本发明涉及药物筛选领域，具体是涉及一种基于单分子dna定量技术的临床前化疗药物筛选方法。
背景技术：
临床肿瘤治疗中，由于遗传背景的差异，不同类型的肿瘤对化疗药物的敏感性不同，即使同一类型的肿瘤，甚至其临床分期或病理类型也相同，不同的患者对药物的敏感性及预后也不相同，因此决定了必须化疗药物个体化，主要包括药物选择的个体化和药物剂量的个体化。近年来，相关国际学术组织，如美国临床肿瘤学会(asco)，美国放射肿瘤学会(astro)、欧洲内科肿瘤学会(esmo)、亚洲临床肿瘤学会(acos)和中国医师协会肿瘤医师分会(caco)均指出：开展化疗药物选择、预测疗效和不良反应的检测项目，并实现分子标志物检测标准化和规范化，是一项意义重大的紧迫任务。
随着肿瘤生物学和遗传学的发展，国内外学者不断寻找着准确可靠、简便易行的体内外预测肿瘤化疗药物敏感性的检测方法，先后建立了肿瘤细胞体外培养的增殖试验，肿瘤细胞动物移植模型法，类微环境胶原凝胶包埋培养法，微组织块培养法等。但是，这些方法在应用于临床预测抗肿瘤药物有效性或肿瘤对药物的反应性方面，还存在着成功率低、可靠性差，以及指导临床选择化疗药物/方案与临床结果符合率低等问题。因此，寻找更为准确，可靠的化疗药物敏感性试验方法是肿瘤个体化治疗研究的一个重要方向。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于单分子dna定量技术的临床前化疗药物筛选方法，用于个体化药物筛选。
本发明基于单分子dna定量技术的临床前化疗药物筛选方法，步骤如下：
(1)取肿瘤组织，消化，收集单细胞悬液，培养；
(2)在实验组中添加不同浓度的待筛选药物至培养体系中，对照组不添加药物，培养，检测肿瘤细胞和非肿瘤细胞的数量，确定药物的抗肿瘤活性和毒性；
其中，检测肿瘤细胞的数量采用如下方法：
a、取细胞，提取细胞dna；
b、采用ddpcr检测肿瘤靶基因和参考基因的拷贝数，得肿瘤靶基因拷贝数ntar以及参考基因拷贝数nref；
c、照下列公式计算肿瘤细胞和非肿瘤细胞的绝对数量：
总的细胞数＝1/2参考基因拷贝数nref
肿瘤细胞数＝参考基因拷贝数nref－靶基因拷贝数ntar
非肿瘤细胞数＝靶基因拷贝数ntar－1/2参考基因拷贝数nref。
其中，步骤(1)中，所述培养采用go-matrix明胶三维培养体系培养。
所述go-matrix明胶三维培养体系培养包括go-matrix三维培养细胞培养板和细胞培养液；所述细胞培养液包括500mldmem培养基、10％的fbs、500u/ml的青霉素和链霉素、2mm的l-谷氨酰胺以及1mm的丙酮酸钠。
其中，步骤(2)中，培养的时间为48～96h.
其中，步骤a中，dna提取方法如下：
1)去除细胞培养液，用pbs洗涤细胞2次；
2)加入碱性细胞裂解液；
3)加入密封油以防止裂解液蒸发，95℃孵育30min；
4)加入中和溶液，1000rpm缓慢离心10min；
5)收集上清液，采用透析法去除盐及其他污染成分，获得细胞dna样品。
其中，步骤b中的详细步骤如下：
将细胞dna样品、引物、探针和ddpcrsupermix混合后，取20μl加入到反应板中；
将反应板放入微滴发生器中，激发产生乳化液；
吸取乳化的dna样品到96孔pcr板中，采用px1pcr密封剂封板，然后放入扩增仪扩增；
将扩增后的pcr板放入qx100微滴检测仪，设置相关参数后进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0；
利用ddpcr软件对获得的检测结果进行分析。
其中，步骤(2)中，所述肿瘤靶基因为nf1基因；所述参考基因为rpp30基因。
其中，步骤(2)中，确定药物的抗肿瘤活性和毒性是通过计算ic50和cc50来确定。
本发明方法的优势：
1.本专利中所建立的go-matrix明胶三维培养系统，是最接近于体内微环境的原代细胞培养模型。
2.本专利是国内外首次利用最新的单分子dna定量技术-ddpcr系统，通过检测化疗药物处理肿瘤原代混合培养物后，肿瘤细胞和非肿瘤细胞的靶基因拷贝数变化，精确分析药物对肿瘤细胞和非肿瘤细胞效果的差异性，筛选对肿瘤治疗具有特异性的药物，是在总结自身工作基础上进行的重要创新。
3.与以往的体外肿瘤药敏试验相比，本专利中建立的d-spect方案还具有以下优势：(1)d-spect使用肿瘤细胞和非肿瘤成分混合培养物进行分析，比纯肿瘤细胞药敏试验更接近于体内肿瘤的生长和发育情况；(2)以往的体外肿瘤药敏试验需要培养高比例的肿瘤细胞，而对于d-spect，无论混合培养物中肿瘤细胞比例多少均能检测；(3)d-spect只需少量细胞即可进行检测分析，因此对一个样本可以使用更多药物进行研究；(4)d-spect在评价药物效果的同时，可以分析药物治疗前后细胞遗传学的改变；(5)d-spect简便、快速，费用相对较低，更适合肿瘤个体化治疗中化疗药物的高通量筛选测试。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1d-spect定量检测肿瘤基因和参考基因拷贝数结果
图2化疗药物反应曲线示意图
具体实施方式
实施例1本发明基于单分子dna定量技术临床前化疗药物筛选方法
一、实验方法
1.原代细胞培养
将新鲜切除的肿瘤组织用含有中性蛋白酶和胶原蛋白酶的培养基进行消化，收集单细胞悬液培养于go-matrix明胶三维培养体系，包括go-matrix三维培养细胞培养板(96孔，bio-byblos公司)和细胞培养液[包括500mldmem培养基(gibco公司)、10％的fbs(gibco公司)、500u/ml的青霉素和链霉素(gibco公司)、2mm的l-谷氨酰胺(gibco公司)、1mm的丙酮酸钠(biochrom公司)]。
2.化疗药物处理
待三维培养体系中培养的原代细胞生长达到20000-40000个后，更换药物培养基(多个化疗药物的5-10个浓度梯度)，继续培养48h和96h。
3.细胞dna的提取
由于培养的细胞在药物处理后会有数量下降，尤以高浓度药物处理组最为明显。为防止细胞dna的损失，我们建立了快速、简便的细胞dna提取方法，操作步骤如下：
(1)去除细胞培养液，用pbs洗涤细胞2次；
(2)加入50μl碱性细胞裂解液(25mmnaoh,0.2mmedta)；
(3)加入20μl密封油(biorad)以防止裂解液蒸发，95℃孵育30min；
(4)加入50μl中和溶液(40mmtris-hcl,ph4.0)，1000rpm缓慢离心10min；
(5)收集上清液，采用透析法(vs型millipore滤膜，直径25mm，孔径0.025μm)去除盐及其他污染成分，获得细胞dna样品。
4.ddpcr检测和数据分析
利用ddpcr技术分析提取到的细胞dna样品，计算不同浓度药物处理组和对照组的肿瘤细胞和非肿瘤细胞靶基因拷贝数，主要检测步骤如下：
(1)将25μlddpcr扩增混合液加入到反应板中，该混合液包括引物/探针混合物。
比如，肿瘤细胞靶基因为nf1基因，非肿瘤细胞靶基因为rpp30时，混合物为：
(nf1基因引物<f:5’-ccacaagatgtcagctattgtcctg-3’，r:5’-gttaaaataaataaaaccttactgtg-3’>由fam荧光标记<dhsacp1000177，17：29654623-29654745>；rpp30基因引物<f：5'-cagatgttgggtactaatgac，r：5'-ccaggtatcttcaggtaaagtg>由hex荧光标记<dhsacp2500350，ch10：92660373-92660495>)2μl，dna模板5μl，ddpcrsupermix18μl；以上引物和荧光探针均购至bio-rad公司。
(2)将反应板放入微滴发生器(qx100dropletgenerator)中，激发产生乳化液；
(3)吸取乳化的dna样品到96孔pcr板中，采用px1pcr密封剂封板，然后放入扩增仪扩增，扩增条件为：95℃，10min，40个循环；94℃，30s；58℃，60s；98℃，10min；
(4)将扩增后的pcr板放入qx100微滴检测仪检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0；
(5)利用ddpcr软件对获得的检测结果进行分析，1个阳性微滴计为1个基因拷贝，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数即可得出靶分子的起始拷贝数，利用靶基因和参考基因拷贝数，按照下列公式推算肿瘤细胞和非肿瘤细胞的绝对数量。
细胞数量的计算公式如下：
总的细胞数＝1/2参考基因拷贝数(nref)
肿瘤细胞数＝参考基因拷贝数(nref)－靶基因拷贝数(ntar)
非肿瘤细胞数＝靶基因拷贝数(ntar)－1/2nref
5.评价药物选择性和治疗指数
比较不同浓度药物处理组和对照组间，细胞增殖和毒性结果，计算ic50和cc50。同时利用ddpcr检测结果分析不同浓度药物处理组和对照组间，肿瘤细胞和非肿瘤细胞的数量变化，评价药物的特异性，并绘制药物反应曲线。
通过药物处理后肿瘤细胞和非肿瘤细胞的比例变化，绘制治疗指数曲线，评价药物的特异性。
采用本发明方法步骤1～步骤4检测恶性周围神经鞘瘤和成纤维细胞，其拷贝数如图1和下表所示：
表1肿瘤细胞和非肿瘤细胞靶基因和参考基因拷贝数
在对恶性周围神经鞘瘤的分析结果显示，与参考基因相对照(rpp30)，肿瘤细胞中目标基因(nf1)表达降低。说明本发明方法可以有效检测细胞中目标基因的拷贝数。
采用本发明方法(包含步骤1～步骤5)对药物a(尼洛替尼)和药物b(伊马替尼)对恶性周围神经鞘瘤(mpnst)的抑制作用进行检测(肿瘤细胞存在nf1基因杂合性缺失，非肿瘤细胞nf1基因未发生缺失，rpp30在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中均为双等位基因)，结果如图2所示。
由图2可以看出，尼洛替尼对恶性周围神经鞘瘤的抑制作用明显，而伊马替尼则无明显抑制作用，与现有的报道一致，说明本发明方法可以准确筛选化疗药物。