本发明涉及一种复合pcr扩增的方法及应用，尤其涉及一种单管同时检测21个染色体基因座、1个y染色体str、1个性别基因座和4个非人源物种特异性dna序列的荧光复合扩增的方法及应用，属于染色体分型和鉴定领域及动物分子生物学领域。
背景技术：
短串联重复序列(shorttandomrepeat，str)是人类基因组中由2-6个碱基作为核心单位串联重复形成的一类具有长度多态性的dna序列，其核心单位的数目变化和重复次数不同构成了str的遗传多态性。str分布广，数目多，约占人类基因组的10％，所包含的信息量巨大，不同的序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，具有极高的个体鉴定能力，同时，str基因座的片段小，容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。所以str基因座常作为遗传标记用于dna分析技术中以用于法医个体识别、亲缘关系鉴定。
在个体识别鉴定中，样本的来源受到环境的影响，其组成是比较复杂的，通常存在非人源物种的污染，甚至在某些环境中，受到非人源物种的表观干扰(如血迹)，人源dna含量比很低甚至缺失，用单纯的人str检测试剂盒会出现样本峰低，非特异峰干扰，甚至样本峰缺失等情况，使得办案人员无法第一时间判定是样本存在抑制剂较多，还是dna降解，或是dna浓度较低。往往需要进行二次以上的测试，并再次进行现场确认，结合调查，确定样本来源情况。
对于非人源物种鉴定，目前的相关报道中主要采用了1)根据线粒体dna(例如细胞色素b(cytb)基因)序列差异设计物种特异性引物所建立的pcr方法(参见cn102876805a)，但是由于线粒体dna拷贝数多，在不同组织中含量不同、稳定性差且难以进行定量分析。例如，对于cytb序列，其物种间还高度相似，无法进行复合扩增，而且在高样本浓度下容易出现假阳性的结果；2)基于物种str的检测方法(参见cn104928387a)，但是由于str是长度多态性的序列，其会在检测范围下占用较大的空间，如果与人str进行联合检测，在保证人str检测数量的前提下，非人源物种复合检测数量非常有限，对检测范围内的空间利用效能很低，如果单独形成一个不同物种的str联合检测方法，在实际应用中并不能达到一次检测，同步判读的作用，同样需要多次扩增检测，对纯非人源物种有一定的判读帮助，但面对非人源样本污染人dna的情况，检测人员无法第一时间准确得知样本的信息情况，若str的检测对某些物种存在非特异性的扩增峰，会对结果的判读产生一定的干扰或误判。因此该方法下的检测应用限制较多，对资源与效率没有太大帮助。
综上所述，目前尚无在检测人类dna遗传标记进行个体识别的同时，鉴定非人源物种的方法的相关研究及报道，本发明填补了此空白，提供了一种高灵敏度、高特异性且快速、简便、准确的鉴定含非人源物种成分的人源样本的检测方案。
技术实现要素：
本发明优选人dna遗传标记，并通过与优选的目标非人源物种染色体上管家基因的dna序列进行特异性的检测进行联合检测，获得了一种对疑是人源的未知生物样本进行快速鉴定的方法，可以通过一次性检测获得：鉴别是否为人源样本或人源样本是否混有其它物种样本；若是(或含有)人源样本，同步对其进行个体识别。具体地，本发明提供了一种对疑是人源的未知生物样本进行物种及人源个体识别鉴定的复合pcr扩增方法，所述方法包括如下步骤：
1)采集疑是人源的待检测的未知生物样本；
2)将所述待检测的未知生物样本直接加入或将提取自所述待检测的未知生物样本的核酸加入到预混pcr试剂中；
3)运行pcr扩增程序，进行复合pcr扩增反应；
4)对pcr扩增产物进行检测分析；
其中，所述预混pcr试剂包含特异性针对人dna遗传标记的引物和特异性针对非人源物种染色体核基因的引物。
对pcr扩增产物进行检测分析方法，包括通过pcr产物片段的大小差异进行鉴定，以及通过对pcr产物的序列进行测序分析；优选地，本发明采用了pcr产物的检测分析通过pcr产物片段的大小差异进行鉴定，鉴定方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳及毛细管凝胶电泳；本发明采用了毛细管凝胶电泳方法,其根据检测的波长分为单波长及多波长；优选地，本发明采用的检测方法为6种光波长的检测方法。
本发明对人源样本进行个体识别的方法，是通过检测人dna遗传标记，包括indel位点，snp位点及str基因座；优选地，本发明采用了22个人str基因座：d3s1358、th01、d21s11、d18s51、pentae、d12s391、d6s1043、d2s1338、d1s1656、d5s818、d13s317、d7s820、d19s433、csf1po、pentad、vwa、d8s1179、tpox、fga、d2s441、d16s539和dys391，以及一个非str基因座的性别识别位点amel。
本发明所述的非人源物种包括非人类哺乳动物，例如非人灵长类动物、猫、狗、绵羊、山羊、马、牛、猪和啮齿动物，以及非哺乳动物，例如鸟类、家禽、爬行动物、两栖动物；优选地，本发明采用的非人源物种为鸡、鸭、鹅和猪。
本发明对非人源物种的鉴定是通过不同物种之间相同基因的核苷酸序列比对，在序列差异处设计物种特异性的引物探针，达到物种的快速检测鉴定。其中用于非人源物种鉴定的基因，可以是待鉴定物种之间共同存在，并在序列上存在一定差异的所有基因，例如染色体上基因组上的管家基因，包括微管蛋白基因、atp合成酶基因、糖酵解酶系统基因及核糖体蛋白基因等；优选地，本发明所采用的管家基因为atp5b基因。
本发明选取的染色体核基因可以确保检测的样本核酸拷贝数不受组织来源、不同生命周期等差异的影响，优选的管家基因序列在遗传进化中相对保守稳定，不同物种间存在较大差异，同类物种间差异较小的优点，具有高度的物种特异性。
本发明还提供了一种快速鉴定疑是人源的待检测未知生物样本的复合pcr扩增试剂盒，鉴定所述样本是否为人源样本或是其它(或含有)非人源物种成分，如是(或含有)人源样本，可同步进行个体识别。具体地，本发明的试剂盒的特征在于包含特异性针对人dna遗传标记的引物和特异性针对非人源物种染色体核基因的引物；可同步多重扩增如下的人dna遗传标记和非人源物种染色体管家基因：d3s1358、th01、d21s11、d18s51、pentae、d12s391、d6s1043、d2s1338、d1s1656、d5s818、d13s317、d7s820、d19s433、csf1po、pentad、vwa、d8s1179、tpox、fga、d2s441、d16s539、dys391和amel以及鸡atp5b、鸭atp5b、鹅atp5b和猪atp5b。
本发明方法通过对人dna遗传标记与非人源物种管家基因进行同步pcr扩增，可以在单管内实现多物种的联合检测，进而实现对多种非人源物种与人源样本的多个个体识别位点进行同步鉴定，具有准确、高灵敏度、简便、高特异性等优势，避免了目前物种来源鉴定的多次pcr扩增方法，进而避免了样本、检测试剂等资源浪费，当只有微量样本无法进行多次扩增时，仍可以成功完成鉴定识别。
附图说明
图1是controldna9948样本图。
图2是鸡提取dna扩增样本图。
图3是鸭提取dna扩增样本图。
图4是鹅提取dna扩增样本图。
图5是猪提取dna扩增样本图。
图6是鸡鸭鹅猪提取dna与controldna9948同浓度混合样本扩增结果图。
图7是未知样本提取dna扩增结果图。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种鉴定疑是人源的未知生物样本的复合pcr扩增方法，所述方法包括如下步骤：
1)采集疑是人源的待检测的未知生物样本；
2)将所述待检测的未知生物样本直接加入或将提取自所述待检测的未知生物样本的核酸加入到预混pcr试剂中；
3)运行pcr扩增程序，进行复合pcr扩增反应；
4)对pcr扩增产物进行检测分析；
其中，所述预混pcr试剂包含特异性针对人dna遗传标记的引物和特异性针对非人源物种染色体核基因的引物。
在本方明的方法中，所述未知生物样本是指不清楚样本物种来源的生物样本。
在本发明的方法中，所述在本发明方法的具体实施方案中，通过毛细管凝胶电泳结合荧光检测对pcr扩增产物进行检测分析，这极大地减化了检测操作的流程和时间。在一个优选的实施方案中，通过毛细管凝胶电泳结合6种光波长的荧光检测法对pcr扩增产物进行检测分析。
在本发明方法中使用的术语“dna遗传标记”是指可遗传的并可检测的代表生物体遗传组成，并且分布规律具有种群特征的dna序列。
在本发明方法中，所述人dna遗传标记包括人str基因座、性别识别位点、indel位点和/或snp位点。
在一个实施方案中，所述人dna遗传标记为人str基因座和性别识别位点；其中所述人str基因座包括人常染色体及性别染色体上的str基因座。
在一个具体的实施方案中，所述人dna遗传标记包括如下22个str基因座：d3s1358、th01、d21s11、d18s51、pentae、d12s391、d6s1043、d2s1338、d1s1656、d5s818、d13s317、d7s820、d19s433、csf1po、pentad、vwa、d8s1179、tpox、fga、d2s441、d16s539和dys391，以及1个非str基因座的性别识别位点amel。
在本发明的方法中，所述非人源物种为非人类哺乳动物，例如但不限于非人灵长类动物、猫、狗、绵羊、山羊、马、牛、猪和啮齿动物(例如但不限于小鼠和大鼠)；以及非哺乳动物，例如但不限于鸟类、家禽、爬行动物、两栖动物。在一个具体的实施方案中，所述非人源物种为鸡、鸭、鹅和猪。
在本发明的方法中，所述检测样本选自血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官。在一些实施方案中，本发明的方法还可以直接通过扩增滤纸、fta卡、棉絮、口腔拭子等检材来进行。
在本发明的方法中，对于非人源物种，通过不同物种之间相同基因的核苷酸序列比对，在序列差异处设计物种特异性的引物探针，达到对不同非人源物种的快速检测和鉴定。具体地，对于非人源物种，可选用物种之间染色体上共同存在但在核酸序列上存在差异的所有基因，例如染色体上的管家基因，包括微管蛋白基因、atp合成酶基因、糖酵解酶系统基因及核糖体蛋白基因等；优选地，本发明所采用的管家基因为atp5b基因。本发明方法选取的染色体核基因可以确保检测的样本核酸拷贝数不受组织来源、不同生命周期等差异的影响，优选的管家基因序列在遗传进化中相对保守稳定，不同物种间存在较大差异，同类物种间差异较小的优点，具有高度的物种特异性。
在本发明方法的一些实施方案中，所述引物序列如下：amel：seqidno:1～2；d8s1179：seqidno:3～4；d21s11：seqidno:5～6；d18s51：seqidno:7～8；d2s1338：seqidno:9～10；猪atp5b：seqidno:11～12；鸭atp5b：seqidno:13～14；d2s441：seqidno:15～16；d5s818：seqidno:17～18；d7s820：seqidno:19～20；d6s1043：seqidno:21～22；pentad：seqidno:23～24；鹅atp5b：seqidno:25～26；d3s1358：seqidno:27～28；th01：seqidno:29～30；d19s433：seqidno:31～32；d12s391：seqidno:33～34；鸡atp5b：seqidno:35～36；dys391：seqidno:37～38；tpox：seqidno:39～40；d16s539：seqidno:41～42；d13s317：seqidno:43～44；fga：seqidno:45～46；csf1po：seqidno:47～48；vwa：seqidno:49～50；d1s1656：seqidno:51～52；pentae：seqidno:53～54。
在本发明方法的一个具体实施方案中，所述引物的浓度如下：seqidno:1～2：0.84μm；seqidno:3～4：0.5μm；seqidno:5～6：0.67μm；seqidno:7～8：0.66μm；seqidno:9～10：0.67μm；seqidno:11～12：0.54μm；seqidno:13～14：1.26μm；seqidno:15～16：0.3μm；seqidno:17～18：0.7μm；seqidno:19～20：1.36μm；seqidno:21～22：0.5μm；seqidno:23～24：0.6μm；seqidno:25～26：0.65μm；seqidno:27～28：1.3μm；seqidno:29～30：1.2μm；seqidno:31～32：1.3μm；seqidno:33～34：0.65μm；seqidno:35～36：4.6μm；seqidno:37～38：1.8μm；seqidno:39～40：2.7μm；seqidno:41～42：1.9μm；seqidno:43～44：1.5μm；seqidno:45～46：2.0μm；seqidno:47～48：2.7μm；seqidno:49～50：1.9μm；seqidno:51～52：2.0μm；seqidno:53～54：1.9μm。
本发明还提供了一种对疑是人源的未知生物样本进行物种及人源个体识别鉴定的复合pcr扩增试剂盒，其特征在于包含特异性针对人dna遗传标记的引物和特异性针对非人源物种染色体核基因的引物。
在一些实施方案中，所述人dna遗传标记包括人str基因座、性别识别位点、indel位点和/或snp位点；优选地，所述人dna遗传标记为人str基因座和性别识别位点。
在一些实施方案中，所述非人源物种染色体核基因包括待鉴定物种之间染色体上共同存在，并在序列上存在一定差异的所有基因；优选地，所述核基因为染色体上的管家基因；更优选地，所述管家基因包括微管蛋白基因、atp合成酶基因、糖酵解酶系基因和/或核糖体蛋白基因；最优选地，所述管家基因为atp5b基因。
在一个具体的实施方案中，所述试剂盒包含用于扩增如下的人dna遗传标记和非人源物种染色体管家基因的引物：d3s1358、th01、d21s11、d18s51、pentae、d12s391、d6s1043、d2s1338、d1s1656、d5s818、d13s317、d7s820、d19s433、csf1po、pentad、vwa、d8s1179、tpox、fga、d2s441、d16s539、dys391和amel以及鸡atp5b、鸭atp5b、鹅atp5b和猪atp5b。
在一个特别具体的实施方案中，所述引物序列如下：amel：seqidno:1～2；d8s1179：seqidno:3～4；d21s11：seqidno:5～6；d18s51：seqidno:7～8；d2s1338：seqidno:9～10；猪atp5b：seqidno:11～12；鸭atp5b：seqidno:13～14；d2s441：seqidno:15～16；d5s818：seqidno:17～18；d7s820：seqidno:19～20；d6s1043：seqidno:21～22；pentad：seqidno:23～24；鹅atp5b：seqidno:25～26；d3s1358：seqidno:27～28；th01：seqidno:29～30；d19s433：seqidno:31～32；d12s391：seqidno:33～34；鸡atp5b：seqidno:35～36；dys391：seqidno:37～38；tpox：seqidno:39～40；d16s539：seqidno:41～42；d13s317：seqidno:43～44；fga：seqidno:45～46；csf1po：seqidno:47～48；vwa：seqidno:49～50；d1s1656：seqidno:51～52；pentae：seqidno:53～54。
在另一个具体的实施方案中，所述引物的浓度如下：seqidno:1～2：0.84μm；seqidno:3～4：0.5μm；seqidno:5～6：0.67μm；seqidno:7～8：0.66μm；seqidno:9～10：0.67μm；seqidno:11～12：0.54μm；seqidno:13～14：1.26μm；seqidno:15～16：0.3μm；seqidno:17～18：0.7μm；seqidno:19～20：1.36μm；seqidno:21～22：0.5μm；seqidno:23～24：0.6μm；seqidno:25～26：0.65μm；seqidno:27～28：1.3μm；seqidno:29～30：1.2μm；seqidno:31～32：1.3μm；seqidno:33～34：0.65μm；seqidno:35～36：4.6μm；seqidno:37～38：1.8μm；seqidno:39～40：2.7μm；seqidno:41～42：1.9μm；seqidno:43～44：1.5μm；seqidno:45～46：2.0μm；seqidno:47～48：2.7μm；seqidno:49～50：1.9μm；seqidno:51～52：2.0μm；seqidno:53～54：1.9μm。
本发明的试剂盒组分除以上所述的引物外，还包括无核酸酶水、pcr反应混合物、引物混合物、等位基因混合物、内标size-500plus。值得一提的是本发明所采用的pcr反应混合物经过一系列的优化实验使得本产品可以兼容中国市面上所有常见的样本检材类型包括whatmanfta卡、whatman唾液卡、血滤纸、博坤fta卡、博坤唾液卡、头发、口腔脱落细胞、提取dna等各种检材，除此之外，该种改良后的缓冲液能极大的提高扩增效率，有效缩短产物末端腺苷酰化的时间，缩短整体的扩增时间，并能够提高长片段的扩增效率，改善了产品的均衡性。其主要成分有：dmso、tris-buffer、氯化钾、硫酸铵、dntp、吐温20和甜菜碱等。
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一非人源物种及特异性序列的确定
实际鉴定应用中，非人源物种的污染以城市及农村中的常见动物为主，故本专利的非人源物种挑选了较为常见的、同时比较容易得到的鸡、鸭、鹅和猪四种非人源物种。检测序列通过选取ncbi上各物种间相同基因的序列，并通过序列比对选取atp5b上的特异性序列区域，并辅以实验特异性验证。
实施例二人染色体dna遗传标记的确定
本发明通过筛选确定了如下22个人染色体str基因座：d3s1358、th01、d21s11、d18s51、pentae、d12s391、d6s1043、d2s1338、d1s1656、d5s818、d13s317、d7s820、d19s433、csf1po、pentad、vwa、d8s1179、tpox、fga、d2s441、d16s539和dys391，以及一个非str基因座的性别识别位点amel。其中包含了中国国家库的核心位点，性别识别位点，位于y染色体上的dys391，用于性别的辅助判断。
实施例三荧光标记复合扩增体系的组合方案设计
本发明对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黄、红、紫、橙六种荧光标记物，构建了6色荧光组合方案。在确定6色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，设计出基因座组合方式以及荧光标记类型。从生产成本及各基因座引物扩增效率等方面考虑，将上述检测位点分成了5组，分别为第一组fam标记：amel、d8s1179、d21s11、d18s51、d2s1338、猪和鸭的atp5b特异性区域，第二组hex标记：d2s441、d5s818、d7s820、d6s1043、pentad及鹅的atp5b特异性区域，第三组tam标记：d3s1358、th01、d19s433、d12s391、dys391和鸡的atp5b特异性区域，第四组rox标记：tpox、d16s539、d13s317和fga，第五组alex594标记：csf1po、vwa、d1s1656和pentae，内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为atto633。
首先上述23个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性的引物。引物设计采用primerpremier5软件，每条引物退火温度在60℃左右。不能产生引物二聚体、其它相互作用或交叉反应，扩增产物长度在70-500bp之间。对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到清晰单一扩增条带。
其次对非人源物种，通过检索基因库，选取表达atp合成酶中f1复合物中贝塔多肽的基因atp5b，使用dnaman对不同物种的相同基因进行dna序列比对，选取基因中dna的特异性部分，采用primerpremier5进行特异性的引物设计，不能产生引物二聚体、其它相互作用或交叉反应，对目标物种有清晰单一的扩增条带，并在复合扩增下对不同物种进行了优化验证，不会对目标物种外的其它物种出现非特异性的扩增峰，尤其对纯人类dna不会出现任何干扰峰。
上述每组之中通过引物扩增的片段长短将每个基因座分开，并优化引物序列使扩增范围内不存在非特异的条带，并具有高效的检出，同时对不同物种进行检测，确保物种的高度特异性。后调整引物浓度使其在人阳性对照和非人源物种阳性对照样本0.125ng下分别能够对人类样本进行准确的str分型，对非人源物种进行特异性的检出，且在人与非人源物种等量dna下扩增峰高度同颜色保持在50％以上。具体所使用的引物序列和浓度见下表1：
表1、各检测位点对应的引物序列及其浓度
实施例四扩增检测位点及其产物检测的实验过程
本发明提供的对疑是人源的未知生物样本进行物种及人源个体识别鉴定的复合pcr扩增试剂盒中包括：
1)pcrmastermix
2)primermix
3)controldna9948a
4)allelicladder等位基因分型标准品
5)size-500plus橙色荧光分子量内标
6)光谱校正标准物
上述pcrmastermix包括：dmso6-10mm、tris-buffer80-125mm、氯化钾100-125mm、硫酸铵50-65mm、三磷酸脱氧核苷酸(datp、dgtp、dttp、dctp)6-9mm、bsa1.5-3mg/ml、吐温201.5-2％和甜菜碱0.2-2m等，可以实现兼容扩增市面常见各种检材。
上述primermix包括扩增27个检测位点的所有引物(浓度见表1)，taq酶2-4u/25μl反应、氯化镁6-8mm等。
上述controldna9948a是人类基因组dna，购自苏州新海生物科技股份有限公司。
上述allelicladder等位基因分型标准品是本试剂盒所包含基因座所有不同基因分型的各等位基因在一定数量人群中的分布情况集合。
上述size-500plus橙色荧光分子量内标是一系列用于标定一定片段大小的扩增产物。
上述光谱校正标准物是6种不同大小片段的荧光pcr扩增产物。
1、反应体系的配置
2、扩增热循环实验方案
1)将pcr扩增管置于热循环仪上
2)选择下面推荐的程序进行扩增
3)扩增后的样品应避光保存
3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(size-500plus)组成上样混合物(25-50μlsize-500plus+1000μl去离子甲酰胺)。将9μl上样混合物与1μl扩增产物或系统中等位基因分型标准物(allelicladder)混合，避免产生气泡，尽快电泳。用遗传分析仪(abi3500/3130等系列)检测分析。电泳后的数据在genemapperid-x数据分析软件上分析，得到基因分型图谱和数据。
实施例五检测试剂盒灵敏度、特异性分析
灵敏度分析：将阳性对照按一定拷贝数倍比稀释后，经pcr扩增和毛细管电泳检测直至检测不到信号，该拷贝数即为最低检测线，也就是试剂盒的灵敏度。最高灵敏度可检测到低至0.125ng的dna样品。
特异性分析：本发明中27个检测位点的荧光标记复合扩增检验系统检验controldna9948、鸡、鸭、鹅、猪、狗、羊、鼠、牛、大肠杆菌等，controldna9948只出现人str位点，鸡、鸭、鹅、猪只有对应的特异性检测峰，对上述物种以外的物种不出现特异性扩增峰，表明该系统物种鉴定特异性高。
实施例六本发明方法在未知来源样本中的应用
用本发明方法所提供的试剂盒用于未知来源样本的检测，测定步骤如下：
1.收集未知来源样本的血斑：样本由某大学提供。
2.被检检材的处理：本案例中的检材为chelex提取样本，取2μl作为检测模板。
3.扩增检测：按照实施例2～5进行荧光标记、pcr扩增和遗传分析仪检测，选用本发明的试剂盒，检测结果如图7所示，并列于下表3：
表3：使用本发明方法和试剂盒对未知来源样本的检测结果
结果显示：该未知来源样本中含有少量的人dna，同时混有大量的猪dna。
综上，本发明通过物种间特异性核基因序列的筛选及验证，将含一种以上的非人源物种鉴定及人染色体str复合扩增检测联合，在不改变、增加检测方案或流程的情况下，在对未知来源的样本进行str检测时，如果样本是非人源dna或样本中混有非人源dna，可以通过一次检测准确判断出样本的情况，这在案件检测中，可以帮助检案人源快速的识别样本是否是人源样本，或样本中是否存在其他物种dna的干扰，同时根据检测峰的高度可以判断出样本中不同物种间dna含量的大概比例，帮助检案人员对出现dna浓度测试较高却检测分型不理想的结果起到更快速准确的判断，同时对存在非人源物种干扰的样本，可以同步参考str试剂厂商提供的种属特异性报告核对不同物种下的非特异性出峰情况，便于准确识别人str的真实目的峰，极大的提高结果判读的准确性、减少重复测试或核查的过程，减少对dna样本的损耗(尤其是含微量的dna)，极大的提高了检案效率。
上述说明并非对本发明方法及应用的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明方法的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110>宁波海尔施基因科技有限公司
<120>一种对疑是人源的未知生物样本进行物种及人源个体识别鉴定的复合pcr扩增方法
<130>cp1170954/cb
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