本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种采用dna及pcr技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法。
背景技术：
牛肉具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点，营养丰富，一直是发达国家肉类消费的首选，而我国的牛肉消费量也在逐年升高。2015年“僵尸肉”事件的发生，引起了社会广泛关注，肉类品质安全及贮藏时间倍受重视。然而，畜禽肉类贮藏保质期尚无标准明确要求，仅有《鲜冻分割牛肉》gb/t17238-2008中规定：“冻分割牛肉应贮存在低于-18℃的冷藏库内，贮存不超过12个月”，不过这仅是个推荐性标准，没有强制要求冻牛肉的保质期为12个月。对于其他贮藏温度，也同样没有贮藏标准可循。尤其是，对于牛肉贮藏在没有记录的情况下，目前没有发现对贮藏时间的研究报道。尤其是冷冻和冷藏牛肉贮藏时间的判定就比较重要了。
目前，冷冻贮藏是肉类最有效的方法之一，能抑制微生物的污染，延长保质期，但由于冻藏期间冰晶的形成、水分升华、蛋白质变性、脂肪氧化等，降低了肉的品质；冷藏贮藏期间牛肉的保质期相对较短且肉品质随着贮藏时间延长而降低；家庭常见的室温条件下贮藏，肉的保质期较短，受到微生物的污染和自身酶的作用容易导致畜肉腐败变质。在不同温度下贮藏，随贮藏时间的延长肉品质均会受到不同程度的影响。
在检测肉品质方面，理化指标(如水分含量、色差、ph等)检测较为普遍。挥发性盐基氮tvb-n作为反映肉品新鲜程度的一项重要指标，在贮藏过程中由于酶和细菌的作用，蛋白质分解而产生氨及胺类等碱性含氮物质，使肉品质下降。分子生物学技术日新月异，大规模现代化新设备、新技术和新方法等在食品科学研究领域中发挥着越来越重要的作用。许多过去不能解释或仅限于表观描述的有关牛肉品质的研究也正在向分子水平过渡。在分子生物学方面，dna质量检测、荧光定量pcr及pcr扩增在肉品掺假方面研究较多，但在针对检测肉品新鲜程度方面鲜有相关报道。随着贮藏时间的延长，肉类理化指标的变化规律研究报道较多，但没有将理化指标尤其是新鲜度指标与dna质量建立相关关系的研究。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种采用dna及pcr技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案由下述步骤组成：
1、分离提取贮藏的牛肉样品中牛dna，并对dna含量进行检测。
2、以提取的牛dna为模板，对牛线粒体基因12srrna和内参基因β-globin2的引物分别进行荧光定量pcr扩增，获得牛线粒体基因与内参基因扩增产物的ct值，计算δct值，δct值的计算公式为：δct＝∣ct牛线粒体基因-ct内参基因∣。
3、-20℃贮藏温度下，若dna含量大于950μg/g，说明牛肉样品是一级鲜肉；若dna含量在950μg/g以下，说明牛肉样品是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若dna含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若dna含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分；牛肉样品为一级鲜肉时，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y1＝0.8489x-8.0306，其中y1代表贮藏月数，x代表δct值，r2＝0.9142；牛肉样品为二级鲜肉时，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y1＝-14.185x+172.63，r2＝0.9506；
4℃贮藏温度下，若dna含量大于750μg/g，说明牛肉样品是一级鲜肉；若dna含量在750μg/g以下，说明牛肉样品是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若dna含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若dna含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分；若牛肉样品为一级鲜肉，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y2＝0.793x-7.3563，其中y2代表贮藏天数，r2＝0.9899；若牛肉样品为二级鲜肉，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y2＝-1.3227x+17.656，r2＝0.9607；
10℃贮藏温度下，若dna含量大于1000μg/g，说明牛肉样品是一级鲜肉；若dna含量在1000μg/g以下，说明牛肉样品是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若dna含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若dna含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分；若牛肉样品为一级鲜肉，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y3＝7.2691x-67.887，其中y3代表贮藏小时数，r2＝0.9046；若牛肉样品为二级鲜肉，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y3＝-13.603x+189.77，r2＝0.9779；
20℃贮藏温度下，若dna含量大于850μg/g，说明牛肉样品是一级鲜肉；若dna含量在850μg/g以下，说明牛肉样品是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若dna含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若dna含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分；若牛肉样品为一级鲜肉，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y3＝3.6923x-34.031，r2＝1；若牛肉样品为二级鲜肉，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y3＝-9.1462x+114.2，r2＝0.907。
上述步骤1中，分离提取贮藏的牛肉样品中牛dna的方法如下：
(1)称取0.3g牛肉糜于2ml离心管中，加入550μldna提取缓冲液、150μl5％sds裂解液及18μl20mg/ml的蛋白酶k水溶液，于55℃下水浴消化4小时，然后加入700μl苯酚，摇晃10min，于12000r/min下离心10min；
(2)取上清液置于新离心管中，加入400μl苯酚与氯仿、异戊醇体积比为25:24:1的混合液，摇晃10min，于12000r/min下离心10min，再将上清液置于新离心管中，加入400μl氯仿与异戊醇体积比为24:1的混合液，摇晃10min，于12000r/min下离心10min；
(3)重复步骤(2)一次，取上清液置于新离心管中，加入800μl的冰无水乙醇，反复摇匀后，置于冰箱中-18℃静置30min，静置后于12000r/min下离心10min，弃去上层清液，加入体积分数为75％的冰乙醇水溶液，用枪头反复吹打离心管中的溶液，然后于12000r/min下离心10min，弃去上层清液在通风橱内风干30min后，加入50μlte溶解dna，置于冷藏冰箱中，-20℃保存备用。
上述步骤2中，所述牛内参基因的引物序列如下：
上游引物：5’-cggcggcgggcggcgcgggctgggcgggaaggcccatggcaagaagg-3’；
下游引物：5’-gccggcccgccgcgcccgtcccgccgctcacrcagcgcagcaaagg-3’。
上述步骤2中，所述牛线粒体基因12srrna的引物序列如下：
上游引物为5’-cccatttcacccttactacacca-3’；
下游引物为5’-attgagtggatttgctgggata-3’。
上述步骤2中，所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：dna1μl，2×2×ultalsybrmixture5μl，上、下游引物各0.3μl，ddh2o3.4μl；反应程序为：95℃变性10min，以95℃15s、63℃30s、72℃30s扩增40个循环。
本发明针对不同贮藏条件(冻藏-20℃、冷藏4℃、中温10℃和室温20℃)下牛肉随贮藏时间在一定范围内新鲜品质的变化，通过分离提取其中牛dna，测定牛dna含量，确定该牛肉所处新鲜程度(一级鲜肉、二级鲜肉和变质肉)；再以此dna为模板进行荧光定量pcr扩增，根据不同贮藏温度、不同新鲜程度下牛肉所处时间与荧光定量pcr扩增的ct值差的数学方程，精确判断牛肉贮藏放置的时间。为新鲜原料牛肉的时间鉴定提供了一种准确、可靠的方法，对于牛肉的质量安全检测具有重要的意义，有利于肉品加工企业和广大消费者根据贮藏时间选择牛肉原料。与现有技术相比，其有益效果是：
1、首次建立了牛肉不同贮藏时间的鉴定方法，为保障高品质牛肉的选择提供了理论基础。
2、首次建立了牛肉中牛dna质量与肉新鲜度的关联性，为牛肉新鲜度的鉴别提供一种新方法，对于鉴别牛肉随贮藏环境及时间的品质变化提供有力的理论依据和指导。
3、针对超市或零售市场中牛肉存放的各种温度，可以依据本发明方法判定牛肉新鲜度和贮藏时间。
4、本发明在牛肉上所得的实验结果，可以作为牛肉混合贮藏温度精确时间判定的参考，同样可以作为其他肉类的参考。
5、本发明操作简单、结果准确、应用前景广阔，对于牛肉的质量安全检测具有重要的意义。
附图说明
图1是-20℃贮藏条件下牛dna含量与贮藏时间测定结果图。
图2是-20℃贮藏条件下牛肉tvb-n含量测定结果。
图3是-20℃贮藏条件下牛dna的定量扩增δct值与贮藏时间测定结果图。
图4是4℃贮藏条件下牛dna含量与贮藏时间测定结果图。
图5是4℃贮藏条件下牛肉tvb-n含量测定结果。
图6是4℃贮藏条件下牛dna的定量扩增δct值与贮藏时间测定结果图。
图7是10℃贮藏条件下牛dna含量与贮藏时间测定结果图。
图8是10℃贮藏条件下牛肉tvb-n含量测定结果。
图9是10℃贮藏条件下牛dna的定量扩增δct值与贮藏时间测定结果图。
图10是20℃贮藏条件下牛dna含量与贮藏时间测定结果图。
图11是20℃贮藏条件下牛肉tvb-n含量测定结果。
图12是20℃贮藏条件下牛dna的定量扩增δct值与贮藏时间测定结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更详细的描述，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
(一)实验材料
1、样品来源
牛肉样品为屠宰后放在冷藏条件下大约12小时的牛臀肉，装入冰盒中带回。分别置于-20℃(冰箱冻藏温度)保存11个月、4℃(冰箱冷藏温度)保存5天、10℃(中间温度)保存60小时、20℃(室温)保存24小时，待用。
2、试验试剂
混合指示剂(甲基红、次甲基蓝)、dna提取缓冲液(nacl1mol/l、tris-cl0.5mol/l、edta-na0.5mol/l、ph调至7.5～8.0)、5％sds裂解液(将20g十二烷基硫酸钠加入80ml双蒸水中，于68℃加热溶解后，用浓hcl调至ph＝7.2，用双蒸水定容至100ml)、蛋白酶k(20mg/ml)、冰无水乙醇(-20℃)、体积分数为70％的冰乙醇水溶液(-20℃)、te缓冲液(将2mlph＝8.0的1mol/ltris-hcl缓冲液和0.4ml0.5mol/ledta水溶液混合均匀后，加蒸馏水定容至200ml，调ph至8.0配制而成)、tae缓冲溶液、琼脂糖、2×estapmastermix、dm2000marker、2×ultalsybrmixture、dnase/dna-freewater。
3、主要仪器
超高速低温离心机(3k30，美国sigma公司)、低速大容量离心机(dl-4c，上海安亭科学仪器厂)、精密微量移液枪(德国eppendorf)、漩涡混合仪(xw-80a，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、超微量核酸分析仪(na-200，杭州艾普仪器设备有限公司)、荧光定量pcr仪(aritik，美国热电公司)、烧杯、移液管、试管等玻璃器皿。
(二)实验方法
1、牛肉中tvb-n含量的测定
参照gb/t5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》进行tvb-n含量测定，tvb-n含量≦15mg/100g，牛肉为一级鲜肉；tvb-n含量在15～25mg/100g，牛肉为二级鲜肉；tvb-n含量≧25mg/100g，牛肉为变质肉。
2、牛肉中dna提取及含量检测
(1)分别称取0.3g牛肉糜于2ml离心管中，加入550μldna提取缓冲液、150μl5％sds裂解液及18μl20mg/ml的蛋白酶k水溶液，于55℃下水浴消化4小时，然后加入700μl苯酚，摇晃10min，于12000r/min下离心10min；
(2)取上清液置于新离心管中，加入400μl苯酚与氯仿、异戊醇体积比为25:24:1的混合液，摇晃10min，于12000r/min下离心10min，再将上清液置于新离心管中，加入400μl氯仿与异戊醇体积比为24:1的混合液，摇晃10min，于12000r/min下离心10min；
(3)重复步骤(2)一次，取上清液置于新离心管中，加入800μl的冰无水乙醇，反复摇匀后，置于冰箱中-18℃静置30min，静置后于12000r/min下离心10min，弃去上层清液，加入体积分数为75％的冰乙醇水溶液，用枪头反复吹打离心管中的溶液，然后于12000r/min下离心10min，弃去上层清液在通风橱内风干30min后，加入50μlte溶解dna，置于冷藏冰箱中，-20℃保存备用。
取解冻的dna样液1μl，在超微量分光光度计上检测其在260nm和280nm处的吸收值，测定5次取平均数，测出的浓度为c0(ng/μl)，肉样的质量为m(g)，水分含量为w％，肉样干物质中dna含量c1(μg/g)的计算公式为：
3、牛肉中dna的荧光定量pcr
以提取的dna为模板，对牛基因的特异性引物进行荧光定量pcr扩增，反应体系(10μl)：dna模板1μl，2×2×ultalsybrmixture5μl，上、下游引物各0.3μl，ddh2o3.4μl；反应程序：95℃变性10min，以95℃15s、63℃30s、72℃30s扩增40个循环。牛肉荧光定量pcr结果用δct值来表示，δct值的计算公式为：
δct＝∣ct牛线粒体基因-ct内参基因∣
牛内参基因β-globin2的引物序列：上游引物为5’-cggcggcgggcggcgcgggctgggcgggaaggcccatggcaagaagg-3’，下游引物为5’-gccggcccgccgcgcccgtcccgccgctcacrcagcgcagcaaagg-3’。牛线粒体基因12srrna的引物序列：上游引物为5’-cccatttcacccttactacacca-3’，下游引物为5’-attgagtggatttgctgggata-3’。
(三)试验结果与分析
-20℃贮藏温度下，牛肉样品在不同时间下的dna含量结果为图1，tvb-n含量检测结果为图2，δct值结果为图3。由图1可见，dna含量大于950μg/g时，牛肉样品是一级鲜肉；dna含量在950μg/g以下时，牛肉样品可能是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若dna含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若dna含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分。由图2可见，该方法确定的牛肉样品新鲜程度与tvb-n含量确定的结果一致，说明本发明确定牛肉样品新鲜程度的方法是准确、可靠的。因此，3月和11月可以分别作为冷冻贮藏下牛肉为一级鲜肉、二级鲜肉和变质肉的临界时间。由图3可见，当牛肉样品为一级鲜肉时，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y1＝0.8489x-8.0306，其中y1代表贮藏月数，x代表δct值，r2＝0.9142；当牛肉样品为二级鲜肉时，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y1＝-14.185x+172.63，r2＝0.9506。
4℃贮藏温度下，牛肉样品在不同时间下的dna含量结果为图4，tvb-n含量检测结果为图5，δct值结果为图6。由图4可见，dna含量大于750μg/g时，牛肉样品是一级鲜肉；dna含量在750μg/g以下时，牛肉样品可能是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若dna含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若dna含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分。由图5可见，该方法确定的牛肉样品新鲜程度与tvb-n含量确定的结果一致，说明本发明确定牛肉样品新鲜程度的方法是准确、可靠的。因此，2.5天和5天可以分别作为低温冷藏下牛肉为一级鲜肉、二级鲜肉和变质肉的临界时间。由图6可见，当牛肉样品为一级鲜肉时，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y2＝0.793x-7.3563，其中y2代表贮藏天数，r2＝0.9899；当牛肉样品为二级鲜肉时，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y2＝-1.3227x+17.656，r2＝0.9607。
10℃贮藏温度下，牛肉样品在不同时间下的dna含量结果为图7，tvb-n含量检测结果为图8，δct值结果为图9。由图8可见，dna含量大于1000μg/g时，牛肉样品是一级鲜肉；dna含量在1000μg/g以下时，牛肉样品可能是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若dna含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若dna含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分。由图9可见，该方法确定的牛肉样品新鲜程度与tvb-n含量确定的结果一致，说明本发明确定牛肉样品新鲜程度的方法是准确、可靠的。因此，24小时和60小时可以分别作为中温贮藏下牛肉为一级鲜肉、二级鲜肉和变质肉的临界时间。由图10可见，当牛肉样品为一级鲜肉时，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y3＝7.2691x-67.887，其中y3代表贮藏小时数，r2＝0.9046；当牛肉样品为二级鲜肉时，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y3＝-13.603x+189.77，r2＝0.9779。
20℃贮藏温度下，牛肉样品在不同时间下的dna含量结果为图10，tvb-n含量检测结果为图11，δct值结果为图12。由图10可见，dna含量大于850μg/g时，牛肉样品是一级鲜肉；dna含量在850μg/g以下时，牛肉样品可能是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若dna含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若dna含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分。由图11可见，该方法确定的牛肉样品新鲜程度与tvb-n含量确定的结果一致，说明本发明确定牛肉样品新鲜程度的方法是准确、可靠的。因此，10小时和24小时可以分别作为室温贮藏下牛肉一级鲜肉、二级鲜肉和变质肉的临界时间。由图12可见，当牛肉样品为一级鲜肉，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y3＝3.6923x-34.031，r2＝1；若牛肉样品为二级鲜肉，贮藏时间与δct值拟合的数学方程为y3＝-9.1462x+114.2，r2＝0.907。