本发明涉及分子生物学实验技术领域，具体而言，涉及一种微量细胞chip法。
背景技术：
生物的基因调控和表达是极其复杂但有序的过程，生物体基因组dna在细胞中以染色质形式存在，蛋白质和dna互作是细胞行使功能的重要基础。因此，研究蛋白质与dna在染色质环境下的相互作用可以进一步了解基因表达及其调控模式。
染色质免疫共沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation,chip)是研究dna-蛋白质在体内相互作用的标准方法。染色质免疫共沉淀技术可以定位分析体内蛋白质与dna的作用位点，运用chip技术与其他方法相结合，例如与高密度芯片(microarray)、测序(sequencing)、体内足迹法等技术相结合可以获得整个基因组水平的单一转录因子分布图谱、反式因子体内结合位点，以及系统揭示核小体定位、组蛋白修饰等表观遗传的遗传机制。
chip技术的一般技术流程为：首先对细胞或组织进行不同时间的甲醛交联，分别裂解细胞膜及细胞核，使用超声方式将染色质打碎成一定长度范围的片段。加入抗体，抗体会特异性地与靶蛋白结合，而后通过磁珠与抗体的相互作用，将靶蛋白及与其结合的dna片段富集。解交联并消化蛋白后，对捕获的dna片段建库，进行第二代测序。根据数据片段在基因组上的富集情况，进而获得全基因组水平的特定蛋白与dna相互作用的图谱。
然而，现有的chip-seq技术主要存在如下问题：
1.建库效率低，不适用于少量细胞实验
利用适当的超声条件获得片段大小合适的dna-染色质复合物是整个染色质免疫共沉淀实验成功的前提，然而使用超声法打断的chip-seq技术对细胞数量有一定的要求，适用于几万至百万数量级的细胞处理。主要原因是传统illumina的truseq建库策略中的adaptor与dna片段连接效率较低，而使得很多片段在后面的扩增集中没有被富集而丢失。尤其当研究的问题需要针对少量细胞群体的时候，严重的信息丢失使得实验者无法获得较为准确的真实信息。
2.超声法打断染色质片段方法不利于与dna间接结合的转录因子的研究
全基因组范围内，有很多转录因子不是与基因组dna直接结合的，而是与其他转录因子结合后，间接地结合在基因组dna上。即使是甲醛交联过的样品，这种间接结合也比较容易被破坏。超声过程具有一定程度的物理破碎强度，容易干扰这些间接结合靶蛋白与dna结合的稳定性，而造成后续信息的丢失。
3.文库非特异性背景较高，检测分辨率低
超声打断法是对染色质进行随机打断，获得一定长度范围内的片段。因此，在靶蛋白及dna复合物的周围也带有一些非靶蛋白特异结合的dna序列或是其他蛋白结合的位点。这些非特异性位点在后面建库测序过程中均会被保存下来，成为靶蛋白图谱分析的干扰背景，获得宽峰，降低了检测结合位点的分辨率和准确性。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明涉及一种微量细胞chip法，包括：
1).将待检测细胞样品分为n组，n为非0自然数；
2).将第n组样品交联固定；
3).使用细胞膜打孔剂处理所述第n组样品；
4).使用tn5转座酶酶切打断第n组样品的染色质片段，并将barcode序列和引物序列连接在产物片段dna的两端；
当n≥2时，步骤4)中每组所用的barcode序列和/或引物序列不同；
5).当n≥2时，将各组样品合并；
6).富集与靶蛋白结合的dna片段，并用以所述引物作为index建库，测序分析。
染色质免疫共沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation,chip)是研究dna-蛋白质在体内相互作用的标准方法，而在二者有相互作用时，dna通常会从组蛋白上解开，并非以核小体的形式存在。tn5转座酶在酶切染色质片段时，不会酶切核小体形式的dna片段，因而与现有技术的超声打断法相比具有更好的特异性。
barcode序列实质为一段核酸序列，其相当于给被切割下来的dna片段加上不同的标签序列，因而当不同组(n≥2)的样品进行后续测序操作时，可将各组通过其各自特异的barcode序列进行区分。在极限情形下，当每组样品中的细胞数位1个时，本发明所提供的方法能够实现单细胞chip。
基于tn5转座酶(transposase)的barcode复杂度(即能有多少独一无二的barcode)还是比较有限的。为了保证tagmentation的效率，barcode区域不可以过长。同时，为了避免测序错误带来的误识别(如偶尔测错了一个碱基，但却被当成另外一个barcode)，barcode的复杂度也不是4的n次方那么高，需要引入校正机制。总地来说，仅靠tn5来做单细胞，一次往往仅能识别数十到数百个单细胞。本发明采用组合索引(combinatorialindexing)的方法。标签的设定方式为barcode序列+引物序列，从而增加整体的复杂度，增加了一次能够捕获的单细胞数目。当样品不需要进行区分时(n＝1)，引物序列采用通用引物即可，后续建库操作更加方便；当需要区分不同的样品时(n≥2)，则各组的引物序列和/或barcode序列不同，从而能使得各样品得到有效区分。
优选的，对单细胞进行操作的方法可采用为本领域技术人员所公知的方法进行，例如将单细胞悬液样品和带有barcode和/或引物序列的tn5酶的水凝胶珠子，通过微流体芯片，包裹在一个油滴之中。在油滴中进行逆转录之后，每一个单细胞被tn5酶所切割的dna片段，就都会带上了独一无二的标签。最后，我们再将所有单细胞的dna片段混在一起，以所述引物序列建库测序，再通过程序识别barcode，区分单细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)建库效率高，对微量细胞乃至单细胞的组蛋白信息捕获量显著提高；
在tn5酶切时候，将含有barcode序列的引物连接在了产物片段dna的两端，这一高效的引物连接过程使得含有barcode序列的扩增引物连接在目标dna片段两端的效率大大提高，从而在后面扩增过程中捕获了更多的信息量。目前已经在微量细胞(100个)乃至单细胞水平实现了组蛋白结合位点的测序及数据分析，与用传统方法处理大量细胞获得的信息量具有较高的准确性和精确性，并明显降低了非特异性背景(如图2)。尤其单细胞水平的数据，和之前仅有的一篇单细胞chip数据(assafrotem,2015,naturebiotechnology)相比，有了数量级的提高。那篇文章测得数据中，每个细胞平均获得uniquededuplicatesreads800个左右，而利用本发明所提供的技术方案，每个细胞平均获得uniquededuplicatesreads5000个左右。
(2)实现对极微量细胞的转录因子位点捕捉，并保证较好效率；
目前也实现了微量细胞(100个)的转录因子的全基因组位点检测，捕获信号理想，与大量细胞获得的数据相比，具有一定的精确性和准确性。
(3)降低非特异性背景；
在测序结果可视化界面中，可以显著地看到新技术的非特异性背景相比于传统超声方式chip数据的背景有所降低，而且检测富集峰更特异、更显著。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一种实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中barcode序列的位置；
图2为本发明一个实施例中甲醛交联时间、松散染色质结构的反应温度、酶切温度及时间的比较实验结果；图2a显示了不同条件组合下的酶切产物条带大小：图2b柱状图显示了使用交联3min样品进行chip实验的目标dna富集程度；①～④代表不同处理条件(见柱状图上方)；
图3为igv可视化界面比较本发明一个实施例所提供的chip方法和传统超声技术的比较结果；
图4为本发明一个实施例中可视化界面比较单细胞、微量细胞及大量细胞chip结果。
具体实施方式
本发明涉及一种微量细胞chip法，包括：
1).将待检测细胞样品分为n组，n为非0自然数；
2).将第n组样品交联固定；
3).使用细胞膜打孔剂处理所述第n组样品；
4).使用tn5转座酶酶切打断第n组样品的染色质片段，并将barcode序列和引物序列连接在产物片段dna的两端；
当n≥2时，步骤4)中每组所用的barcode序列和/或引物序列不同；
5).当n≥2时，将各组样品合并；
6).富集与靶蛋白结合的dna片段，并用以所述引物作为index建库，测序分析。
优选的，如上所述的微量细胞chip法，所述第n组样品的细胞数目≥1；
在一种实施方案中，1≤所述第n组样品的细胞数目≤1000000；
在一种实施方案中，1≤所述第n组样品的细胞数目≤10000；
在一种实施方案中，1≤所述第n组样品的细胞数目≤5000；
在一种实施方案中，1≤所述第n组样品的细胞数目≤1000。
优选的，如上所述的微量细胞chip法，在步骤1)之后、步骤2)之前还包括：
使用含有sds的溶液松散甲醛交联过的细胞样品中的染色质；
在一种实施方案中，所述含有sds的溶液中sds的浓度为0.1w/v％～1.0w/v％；优选的，所述含有sds的溶液中sds的浓度为0.1w/v％～0.5w/v％；
在一种实施方案中，所述含有sds的溶液为低渗裂解缓冲液；
在一种实施方案中，所述含有sds的溶液中包括以下成分：0.1w/v％～1.0w/v％sds、0.1v/v％～1.0v/v％np-40、1v/v％～10v/v％甘油、10mm～50mmkcl以及20mm～100mmhepes，ph＝7.5～8.3；
在一种实施方案中，所述含有sds的溶液中包括以下成分：0.1w/v％～0.5w/v％sds、0.1v/v％～0.5v/v％np-40、3v/v％～7v/v％甘油、20mm～40mmkcl以及40mm～80mmhepes，ph＝7.7～8.1；
在一种实施方案中，所述使用含有sds的溶液松散甲醛交联过的细胞样品中的染色质的步骤具体包括：
将所述细胞样品使用含有sds的溶液于10℃～37℃下处理5min～60min；
在一种实施方案中，所述使用含有sds的溶液松散甲醛交联过的细胞样品中的染色质的步骤具体包括：
将所述细胞样品使用含有sds的溶液于20℃～37℃下处理20min～40min；更优选为3min～10min。
优选的，如上所述的微量细胞chip法，在步骤2)中，所述交联固定具体为用甲醛进行交联；
在一种实施方案中，甲醛的浓度为0.5v/v％～1.5v/v％，优选为1v/v％；
在种实施方案中，所述交联固定的时间为0.5min～15min，优选为3min～10min，交联温度为室温。
优选的，如上所述的微量细胞chip法，在步骤2)中，所述细胞膜打孔剂具体为含有tritonx-100的溶液；
在一种实施方案中，所述含有tritonx-100的溶液中tritonx-100的浓度为0.5v/v％～2v/v％；
在一种实施方案中，所述含有tritonx-100的溶液中包括如下组份：
0.5v/v％～2v/v％tritonx-100、0.01w/v％～0.05w/v％sds、2mm～20mmedta、100mm～500mmnacl、10mm～50mmtris-hcl，ph＝7.5～8.5；
在一种实施方案中，所述含有tritonx-100的溶液中包括如下组份：
1v/v％～1.5v/v％tritonx-100、0.02w/v％～0.04w/v％sds、5mm～15mmedta、200mm～400mmnacl、20mm～40mmtris-hcl，ph＝7.8～8.2；
在一种实施方案中，所述使用细胞膜打孔剂处理细胞的处理条件为：10℃～37℃孵育5min～60min。
优选的，如上所述的微量细胞chip法，在步骤2)之后、步骤3)之前还包括：
超声处理以打开染色质紧密结构。
优选的，如上所述的微量细胞chip法，所述超声处理的条件为：
140hz～180hz，超声10s～20s；
在一种实施方案中，所述超声处理的条件为：150hz～160hz，超声13s～17s。
优选的，如上所述的微量细胞chip法，在步骤4)中，在所述tn5转座酶酶切的反应体系中包括来自第i组样品染色质、连接有所述barcode序列和所述引物序列的tn5转座酶；
所述tn5转座酶在所述反应体系中的终浓度为：0.01～0.05μl/20μl。
在一种实施方案中，所述tn5转座酶酶切的反应条件为：
10℃～37℃孵育5min～60min；
在一种实施方案中，所述tn5转座酶酶切的反应条件为：
25℃～37℃孵育10min～40min。
优选的，如上所述的微量细胞chip法，在步骤5)之后、步骤6)之前还包括：
对步骤4)或5)所得到的样品离心弃上清，用含有0.01w/v％～0.05w/v％sds的稀释缓冲液重悬沉淀，超声打散沉淀后于0℃～6℃孵育裂解20min～60min，超声处理将目的dna片段从细胞核中释放出来；
在一种实施方案中，所述超声打散沉淀的超声条件为：140hz～180hz，3s～7s；
在一种实施方案中，所述超声打散沉淀的超声条件为：150hz～170hz，4s～6s；
在一种实施方案中，所述超声处理将目的dna片段从细胞核中释放出来的超声条件为：140hz～180hz，每个循环内：10s～20son，20s～40soff；
在一种实施方案中，所述超声处理将目的dna片段从细胞核中释放出来的超声条件为：150hz～170hz，每个循环内：13s～17son，25s～35soff。
优选的，如上所述的微量细胞chip法，在步骤6)中，所述富集与靶蛋白结合的dna片段的方法包括：
加入靶标蛋白对应的抗体孵育后，用偶联proteina的珠子拉取所述抗体，用洗脱液对所述珠子洗脱，对洗脱液进行解交联处理并用蛋白酶k消化处理。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种微量细胞(1～10000个)chip法
(1)用1v/v％浓度的甲醛(室温)交联细胞(交联3min)，通过facs或口挑的方法将细胞收集到10μl含终浓度3w/v％sds的低渗裂解缓冲液(50mmhepes(ph7.9)、30mmkcl、7v/v％glycerol、0.3v/v％np-40、3w/v％sds)中，pcr中37℃孵育3min；
(2)加tritonx-100至终浓度1v/v％(1v/v％tritonx-100、0.03w/v％sds、15mmedta、200mmnacl、30mmtris-hcl，ph＝7.8)，混匀后在pcr仪中37℃孵育40min；
(3)利用q800r非接触式超声仪，进一步辅助打开染色质紧密结构,160hz强度，超声15s；
(4)配制酶切体系进行酶切反应：共20μl，含有由微量细胞处理得来的全部的染色质样品(大概11.2μl)，0.1-1μltn5-complex(由含有不同的barcode序列的单链dna与5’磷酸化的通用单链通用引物序列的dna退火合成，室温下与tn5孵育组装，使得tn5具有较高的活性)，4μl酶切缓冲液(tagmentationbuffer)，加水补齐至20μl。在37℃条件下，反应体系孵育1h；
(5)加入终止液(50-500mmedta)终止反应一定时间，彻底抑制tn5活性；
(6)离心并用含有0.03％sds的稀释缓冲液(0.03w/v％sds、1v/v％tritonx-100、2-20mmedta、10-50mmtris-hcl(ph8.0)、100-500mmnacl)重悬沉淀，4℃裂解半小时，利用非接触式超声仪q800r将染色质片段从细胞核中释放出来(180hz强度,4cycles，每个循环内：15son,30soff。)；
(7)收集样品液后，加入0.6μgmillipore04-745h3k4me3抗体，旋转孵育过夜，第二天用磁珠(dynabeadsproteina)富集，4℃旋转孵育3小时；
(8)清洗磁珠：先用150μlwashingbuffer1(20-200mmnacl、1％tritonx-100、1-5mmedta、10-100mmhepes、0.05-0.5％doc)上下颠倒清洗磁珠，简要离心后置于磁力架上吸附磁珠，弃掉上清液，如此一共清洗3次；而后，使用150μlwashingbuffer2(50-500mmnacl、0.5-5％tritonx-100、1-5mmedta、10-100mmhepes、0.05-0.5％doc)上下颠倒清洗磁珠1次。弃掉上清后，用elutionbuffer(20-200mmtris-hcl(ph8.0)、5-50mmedta、0.3％-3％sds)洗脱dna，70℃解交联过夜，并用蛋白酶k在55℃消化处理至少4小时；
(9)酚氯仿抽提及乙醇沉淀dna后，直接用含有nextera-index的建库引物对dna片段进行扩增，获得文库，测序分析。
实施例2
同实施例1，区别仅在于，在步骤1)中，甲醛交联(fixationtime)的时间为10min。
实施例3
同实施例1，区别仅在于，在步骤1)中，sds处理(opening)的温度为62℃。
实施例4
同实施例2，区别仅在于，在步骤1)中，sds处理的温度为62℃。
实施例5
同实施例1，区别仅在于，在步骤4)中，酶切(tagmentation)的反应条件替换为在55℃条件下，反应孵育的时间为10min。
实施例6
同实施例2，区别仅在于，在步骤4)中，酶切的反应条件替换为在55℃条件下，反应的时间为10min。
实施例7
同实施例3，区别仅在于，在步骤4)中，酶切的反应条件替换为在55℃条件下，反应的时间为10min。
实施例8
同实施例4，区别仅在于，在步骤4)中，酶切的反应条件替换为在55℃条件下，反应的时间为10min。
将实施例1～8在步骤4)酶切后的产物进行电泳，结果如图2所示。图2a电泳图显示了不同条件组合下的酶切产物条带大小，理想条带大小范围为200bp～1kb。图中的insol(insoluble)代表非可溶性染色质，离心后留于沉淀；sol(soluble)代表可溶性染色质，离心后悬于上清液中。由图2a得出结论：3min交联时间优于10min交联时间。图2b柱状图显示了使用交联3min样品进行chip实验的目标dna富集程度。此图明显可以得出结论：37℃松散染色质结构、37℃酶切的条件组合可以获得较理想的chip富集结果。
igv可视化界面比较本发明所提供的itchip和传统超声技术的实验结果见图3。使用1百万(1m)或1万(10k)个细胞的样品，进行h3k4me3-itchip或h3k4me3-sonication-chip(传统超声技术)，组内设计重复性实验组。在igv软件中，比较某些基因位点处(例如kank3,wdr46,vps52等)两种技术捕获的信号值分布，可见itchip的信号值更为显著而特异。
实施例9
本实施例提供了一种单细胞chip法
(1)用1v/v％浓度的甲醛(室温)交联细胞后(交联3min)，口挑单个细胞到10μl含终浓度含终浓度1w/v％sds的低渗裂解缓冲液(50mmhepes(ph7.9)、30mmkcl、7v/v％glycerol、0.3v/v％np-40、1w/v％sds)中，pcr中37℃孵育3min；
(2)加tritonx-100至终浓度0.5v/v％(0.5v/v％tritonx-100、0.03w/v％sds、15mmedta、200mmnacl、30mmtris-hcl，ph＝7.8)，混匀后在pcr仪中27℃孵育60min；
(3)q800r非接触式超声仪轻微松散染色质结构，140hz强度，超声20s；
(4)配制酶切体系进行酶切反应。共20μl，含有11.2μl染色质样品，0.01-0.05μltn5-t5-barcode，0.01-0.05μltn5-t7-barcode，4μl酶切缓冲液(tagmentationbuffer)，加水补齐至20μl。不同细胞加入带有不同barcode组合的tn5酶，10-37℃孵育5分钟-1小时；
具体的t5-barcode及t7-barcode位置如图1所示，引物设计模式参考了文献：sasanamini,naturegenetics,2014；
(5)加入终止液(50-500mmedta)终止反应一定时间，充分抑制tn5活性；
(6)使用移液枪吸打转移，合并单细胞样品到新的1.5mlep管中，4℃，12,000g离心5min后，弃掉上清，保留底部沉淀(其中含有留在核内的染色质片段)，使用含有0.02％sds的稀释缓冲液(0.02w/v％sds、1v/v％tritonx-100、2-20mmedta、10-50mmtris-hcl(ph8.0)、100-500mmnacl)重悬沉淀，利用q800r超声破碎仪打散沉淀(160hz强度,5s)，便于后续充分裂解细胞核。4℃裂解半小时后，利用q800r非接触式超声仪将片段从细胞核中释放出来(140hz强度,4cycles，每个循环内：15son,30soff。)；
(7)收集样品液后，加入0.6μgmillipore04-745h3k4me3抗体，旋转孵育过夜，第二天用磁珠(dynabeadsproteina)富集，4℃旋转孵育3小时；
(8)清洗磁珠：先用150μlwashingbuffer1(配方同实施例1)上下颠倒清洗磁珠，简要离心后置于磁力架上吸附磁珠，弃掉上清液，如此一共清洗3次；而后，使用150μlwashingbuffer2(配方同实施例1)上下颠倒清洗磁珠1次。弃掉上清后，用elutionbuffer(配方同实施例1)洗脱dna，70℃解交联过夜，并用蛋白酶k在55℃消化处理至少4小时；
(9)酚氯仿抽提及乙醇沉淀dna后，直接用含有nextera-index的建库引物对dna片段进行扩增，获得文库，测序分析。
用igv可视化界面比较单细胞、微量细胞及大量细胞itchip，结果如图4所示。esccells和mefcells两个通道显示了单细胞获得有效reads的分布情况；将同类细胞的单细胞数据整合成一个文件，即“aggesc”和“aggmef”，可从整体角度审视单细胞数据；可见，单细胞数据的信号分布与微量细胞及大量细胞具有极高的一致性及特异性，性噪比较高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。