抗体3fk7-6ea2对所有检测非转基因和非irre转基因作物没有交叉反应。综上所述，配对单克隆抗体3fk7-6ea2制备的检测试纸条对大部分非转基因和非irre转基因作物没有交叉反应。将产3fk7单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行保藏，保藏编号为cgmccno.12270；将产6ea2单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行保藏，保藏编号为cgmccno.12271。表2根据实施例2可以看出，本发明筛选到了一对单克隆抗体，能够通过免疫胶体金试纸，对重组irre蛋白检测灵敏度达1ng/ml，对转irre作物种子的检测灵敏度可达2μg/ml，对28种非转基因作物和16种不同来源的各种非irre转基因作物也不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>一种检测全局调控因子irre蛋白及其转基因农作物的金标试纸条<130>8990caas_b<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cacaggaggaccccatatgcccagtgc27<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2accaagcttagttcactgtg20<210>3<211>987<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3atgcccagtgccaacgtcagccccccttgcccctctggggtaaggggcggggggatgggg60ccaaaagctaaagctgaagcctccaagccccacccccaaatccctgttaagctcccattc120gtgaccgcccccgacgccctcgccgccgccaaagccaggatgcgcgacctggcggcggcc180tacgtggcggccctgcccggacgcgacacccacagcctgatggcgggggtgcccggcgta240gacctcaaattcatgccgctcggctggcgcgacggggcgttcgaccccgagcacaacgtc300atcctcatcaactcggcggcccgccccgaacgccagcgcttcaccctcgcccacgaaatc360gggcacgcgattttactcggcgacgacgacctgctctccgacatccacgacgcctacgag420ggcgagcggctcgaacaggtcatcgaaacgctgtgcaacgtggcggcggcggcgattttg480atgcccgaacccgtcatcgcggaaatgctggaacgcttcggccccaccgggcgcgccctc540gccgaactcgccaagcgggccgaagtcagcgcgtcgtcggcgctctacgccctgaccgag600cagaccccggtgcccgtcatctacgcggtctgtgcgccgggcaagcctccgcgtgagcag660gccgcaagcgacgaggacgctggcccaagcacagaaaaagtcctgacggtccgcgccagc720agctcgacgcggggcgtcaagtacaccctggcgagcggcacgccggtacccgccgaccac780ccggcggcgcttgccctcgccacgggcatggaagtgcgcgaggaaagctacgtgcccttt840cgctcgggccggaaaatgaaggcggaggtggacgcctacccgtcgcgcggcatcgtggcc900gtcagtttcgagttcgaccccgcccgcctgggccgcaaggacagcgagcaggccgaccgg960gacgagccgcaggacgctgcacagtga987<210>4<211>328<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4metproseralaasnvalserproprocysproserglyvalarggly151015glyglymetglyprolysalalysalaglualaserlysprohispro202530glnileprovallysleuprophevalthralaproaspalaleuala354045alaalalysalaargmetargaspleualaalaalatyrvalalaala505560leuproglyargaspthrhisserleumetalaglyvalproglyval65707580aspleulysphemetproleuglytrpargaspglyalapheasppro859095gluhisasnvalileleuileasnseralaalaargprogluarggln100105110argphethrleualahisgluileglyhisalaileleuleuglyasp115120125aspaspleuleuseraspilehisaspalatyrgluglygluargleu130135140gluglnvalilegluthrleucysasnvalalaalaalaalaileleu145150155160metprogluprovalilealaglumetleugluargpheglyprothr165170175glyargalaleualagluleualalysargalagluvalseralaser180185190seralaleutyralaleuthrgluglnthrprovalprovaliletyr195200205alavalcysalaproglylysproproarggluglnalaalaserasp210215220gluaspalaglyproserthrglulysvalleuthrvalargalaser225230235240serserthrargglyvallystyrthrleualaserglythrproval245250255proalaasphisproalaalaleualaleualathrglymetgluval260265270arggluglusertyrvalpropheargserglyarglysmetlysala275280285gluvalaspalatyrproserargglyilevalalavalserpheglu290295300pheaspproalaargleuglyarglysaspsergluglnalaasparg305310315320aspgluproglnaspalaalagln325当前第1页12