本发明属于发酵工程领域，尤其涉及一种复合萃取剂及利用复合萃取剂促进红曲色素生产的方法。
背景技术：
红曲色素是一种安全的天然色素，对酸碱、氧化剂、还原剂均较稳定，具有热稳定性好、蛋白质着色力强、色调柔和、对ph稳定和抗氧化等特点，可部分代替发色剂亚硝酸盐应用于肉制品、膨化食品、水产品和调味类罐头等着色，因此红曲色素应用具有巨大的市场前景。
目前红曲色素的生产方法主要是液态发酵法，但是这种传统的液态发酵方式面临着两个难题：发酵过程中菌体细胞内产物的高浓度所导致的负反馈抑制；发酵结束后胞内色素分离纯化对有机溶剂的大量消耗。针对以上问题，有研究者发现，采用双液相偶联萃取发酵体系能够促进胞内色素分泌到胞外，解除胞内产物反馈抑制，增加色素产量。
双液相偶联萃取发酵又称“挤奶发酵”，该体系通过向发酵培养基中添加非离子表面活性剂，伴随着浊点系统形成，发酵体系自动形成非离子表面活性剂胶束富集的聚集相和胶束很少的稀相。发酵过程中疏水性红曲色素从胞内萃取到胞外并大量富集在聚集相，从而解除胞内产物反馈抑制，增加色素产量。另外胞内色素被大量分泌到胞外，减少了有机提取溶剂的用量。经对现有文献技术检索发现，目前只有相关团队发现非离子表面活性剂tritonx-100在红曲色素发酵中具有良好的生物相容性和色素萃取能力，(胡志强.表面活性剂胶束溶液中萃取发酵红曲色素的研究[d].华南理工大学,2013.)但tritonx-100的色素萃取能力有限，有待发现更优的萃取剂来大规模提高红曲色素的产量。
综上所述，现有技术存在的问题是：
现在红曲霉发酵领域中，只有tritonx、tween等几个系列的非离子表面活性剂被研究，我们在这些研究的基础之上筛选出了一种促色素分泌效果更好的非离子表面活性剂span80。而span80与植物油的结合会进一步得到更好的色素产量。
目前菌种筛选、发酵条件优化等现有方法达到瓶颈，很难再进一步提高红曲色素产量，进而寻求一种新型的发酵方式即双液相偶联萃取发酵体系。而非离子表面活性剂span80与花生油按照一定比例混合后作为萃取剂用于红曲色素生产的方法还未有报道。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种复合萃取剂及利用复合萃取剂促进红曲色素生产的方法。
本发明是这样实现的，一种利用复合萃取剂促进红曲色素生产的方法，所述利用复合萃取剂促进红曲色素生产的方法包括：
将处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比3％～8％的接种量接入发酵培养基中；同时在发酵培养基中加入花生油，加入量为70ml/l发酵液～180ml/l发酵液；在温度27℃～33℃的条件下摇瓶培养；
向含有红曲菌液体种子、花生油发酵体系中添加非离子表面活性剂span80，添加量为2.8g/l发酵液～3.4g/l发酵液，继续摇瓶发酵；
所述发酵培养基的初始ph为3.0-5.0。
进一步，所述利用复合萃取剂促进红曲色素生产的方法具体包括：
步骤一，将紫红曲霉在恒温培养箱中活化菌种，然后将活化好的菌株接种到种子液，种子液在摇床中培养；
步骤二，调节发酵培养基的初始ph值为3.0-5.0；
步骤三，将处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比3％～8％的接种量接入装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，同时在发酵培养基中加入花生油，加入量为70ml/l发酵液～180ml/l发酵液；在转速为150r/min～250r/min，温度27℃～33℃的条件下摇瓶培养48h～96h；
步骤四，发酵培养基在摇瓶培养48h～96h后，向发酵体系中添加非离子表面活性剂span80，添加量为2.8g/l发酵液～3.4g/l发酵液，继续摇瓶发酵3天～8天；
步骤五，发酵结束后，取发酵液，离心，上清液中得胞外色素，过滤后的滤渣细胞用乙醇提取，得胞内色素。
进一步，步骤一具体包括：将紫红曲霉在30℃恒温培养箱中活化菌种3d～4d，然后将活化好的菌株接种到种子液，种子液在28℃～32℃、160r/min～200r/min的摇床中培养30h～50h；
进一步，步骤五具体包括：发酵结束后，取发酵液，10000r/min～20000r/min离心，上清液中得胞外色素，过滤后的滤渣细胞用50％～90％体积分数的乙醇在50℃～80℃下提取1h～3h，得胞内色素。
进一步，步骤一中，所述菌种为紫红曲霉nj1或紫红曲霉rp2。
本发明的另一目的在于提供一种复合萃取剂由非离子表面活性剂span80(添加量为2.8-3.4g/l发酵液)和花生油(添加量为70-180ml/l发酵液)组成。
本发明非离子表面活性剂span80是一种有机溶剂，添加此溶剂的目的是形成浊点系统，实现萃取发酵的。并不含菌种。不同的添加时间，最后的色素产量不同。
本发明的优点及积极效果为：
本发明优选非离子表面活性剂span80的胶束溶液和花生油按一定比例结合作为萃取剂，实现了胞内红曲色素的萃取发酵和浊点萃取。将胞内红曲色素萃取到胞外萃取剂富集相，解除胞内产物反馈抑制，增加色素产量。添加了该复合萃取剂的发酵液中红、橙、黄三种色素的最终产量分别达到220.70u/ml、190.64u/ml、192.63u/ml，相比于对照组，三种色素的产量分别提高了76％、85％和89％。该复合萃取剂的添加不仅使发酵体系的溶氧量增加20％-30％，而且能提高细胞壁和细胞膜的通透性，促进胞内色素的分泌。
本发明可以使发酵时间缩短4-6天，色素产量增加70％-90％，显著提高经济效益，(当前工厂的发酵时间一般为15天，红曲红色素市场价格为150元/kg,红曲黄色素市场价格为200元/kg)有较好的应用前景。
本发明添加了该复合萃取剂的发酵液中红、橙、黄三种色素的最终产量相比于对照组分别提高了76％、85％和89％。
附图说明
图1是本发明实施例提供的利用复合萃取剂促进红曲色素生产的方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
本发明实施例提供的利用复合萃取剂促进红曲色素生产的方法，包括：
将处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比3％～8％的接种量接入发酵培养基中；同时在发酵培养基中加入花生油，加入量为70ml/l发酵液～180ml/l发酵液；在温度27℃～33℃的条件下摇瓶培养；
向含有红曲菌液体种子、花生油发酵体系中添加非离子表面活性剂span80，添加量为2.8g/l发酵液～3.4g/l发酵液，继续摇瓶发酵；
所述发酵培养基的初始ph为3.0-5.0，最终ph值为2.0-6.0。
如图1，本发明实施例提供的利用复合萃取剂促进红曲色素生产的方法具体包括：
s101：将紫红曲霉在恒温培养箱中活化菌种，然后将活化好的菌株接种到种子液，种子液在摇床中培养；
s102：调节发酵培养基的初始ph值为3.0-5.0；
s103：将处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比3％～8％的接种量接入装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，同时在发酵培养基中加入花生油，加入量为70ml/l发酵液～180ml/l发酵液；在转速为150r/min～250r/min，温度27℃～33℃的条件下摇瓶培养48h～96h；
s104：发酵培养基在摇瓶培养48h～96h后，向发酵体系中添加非离子表面活性剂span80，添加量为2.8g/l发酵液～3.4g/l发酵液，继续摇瓶发酵3天～8天；
s105：发酵结束后，取发酵液，离心，上清液中得胞外色素，过滤后的滤渣细胞用乙醇提取，得胞内色素。
s101具体包括：将紫红曲霉在30℃恒温培养箱中活化菌种3d～4d，然后将活化好的菌株接种到种子液，种子液在28℃～32℃、160r/min～200r/min的摇床中培养30h～50h；
s105具体包括：发酵结束后，取发酵液，10000r/min～20000r/min离心，上清液中得胞外色素，过滤后的滤渣细胞用50％～90％体积分数的乙醇在50℃～80℃下提取1h～3h，得胞内色素。
所述基本发酵培养基含有葡萄糖30-60g/l，黄豆粉15-45g/l，甘油70-100g/l，蛋白胨5-20g/l，mgso4·7h2o0.5-1.5g/l，kh2po41.5-3.5g/l，nano32-10g/l，znso4·7h2o0.5-3.5g/l。
所述的非离子表面活性剂span80可改变菌体细胞壁的结构，使得菌壁网状联结疏松，利于胞内胞外物质的进出，而植物油能提高溶氧量。萃取相中的油酯类物质难溶于水，可将发酵体系中疏水性红曲色素富集在萃取剂相，解除产物负反馈抑制，大幅度提高发酵体系合成红曲色素的效率。
所述非离子表面活性剂span80的添加量为2.8-3.4g/l发酵液，添加时间为红曲种子液接种后的48-96h。花生油的添加量为70-180ml/l发酵液，在发酵之初就添加。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明应用的红曲菌种是由南京工业大学微生物资源保藏中心提供。
实施例一
斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)
种子液培养基：葡萄糖20-40g/l，黄豆粉10-30g/l，甘油60-80g/l，蛋白胨5-15g/l，mgso4·7h2o0.5-3g/l，kh2po41-4g/l，nano31-3g/l。
发酵液培养基：葡萄糖30-60g/l，黄豆粉15-35g/l，甘油70-100g/l，蛋白胨5-20g/l，mgso4·7h2o0.5-2g/l，kh2po41.5-5g/l，nano31-5g/l，znso4·7h2o1-4g/l。
三种色素色价测定与计算：取一定体积的发酵液，离心，过滤，滤液经去离子水稀释至适当倍数，用分光光度计分别在390-420nm、430-480nm、490-520nm波长下测定其od值，三种波长下的od值分别乘以稀释倍数即为胞外黄、橙、红三色素的色价。离心后的菌体沉淀用50-90％的乙醇混匀50-80℃抽提1-3小时，然后离心，过滤，滤液经50-90％的乙醇稀释至适当倍数，用分光光度计同样波长下测定其od值，三种波长下的od值分别乘以稀释倍数即为胞内黄、橙、红三色素的色价。色价单位用u/ml来表示。色价(u/ml)＝od值×稀释倍数。
本发明实施例提供的利用复合萃取剂促进红曲色素生产的方法,包括：
步骤1，首先将保藏的紫红曲霉在30℃恒温培养箱中活化菌种3-4d，然后将活化好的菌株接种到种子液(装液量50ml/250ml)，种子液在28-32℃、160-200r/min的摇床中培养30-50h。
步骤2，调节发酵培养基的初始ph值为3.0-5.0。
步骤3，将处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比3％-8％的接种量接入装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，同时在发酵培养基中加入花生油，加入量为70-180ml/l发酵液。在转速为150-250r/min，温度27-33℃的条件下摇瓶培养48-96h。
步骤4，发酵培养基在摇瓶培养48-96h后，向发酵体系中添加非离子表面活性剂span80，添加量为2.8-3.4g/l发酵液，继续摇瓶发酵3-8天。
步骤5，发酵结束后，取发酵液，10000-20000r/min离心，上清液中可得胞外色素，过滤后的滤渣细胞用50-90％体积分数的乙醇在50-80℃下提取1-3h，可得胞内色素。通过紫外分光光度计测量发酵液中的红、橙、黄三种色素总产量分别为190-200u/ml、180-190u/ml、180-190u/ml
实施例二：
与上述实施例一的菌种培养与发酵过程步骤相同，所不同的是发酵培养基按以下配方进行配制，基本培养基为大米粉30-60g/l，甘油70-100g/l，蛋白胨5-20g/l，mgso4·7h2o0.5-2g/l，kh2po41.5-5g/l，nano31-5g/l，znso4·7h2o1-4g/l。萃取相仍为非离子表面活性剂span80和花生油，添加时间也与实施例一相同。与实施例一相同的发酵条件下发酵5-10天后测量红、橙、黄三色素的总色价分别为180-190u/ml、160-170u/ml、180-190u/ml。
实施例三：
与上述实施例一的步骤及发酵培养基配方相同，所不同的是菌种不同。选用本实验室保藏菌种红曲菌rp2。
发酵步骤及发酵过程和条件与上述实施例一相同。发酵结束后，通过紫外分光光度计测量红、橙、黄三色素的总色价分别为150-160u/ml、140-150u/ml、140-150u/ml。
由上述实施例可知非离子表面活性剂span80与花生油结合的复合萃取剂对红曲霉有很好的生物相容性和色素萃取能力。本发明可以高效的生产红曲色素，在红曲色素生产领域具有重要的实用价值和经济价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。