本发明涉及一种含硒光敏剂及其制备方法和应用，属于生物医药领域。
背景技术：
上皮癌是皮肤癌的一种，其主要特征是：初起为疵状隆起肿块，基底坚硬，表面粗糙如菜花状，可见毛细血管扩张，顶部常见钉刺样的角质。
光动力学疗法(Photodynamic Therapy，PDT)是一种联合光、光敏剂和组织中氧分子，通过光动力学反应选择性破坏病变组织以达到治疗目的的无创或微创全新治疗技术。PDT是一门正在研究发展中的治疗肿瘤和其他良性疾病的新兴医学学科，是继手术、放疗、化疗及免疫疗法等肿瘤传统疗法之后的又一种肿瘤新疗法。它是基于光敏剂在正常组织和目标组织中浓度的差异，以及通过空间限制和聚焦的方式使光对目标组织直接照射。光敏剂注射后积聚在目标组织，在积聚期间，用光直接照射目标组织以活化光敏剂，活化的光敏剂将能量传递给基态氧(3O2,3∑g-)从而形成各种形式的活性氧，损伤细胞重要的结构和功能，进而导致组织的破坏。
PDT在很大程度上依赖于光疗药物(光敏剂)。光动力疗法的提出、发展及应用都是随着光敏剂的发展而逐渐完善的。理想的光敏剂应具备以下特点：1)性质稳定、结构明确；2)在光照时具有强的光毒性，对机体毒性低；3)在靶组织内有选择性高，而又不滞留过久；4)光敏化力强，所产生的三线态氧产量、寿命长；5)在光疗窗口(600-900nm)有强吸收以利于治疗时采用对人体组织穿透较深的光源；6)在生理pH值可溶解。但是，目前的光敏剂仍存在着很多的不足，例如摩尔吸光率较低，不能充分地将光转换为细胞毒性物质，富集效果有一定的局限性等。如论文(刘明辉,刘俊宏,韩贵焱,张星杰,盛春泉,姚建忠.二氢卟吩p6-13,15-环酰亚胺类光敏剂的设计合成[J].药学实践杂志,2017,35(01):26-30+35.)虽然提取的二氢卟吩p6-13，15-环酰亚胺衍生物其最大吸收波长达到698nm，具有相对更强的组织穿透深度，可是并没有结合生物体的代谢特点进一步设计优化。
细胞凋亡，是一个多因素参与的生理过程，涉及到免疫应答、基因调控、信号传导等多种过程。凋亡在多种正常生理过程中可起到调节作用，若此功能出现异常或缺失则可导致一系列病理情况发生。肿瘤细胞的特征之一就是缺乏这种程序性的死亡过程。英国科学家Hickman J A等首次提出可以将诱导肿瘤细胞凋亡作为以后肿瘤治疗研究的主要目标和手段，随后诱导肿瘤细胞凋亡成为肿瘤治疗研究的新途径，也同样成为筛选抗癌药物的新靶点、新热点。
内质网是具有重要功能的细胞器，是真核细胞蛋白质合成，钙离子贮存以及脂肪质生成的主要场所。内质网的功能状态对蛋白质折叠、成熟及运转至关重要。细胞状态的改变可以干扰内质网的正常功能，使内质网功能紊乱，蛋白质出现错误折叠并与未折叠蛋白在腔内聚集，以及钙平衡紊乱都将引起内质网应激。ASK/JNK信号通路是内质网应激中的3条重要信号之一，活化ASK/JNK信号通路，使细胞产生内质网应激，提高Bip和Chop蛋白的表达，增加促凋亡和氧化蛋白的产物，诱导细胞凋亡。因此可以通过激活肿瘤细胞的ASK/JNK信号通路引起内质网应激，从而诱导细胞的凋亡。
如何对抗肿瘤的生长已经成为了当下的研究热点，但是仍然存在着一些问题，如专利，申请号：CN201611022732.6，公开号：CN106632195A的一种山牡荆抗肿瘤化合物的研究方法，其中提到的提取山牡荆中抗肿瘤化合物的方法并没有结合肿瘤的特异的代谢特点提高其化合物的作用于肿瘤的精度。
利用PDT通过凋亡途径来治疗肿瘤有着许多优点，如：(1)创伤小；(2)毒性小；(3)选择性好；(4)适用性好；(5)重复性好；(6)可姑息治疗；(7)可消灭隐性癌病灶；(8)可保护容貌及重要器官功能等。目前，PDT已逐步成为肿瘤常规治疗手段之一，它可通过直接杀伤肿瘤细胞、破坏肿瘤脉管系统以及激活机体抗肿瘤免疫等多种机制，实现对肿瘤的高效治疗；细胞凋亡也可以增强以细胞信号转导为靶点的抗肿瘤药物作用等。因此利用光敏剂如何控制光动力治疗过程中的凋亡，提高光动力的疗效是一个值得研究的课题。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是，针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种既可以产生大量活性氧来破坏肿瘤细胞又可以通过抑制肿瘤血管生成来抑制肿瘤生长的一种副作用小、见效快的新型光敏剂。
本发明的技术方案是，提供一种含硒光敏剂，所述光敏剂的结构式为：
在上述光敏剂的结构式中，O原子与O原子，以及O原子与N原子之间的虚线表示氢键。
本发明还提供一种上述含硒光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将乙酸和α,β-四氢吡咯甲酸乙酸在乙醇(优选市售95％的乙醇)中溶解，在50-70℃下反应，得到中间产物A，所述中间产物A的结构式为：
(2)将和中间产物A在含苯的有机溶剂蜜蜂加热反应6-12小时得到中间产物B，其中反应温度为200℃；中间产物B的结构式为：
(3)将中间产物B和在苯胺中加热搅拌，逐渐加入碱调节pH至6.5-7.2，反应5-7小时，反应混合物经萃取、纯化得到所述含硒光敏剂。
优选地，步骤(1)中，乙酸和α，β-四氢吡咯甲酸乙酸的摩尔比为1：1-1.5。
优选地，步骤(2)中，和中间产物A的摩尔比为1:1.5-2。
优选地，步骤(3)中，中间产物B和的摩尔比为2.5-3:1。
优选地，步骤(3)中，所述碱为氢氧化钠。
本发明还提供所述含硒光敏剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为皮肤癌。
优选地，所述皮肤癌为上皮癌。
治疗肿瘤药物中包括光敏剂和辅助添加物；所述含硒光敏剂在药物的组合物中的重量百分含量为0.01～9.99％，优选0.01～0.25％。
所述辅助添加物包含药物上可接受的赋形剂或辅料。所述辅料或赋形剂包括但不限于甘露醇、亚硫酸氢钠、淀粉、糊精粉、无水乙醇、注射用水、糖粉、乳糖、羟丙甲纤维素、硬脂酸镁、蔗糖、聚维酮K30。
本发明的有益效果是，本发明紧密结合肿瘤的生物学特点，首次合成了具有抗肿瘤血管生成效果的新型含硒类光敏剂，其用于皮肤鳞癌的治疗中，效果显著，剂量远低于市场上用的5-ALA，且不含抗生素、不产生耐药性、副作用小、安全无毒且经济实用。并且，由于光线的穿透作用有限和一些其他因素，即使没有产生光动力反应的肿瘤组织也可以通过抑制肿瘤血管生成来达到治疗肿瘤的效果。
附图说明
图1表示含硒光敏剂的化学结构式。
图2表示含硒复合光敏剂的氢谱。
图3表示含硒新型光敏剂的碳谱。
图4表示A431鳞癌细胞流式细胞图。
图5表示凋亡相关蛋白免疫细胞荧光结果图
图6表示细胞内质网应激相关蛋白Western Blot结果图。
图7表示细胞内质网应激信号通路相关蛋白Western Blot结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：光敏剂EtNBSe-PDT的合成
EtNBSe-PDT的合成方法包括以下步骤：
(1)将乙酸和α，β-四氢吡咯甲酸乙酸在95％乙醇中溶解，得到含有中间产物A，其反应过程如下：
其中乙酸和α，β-四氢吡咯甲酸乙酸的摩尔比为1：1-1.5，反应温度为：50-70℃。
(2)将和步骤(1)得到的中间产物A在含苯的有机溶剂中密封加热反应6-12小时得到中间产物B，反应温度约为200℃，其反应过程如下：
(3)将步骤(2)所得到的中间产物B和在苯胺中加热搅拌，逐渐加入氢氧化钠调节PH至6.5-7.2，反应5-7小时后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，硅胶柱色谱分离纯化，得到最终产物，其反应式为：
其中前后两反应物的摩尔比为2.5-3：1。
终产物即含硒光敏剂的结构式如图1所示，其核磁氢谱、碳谱分别如图2和图3所示。
实施例2 EtNBSe-PDT使上皮癌产生凋亡实施例
Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。因此Annexin V和PI联合使用能同时对活细胞和死细胞染色。根据流式细胞图分析，在EtNBSe-PDT的作用下，凋亡细胞数较空白组明显增加，证明了EtNBSe-PDT能够通过诱导肿瘤细胞凋亡，以达到抗肿瘤的目的。
(1)实验方法
鳞癌细胞A-431细胞系培养于10％小牛血清的DMEM培养液中，添加100IU/L的青霉素和100mg/L的链霉素，置于37℃，5％CO2的恒温培养箱中常规培养，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，PBS液冲洗两次，再用0.25％的胰酶和0.02％的EDTA消化5分钟，再分瓶培养，2至3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。
取对数生长期的A-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于5％CO2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，分别加入400nM蒸馏水，400nM EtNBSe，孵育1h后，用20J/cm2的红光照射15min，16h后用Annexin V–PI染色，通过FACSCalibur flow cytometer观察细胞发生凋亡的情况。
(2)实验结果
流式检测结果显示，A-431细胞经过EtNBSe-PDT后16h产生的细胞凋亡比空白组增加了42.3％(图4)。400nM EtNBSe-PDT能明显诱导细胞产生凋亡。
实施例3EtNBSe-PDT诱导细胞凋亡和内质网应激实施例
ASK/JNK信号通路是内质网应激中的三条重要信号之一，启动ASK/JNK信号，能明显促进细胞产生内质网应激，并且提高GADD153和GRP78的表达量，说明内质网应激产生。Caspase-3是细胞凋亡的重要指标，Caspase-3表达增加是细胞产生凋亡的重要标志。根据免疫细胞萤光结果图，在EtNBSe-PDT作用下，Caspase-3和Bcl-2表达量发生相应变化，提示细胞凋亡增加；根据Western Blot结果图，在EtNBSe-PDT作用下，ASK/JNK信号相关蛋白相应改变，ASK/JNK信号被激活，内质网应激产生。说明EtNBSe-PDT能明显激活ASK/JNK信号，并且通过ASK/JNK信号诱导细胞产生内质网应激和凋亡。
(1)实验方法
鳞癌细胞A-431细胞系培养于10％小牛血清的DMEM培养液中，添加100IU/L的青霉素和100mg/L的链霉素，置于37℃，5％CO2的恒温培养箱中常规培养，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，PBS液冲洗两次，再用0.25％的胰酶和0.02％的EDTA消化5分钟，再分瓶培养，2至3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。
取对数生长期的A-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于5％CO2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，分别加入等量的蒸馏水和400nM EtNBSe药剂，孵育1h后，用20J/cm2的红光照射15min，16h后收集细胞提取总蛋白用Western Blot法检测细胞中GADD153和GRP78。
取对数生长期的A-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于5％CO2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，加入等量的蒸馏水和400nM EtNBSe药剂孵育1h后，用20J/cm2的红光照射15min，16h后用收集细胞进行免疫荧光染色，观察细胞Caspase-3表达量变化。
取对数生长期的A-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于5％CO2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，分别加入等量的蒸馏水、100nM EtNBSe、200nM EtNBSe药剂和400nM EtNBSe，孵育1h后，用20J/cm2的红光照射15min，0.5h后收集细胞提取总蛋白用Western Blot法检测细胞中p-ASK和p-JNK表达量变化。
(2)实验结果
细胞免疫荧光实验也明显的说明400nM EtNBSe-PDT能明显促进Caspase-3表达量的增加(图5)，说明400nM EtNBSe-PDT能明显促进细胞凋亡。Western Blot结果分析发现，400nM EtNBSe-PDT能明显促进细胞的GADD153和GRP78表达量增加(图6)，说明400nM EtNBSe-PDT能明显诱导细胞产生内质网应激。
梯度EtNBSe-PDT处理细胞对p-ASK和p-JNK表达量变化的Western Blot结果显示，0-400nM EtNBSe-PDT能明显促进p-ASK的增加，而EtNBSe-PDT对p-JNK的激活作用需要EtNBSe的剂量达到400nM才比较明显，但总的来说EtNBSe-PDT能明显激活ASK/JNK信号，并且通过ASK/JNK信号诱导细胞产生内质网应激和凋亡(图7)。