本发明属于生物制药和生物化工技术领域,具体涉及一种右旋龙脑的制备方法。
背景技术:
右旋龙脑又叫做天然冰片,是一种重要的药材。右旋龙脑对于人们中枢神经的兴奋具有重要的调节功效,常被作为药引应用到各种中药的配方中,帮助中药提升其治疗效果。很多名贵的中成药都把它作为主要成分之一,如六神丸、健心片、牛黄上清丸等。右旋龙脑也是一种历史悠久的香料,常用于化妆品以及古龙水等。
目前,右旋龙脑都是从香樟、龙脑樟等植物中提取的,生产成本高,资源稀缺,市场缺口非常大。合成冰片(含有左旋龙脑,右旋龙脑以及异龙脑)一度得到广泛的应用,但是由于其中右旋龙脑的含量比较低(20%左右),其在药物和香料方面的应用价值无法跟天然冰片相比拟。因此探索一种温和、高效、经济的方法制备高纯度的右旋龙脑是非常有意义的。
右旋龙脑,其结构式如下所示:
工业制备右旋龙脑主要是从天然的右旋樟脑出发,还原制备右旋龙脑。主要是通过碱金属/nh3的方法(j.org.chem.,1979,44(4),594-599;j.am.chem.soc.,1968,90(23),6486-6492;tetrahedronlett.;1987,28(29);3315-3318)。比如:huffman等考察了各种碱金属在液氨中不对称还原樟脑,虽然选择性最高能做到85%,但是此类方法需要在-40℃以下的低温进行并且对环境不友好,因此很难得到工业化应用。其他一些还原方法也有一些报道(tetrahedronlett.;1981,22(3);179-180;现代有机合成方法与技术。北京:化学工业出版社.2003),比如连二亚硫酸钠作为还原剂、三异丙醇铝-异丙醇体系等。这些方法都存在转化率低,选择性差等缺点,无法进行产业化。
化学工作者还发展了一些其他制备右旋龙脑的方法。比如中国科学院广州化学研究所在1987年报道了(广州化工,1987,3,12-15),选用一种高旋光度的右旋松节油作原料合成右旋龙脑,虽然龙脑与异龙脑的比例高达94:6,比旋度在25以上,但是反应的收率只有20%左右,产业化价值不大。
技术实现要素:
本发明针对现有技术的不足,提供了一种简单易行的合成右旋龙脑的新方法,该方法操作简单,条件温和,大幅度降低了生产的成本,适合大规模的工业化生产。
本发明公开了一种以廉价易得的天然右旋樟脑为原料在酮还原酶的作用下制备右旋龙脑的方法,反应流程如下:
具体包括如下步骤:取右旋樟脑置于缓冲溶液中,再向其中加入所述酮还原酶,得到混合溶液,使所述混合溶液在20-40℃下反应,得所述右旋龙脑。
优选地,所述酮还原酶的dna序列具有与seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示的任一序列90%以上相同。
更优选地,所述酮还原酶的dna序列为seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示的任一序列。
优选地,所述酮还原酶的蛋白质序列具有与seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示的任一序列90%以上的同源性。
更优选地,所述酮还原酶的蛋白质序列为seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示的任一序列。
优选地,所述缓冲溶液为ph值为6.0-8.0,浓度为0.01-0.5mol/l的pbs缓冲溶液。
优选地,所述右旋樟脑和酮还原酶的重量比为20:1-50:1。
优选地,向所述缓冲溶液中加入右旋樟脑时,还加入葡萄糖、异丙醇、甲酸铵中的一种。
优选地,在所述混合溶液中,右旋樟脑与葡萄糖的摩尔比为1:(1.2-1.5);右旋樟脑与异丙醇的摩尔比为1:(5-10);右旋樟脑与甲酸铵的摩尔比为1:(1.2-1.5)。
优选地,向所述缓冲溶液中加入所述酮还原酶后,还加入葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、nad+、nadp+中的一种或多种。
优选地,所述葡萄糖脱氢酶采购自苏州引航生物科技有限公司,商品编号yh1901,所述甲酸脱氢酶采购自苏州引航生物科技有限公司,商品编号yh1805。
具体实施方式
本发明旨在提供一种生物催化制备右旋龙脑的方法,所述右旋龙脑结构式如下:
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1:
右旋樟脑2.5g、葡萄糖3.6g置于100ml的三口烧瓶,加入50mlph=6.5,0.05m的pbs缓冲液。将三口烧瓶放入反应锅中,设置转速850rpm,温度30℃。然后分别加入5mgnadp+,100mg葡萄糖脱氢酶(采购自苏州引航生物科技有限公司:商品编号yh1901)、以及100mg酮还原酶粉(采购自苏州引航生物科技有限公司:商品编号yh2022)。开始反应,反应过程中用2m的naoh溶液将ph维持在6.5左右,hplc监测。24小时后反应转化率>99%,右旋龙脑:异龙脑97:3。
实施例2:
右旋樟脑2.5g、葡萄糖3.6g置于100ml的三口烧瓶,加入50mlph=6.5,0.05m的pbs缓冲液。将三口烧瓶放入反应锅中,设置转速850rpm,温度30℃。然后分别加入5mgnadp+,100mg葡萄糖脱氢酶(采购自苏州引航生物科技有限公司:商品编号yh1901)、以及100mg酮还原酶粉(采购自苏州引航生物科技有限公司:商品编号yh2067)。开始反应,反应过程中用2m的naoh溶液将ph维持在6.5左右,hplc监测。24小时后反应转化率98%,右旋龙脑:异龙脑>99.5:0.5。
实施例3:
右旋樟脑2.5g、葡萄糖3.6g置于100ml的三口烧瓶,加入50mlph=6.5,0.05m的pbs缓冲液。将三口烧瓶放入反应锅中,设置转速850rpm,温度30℃。然后分别加入5mgnadp+,100mg葡萄糖脱氢酶(采购自苏州引航生物科技有限公司:商品编号yh1901)、以及100mg酮还原酶粉(采购自苏州引航生物科技有限公司:商品编号yh2069)。开始反应,反应过程中用2m的naoh溶液将ph维持在6.5左右,hplc监测。24小时后反应转化率95%,右旋龙脑:异龙脑96:4。
实施例4:
右旋樟脑2.5g、异丙醇10ml加至装有80mlph=6.5,0.1mpbs缓冲液的250ml反应器中搅拌均匀。依次加入酮还原酶粉(采购自苏州引航生物科技有限公司:商品编号yh2067)100mg,nadp+5mg。在30℃搅拌24h,hplc监测反应转化率>99.5%,右旋龙脑:异龙脑>99.8:0.2。
实施例5:
右旋樟脑2.5g、甲酸铵2g加至装有100mlph=6.5,0.1mpbs缓冲液的250ml反应器中搅拌均匀。依次加入nadp+5mg,酮还原酶粉(采购自苏州引航生物科技有限公司:商品编号yh2067)100mg,甲酸脱氢酶100mg(采购自苏州引航生物科技有限公司:商品编号yh1805)。开始反应,在30℃搅拌24h,hplc监测反应转化率>98%,右旋龙脑:异龙脑>97:3。
实施例6:
右旋樟脑25g、异丙醇100ml加至装有800mlph=6.5,0.1mpbs缓冲液的2000ml反应器中搅拌均匀。依次加入酮还原酶粉(采购自苏州引航生物科技有限公司:商品编号yh2067)1g,nadp+50mg。在30℃搅拌24h,hplc监测反应转化率>99.5%,右旋龙脑:异龙脑>99.8:0.2。反应完毕,反应体系用二氯甲烷萃取,合并有机相,干燥,脱溶,得到右旋龙脑粗品24.8克。
上述实施例中,所使用的酮还原酶yh2022、yh2067、yh2069分别具有seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示的dna序列和seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示的蛋白质序列:
seqidno.1:
atggttaagcaagaattctttaagctgaacaatggccatgagatgcccggtgtggccatcgttggtaccggtaccaagtggcacaaggttaatgagacagatgagaacttctcacagacactggtagatcaattgaaatacgctctgtctctgccaggtgttgttcatctggatgccgctgaattttatatgacctatagagaggtcggacgtgcactagctgagacttcgaagccccgtgatgagatattcatcactgataaatactggactttgagcaaagttactgagaatcccattgtaggtttagagactgggttgaaaagactcggattagagtacgtagacttgtacctgttgcatagtccctttatctctaaggaaaccaacgggttctcattagaggaggcctggggtatgatggaggaattatatcacagtggtaaagccaagaatattggcgtctccaactttgctaaggaggacttagagagagttttgaaggtctgcaaagtcaagccacaggtcaatcaaattgagtttaatgccttcttacaaaaccaaactcctggtatctacaacttttgcaagcaaaatgacattcaattagctgcatattctcctctaggtcctttacagaaaaagccagccgacggtaattcacaaccattttatagctatatcaacaagctggcacagcactacaacaaaacccccggtcaggttttgttgagatgggttaccaagcgtggtgtcgttgctgttaccacttctgagaagaaggagagaattaaacaagctcaggagatatttgaatttgatttgaaagatgatgaagttactgaaattactaaactaggtctagaccacgagcctttgagactgtattggcatgatcaatacaataagtacaactcagagtcccagaaggcctaa
seqidno.2:
atgtctaacggtaaaaccttcaccctgtctaacggtgttaaaatcccgggtgttggtttcggtaccttcgcttctgaaggttctaaaggtgaaacctacaccgctgttaccaccgctctgaaaaccggttaccgtcacctggactgcgcttggtactacctgaacgaaggtgaagttggtgaaggtatccgtgacttcctgaaagaaaacccgtctgttaaacgtgaagacatcttcgtttgcaccaaagtttggaaccacctgcaccgttacgaagacgttctgtggtctatcgacgactctctgaaacgtctgggtctggactacgttgacatgttcctggttcactggccgatcgctgctgaaaaaaacggtcagggtgaaccgaaaatcggtccggacggtaaatacgttatcctgaaagacctgaccgaaaacccggaaccgacctggcgtgctatggaaaaaatctacgaagaccgtaaagctcgttctatcggtgtttctaactggaccatcgctgacctggaaaaaatgtctaaattcgctaaagttatgccgcacgctaaccagatcgaaatccacccgttcctgccgaacgaagaactggttcagtactgcttctctaaaaacatcatgccggttgcttactctccgctgggttctcagaaccaggttccgaccaccggtgaacgtgtttctgaaaacaaaaccctgaacgaaatcgctgaaaaaggtggtaacaccctggctcaggttctgatcgcttggggtctgcgtcgtggttacgttgttctgccgaaatcttctaacccgaaacgtatcgaatctaacttcaaatctatcgaactgtctgacgctgacttcgaagctatcaacgctgttgctaaaggtcgtcacttccgtttcgttaacatgaaagacaccttcggttacgacgtttggccggaagaaaccgctaaaaacctgtctgcttaa
seqidno.3:
atgaccaaccgcctgcagggtaaagtcgcactggttaccggtggtgcttccggtgtgggcctggaagtagtgaaactgctcctgggtgaaggcgcgaaagtagcgttcagcgacatcaacgaagcagcagggcagcagttagcagctgagctgggcgaacgtagtatgttcgtgcgtcatgatgtcagcagcgaggcagattggaccctggttatggcagcagtacagcgtcgcctgggtaccctgaacgtgctggtgaacaacgcgggtattctgctgccgggcgacatggagaccggtcgcctggaggatttttcgcgcctgctgaaaatcaacaccgaaagcgtgttcatcggttgccagcagggcattgcggccatgaaagaaactggtggttcaatcatcaacatggcttctgtttcgtcttggctgccaatcgaacaatatgcaggctacagcgcctcaaaagcagctgtcagcgccctgactcgcgccgcagcgctttcgtgtcgtaaacaaggttacgctatccgtgttaactcgatccacccggatggtatctacaccccgatgatgcaggcgtccctgccaaaaggcgtgtctaaggaaatggtgttgcacgacccaaagctgaaccgcgcgggtcgtgcttacatgccggaacgtatcgcgcagctggttctgttccttgcaagcgacgaatccagcgtgatgtccgggagtgagctgcacgcggataacagcattctgggtatggggctgtaa
seqidno.4:
mvkqeffklnnghempgvaivgtgtkwhkvnetdenfsqtlvdqlkyalslpgvvhldaaefymtyrevgralaetskprdeifitdkywtlskvtenpivgletglkrlgleyvdlyllhspfisketngfsleeawgmmeelyhsgkaknigvsnfakedlervlkvckvkpqvnqiefnaflqnqtpgiynfckqndiqlaaysplgplqkkpadgnsqpfysyinklaqhynktpgqvllrwvtkrgvvavttsekkerikqaqeifefdlkddevteitklgldheplrlywhdqynkynsesqka*
seqidno.5:
msngktftlsngvkipgvgfgtfasegskgetytavttalktgyrhldcawyylnegevgegirdflkenpsvkredifvctkvwnhlhryedvlwsiddslkrlgldyvdmflvhwpiaaekngqgepkigpdgkyvilkdltenpeptwramekiyedrkarsigvsnwtiadlekmskfakvmphanqieihpflpneelvqycfsknimpvaysplgsqnqvpttgervsenktlneiaekggntlaqvliawglrrgyvvlpkssnpkriesnfksielsdadfeainavakgrhfrfvnmkdtfgydvwpeetaknlsa*
seqidno.6:
mtnrlqgkvalvtggasgvglevvklllgegakvafsdineaagqqlaaelgersmfvrhdvsseadwtlvmaavqrrlgtlnvlvnnagillpgdmetgrledfsrllkintesvfigcqqgiaamketggsiinmasvsswlpieqyagysaskaavsaltraaalscrkqgyairvnsihpdgiytpmmqaslpkgvskemvlhdpklnragraymperiaqlvlflasdessvmsgselhadnsilgmgl*
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>苏州引航生物科技有限公司
<120>一种制备右旋龙脑的方法
<130>2018
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>936
<212>dna
<213>人工序列(未知)
<400>1
atggttaagcaagaattctttaagctgaacaatggccatgagatgcccggtgtggccatc60
gttggtaccggtaccaagtggcacaaggttaatgagacagatgagaacttctcacagaca120
ctggtagatcaattgaaatacgctctgtctctgccaggtgttgttcatctggatgccgct180
gaattttatatgacctatagagaggtcggacgtgcactagctgagacttcgaagccccgt240
gatgagatattcatcactgataaatactggactttgagcaaagttactgagaatcccatt300
gtaggtttagagactgggttgaaaagactcggattagagtacgtagacttgtacctgttg360
catagtccctttatctctaaggaaaccaacgggttctcattagaggaggcctggggtatg420
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tttaatgccttcttacaaaaccaaactcctggtatctacaacttttgcaagcaaaatgac600
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tacaataagtacaactcagagtcccagaaggcctaa936
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<211>978
<212>dna
<213>人工序列(未知)
<400>2
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tctatcgaactgtctgacgctgacttcgaagctatcaacgctgttgctaaaggtcgtcac900
ttccgtttcgttaacatgaaagacaccttcggttacgacgtttggccggaagaaaccgct960
aaaaacctgtctgcttaa978
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<212>dna
<213>人工序列(未知)
<400>3
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ctggaagtagtgaaactgctcctgggtgaaggcgcgaaagtagcgttcagcgacatcaac120
gaagcagcagggcagcagttagcagctgagctgggcgaacgtagtatgttcgtgcgtcat180
gatgtcagcagcgaggcagattggaccctggttatggcagcagtacagcgtcgcctgggt240
accctgaacgtgctggtgaacaacgcgggtattctgctgccgggcgacatggagaccggt300
cgcctggaggatttttcgcgcctgctgaaaatcaacaccgaaagcgtgttcatcggttgc360
cagcagggcattgcggccatgaaagaaactggtggttcaatcatcaacatggcttctgtt420
tcgtcttggctgccaatcgaacaatatgcaggctacagcgcctcaaaagcagctgtcagc480
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<210>4
<211>311
<212>prt
<213>人工序列(未知)
<400>4
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151015
glyvalalailevalglythrglythrlystrphislysvalasnglu
202530
thraspgluasnpheserglnthrleuvalaspglnleulystyrala
354045
leuserleuproglyvalvalhisleuaspalaalagluphetyrmet
505560
thrtyrarggluvalglyargalaleualagluthrserlysproarg
65707580
aspgluilepheilethrasplystyrtrpthrleuserlysvalthr
859095
gluasnproilevalglyleugluthrglyleulysargleuglyleu
100105110
glutyrvalaspleutyrleuleuhisserpropheileserlysglu
115120125
thrasnglypheserleugluglualatrpglymetmetglugluleu
130135140
tyrhisserglylysalalysasnileglyvalserasnphealalys
145150155160
gluaspleugluargvalleulysvalcyslysvallysproglnval
165170175
asnglnileglupheasnalapheleuglnasnglnthrproglyile
180185190
tyrasnphecyslysglnasnaspileglnleualaalatyrserpro
195200205
leuglyproleuglnlyslysproalaaspglyasnserglnprophe
210215220
tyrsertyrileasnlysleualaglnhistyrasnlysthrprogly
225230235240
glnvalleuleuargtrpvalthrlysargglyvalvalalavalthr
245250255
thrserglulyslysgluargilelysglnalaglngluilepheglu
260265270
pheaspleulysaspaspgluvalthrgluilethrlysleuglyleu
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asphisgluproleuargleutyrtrphisaspglntyrasnlystyr
290295300
asnsergluserglnlysala
305310
<210>5
<211>325
<212>prt
<213>人工序列(未知)
<400>5
metserasnglylysthrphethrleuserasnglyvallysilepro
151015
glyvalglypheglythrphealasergluglyserlysglygluthr
202530
tyrthralavalthrthralaleulysthrglytyrarghisleuasp
354045
cysalatrptyrtyrleuasngluglygluvalglygluglyilearg
505560
asppheleulysgluasnproservallysarggluaspilepheval
65707580
cysthrlysvaltrpasnhisleuhisargtyrgluaspvalleutrp
859095
serileaspaspserleulysargleuglyleuasptyrvalaspmet
100105110
pheleuvalhistrpproilealaalaglulysasnglyglnglyglu
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prolysileglyproaspglylystyrvalileleulysaspleuthr
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gluasnprogluprothrtrpargalametglulysiletyrgluasp
145150155160
arglysalaargserileglyvalserasntrpthrilealaaspleu
165170175
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180185190
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195200205
serlysasnilemetprovalalatyrserproleuglyserglnasn
210215220
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225230235240
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260265270
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325
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<213>人工序列(未知)
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metthrasnargleuglnglylysvalalaleuvalthrglyglyala
151015
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lysvalalapheseraspileasnglualaalaglyglnglnleuala
354045
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65707580
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