一种融合蛋白和多克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及抗体制备技术领域，尤其是一种融合蛋白和多克隆抗体及其应用。

背景技术：

癌症是人类头号杀手，以往癌症予人感觉为不治之症，但随着医学的发展，通过手术、放射治疗、化疗及标靶药物治疗等均能有效延长病人寿命。癌症发生的原因很多，危险因素也多种多样，如化学因素、物理因素、生物因素等。

目前在癌症研究发现融合蛋白不仅在肿瘤发生中起重要作用，而且具有巨大的转化意义，可以作为治疗靶点和分子标志物。融合蛋白产生的机制包括：1)各种染色体变化(包括dna插入、扩增、缺失、重排、转位)造成的融合基因所产生的融合蛋白；2)各种rna异常剪接导致的融合rna翻译成的融合蛋白。

最著名的融合蛋白是由融合基因费城染色体产生的bcr–abl蛋白。这一发现始于上个世纪60年代,在慢性粒性白血病病人中发现的费城染色体，拉开了融合蛋白与癌症的研究序幕，bcr–abl融合基因极其蛋白存在于95％慢性粒细胞白血病中的，bcr–abl不仅成为cml的重要诊断标志物，而且其抑制剂格列卫(gleevec)把致死率曾经极高的cml的治愈率提高了61％。

目前已经在多种癌症中发现了融合蛋白，并且开发了针对融合蛋白的临床药物。融合蛋白可促进肿瘤的发生和发展，并可作为肿瘤的分子诊断和治疗靶标。随着rna深测序技术的发展,越来越多的融合rna及其融合蛋白产物逐渐被发现。目前融合蛋白的检测方法主要有：

1)在dna水平检测融合基因。荧光原位杂交(fish)是目前检测肿瘤组织中染色体重排最有效的诊断技术之一。已获得fda批准，被作为临床实验中检测alk融合基因的金标准，该技术也是ros1融合基因临床检测的常用方法。例如，fish断裂探针为正常alk或ros1基因的5'-和3'-端不同标记有绿色和红色荧光的探针，当存在基因重排时，绿色和红色信号因重组融合伙伴的置换而“断裂”显现为分离较远的单色信号。作为一种常规的筛选方法，fish检测成本相对较高，需要专用设备，试剂昂贵，处理时间较长，检测结果难以判读、主观性强等不足，在实际应用上还存在一些限制。

2)在rna水平检测融合rna。rt-pcr技术简单快速准确，可以明确基因融合型，适用于微量组织标本，因而rt-pcr技术在筛选和确认肺癌基因重组中具有独特的优势。但rt-pcr对组织中dna质量要求较高，结果常常出现假阳性。

3)在蛋白水平检测融合蛋白。部分融合基因可编码蛋白质，对肿瘤的发生发展起到重要的作用。有的融合基因及其编码的蛋白质可以作为指示癌症发生和发展的标志物。所以，在癌症的融合基因的研究过程中，需要同时研究其基因水平和蛋白水平的表达。融合基因作为一个生物体内全新的产物，其编码的蛋白质也是前所未有的，所以一个特异性针对融合基因编码蛋白质的抗体对于融合基因的研究具有极其重要的意义。免疫组织化学技术(ihc)是用探针标记的抗体定位组织样本中特异性抗原。该技术已广泛应用于临床，而且成本低、简便快速、准确。新近采用高敏感高特异抗体所进行的ihc染色方法检测alk、ros1等基因的重排，结果发现与断裂fish技术相比，准确度可达到100％，特异性高达99％。

由此可见，融合蛋白特异性抗体对于推动融合蛋白研究的发展有着不可替代的作用。

技术实现要素：

本申请的发明人在研究肿瘤机制和治疗方法的过程中，首次发现了一种融合蛋白astn2-pappa，其是rna异常剪接形成的融合rna翻译后的融合蛋白。发明人在研究过程中发现astn2-pappa在食管癌中特异性表达，故可作为肿瘤标志物和治疗靶点。

目前，已有针对astn2和pappa基因编码的蛋白的抗体，却没有针对两个基因融合之后所编码的蛋白astn2-pappa(简称a-p)的抗体。

本发明针对一种肿瘤中特异性扩增的融合astn2-pappa，设计并制备出特异性针对该融合蛋白的多克隆抗体，为该融合基因的研究提供了便利的工具和有效的手段。在临床转化方面，astn2-pappa不仅可以转化为分子诊断标志物，还可以开发针对astn2-pappa的特异性抗体药物用于临床肿瘤免疫治疗。

astn2-pappa是一个全新的融合基因并且编码蛋白质，其在癌症的发生发展中起到重要作用，目前还没有针对a-p的特异性抗体，限制了相关的肿瘤研究，也限制了临床相关的肿瘤标志物和抗体药物的开发应用。

为了解决上述问题，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

作为本发明的第一个方面，本发明提供一种融合蛋白(即astn2-pappa)，所述融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，或所述融合蛋白的编码序列如seqidno.2所示。

作为本发明的另一个方面，本发明提供一种多克隆抗体，所述抗体的抗原为上述的融合蛋白或上述融合蛋白中的至少一段多肽。

优选地，所述多肽覆盖所述融合蛋白的融合位点。

作为本发明的另一个方面，本发明提供上述抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)构建抗原表达载体，其中，表达抗原的核苷酸序列覆盖上述的融合蛋白的融合位点左右至少12bp的核苷酸序列；

(2)将步骤(1)获得载体转化至感受态细胞，以纯化抗原；

(3)用步骤(2)获得的纯化后的抗原免疫兔子并收集血清，得到所述的多克隆抗体。由此，融合位点两侧的至少4个氨基酸，即至少8个氨基酸长度的肽段作为抗原，保证抗原抗体结合特异性。其中，免疫动物包括但不限于兔子，还可以是小鼠、大鼠等。

优选地，上述制备方法还包括步骤(4)：采用盐析法纯化步骤(3)所得血清以获得多克隆抗体。其中纯化血清的方法包括但不限于盐析法。

优选地，所述载体采用质粒ppycagip。其中，载体除了可以是质粒ppycagip外，还可以是其他质粒，只要能正常表达所述抗原即可。

优选地，所述细胞为bl21。其中，感受态细胞包括但不限于bl21，还可以是其它细胞，例如dh10bac等。

作为本发明的另一个方面，本发明提供上述多克隆抗体在制备检测上述的融合蛋白及其表水平的试剂盒中的应用。

作为本发明的另一个方面，本发明提供上述的多克隆抗体在制备治疗肿瘤的药物或研究上述的融合蛋白中的应用。

作为本发明的另一个方面，本发明提供一种治疗肿瘤的药物，所述药物含有上述的多克隆抗体。其中，所述肿瘤优选食管癌。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明中首次发现的融合蛋白astn2-pappa是恶性肿瘤中出现的融合蛋白，研究表明其与肿瘤的生长、转移有密切关系，本发明专门设计的astn2-pappa多克隆抗体可以鉴定该融合蛋白,为研究该融合蛋白的蛋白水平和分子机制提供了可靠的工具；

astn2-pappa作为与肿瘤发生发展关系密切的融合蛋白，在肿瘤的诊断和治疗方面可作为分子标志物和治疗靶点，本发明所提供的针对astn2-pappa融合蛋白的多克隆抗体为将来的诊断和抗体治疗提供了可能。

附图说明

图1为ppycagip质粒的结构示意图；

图2为目的片段的电泳图；

图3为elisa检测结果，其中(-)：阴性血清1：1000od<0.2；elisa滴度>1:64000；

图4为westernblot实验检测astn2-pappa融合蛋白的结果图；

图5为astn2-pappa抗体检测肿瘤细胞表达差异的结果图；

图6为astn2-pappa抗体检测正常组织向癌组织转化过程中的变化图。

具体实施方式

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，在特别的方面，本发明涉及抗体的制备及抗原、抗体的特异性分析，多克隆抗体在肿瘤研究及临床治疗中的应用。

本发明提供一种抗融合蛋白astn2-pappa的特异性抗原及其多克隆抗体的特异性分析方法。该抗体特异性结合到人源astn2-pappa融合蛋白的融合区域，而不是结合pappa或astn2的非融合区域。当采用本发明的astn2-pappa多克隆抗体检测到a-p融合蛋白，则说明astn2和pappa发生了融合；本发明的融合蛋白astn2-pappa多克隆抗体在将来可用于融合基因在肿瘤中的作用的研究及临床诊断和治疗。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本申请的具体实施方式，如宿主动物、抗体纯化方法、克隆载体及感受态细胞包括但并不限于以下所述。本领域技术人员在不偏离本申请的精神和范围的情况下，可对本发明做出适当改动。在没有明示的情况下，所使用的试剂及其用量单位都是本领域常规的。

实施例1astn2-pappa融合蛋白的发现

实验方法：收集肿瘤病人的病理组织样本，通过高通量测序技术，发现在恶性肿瘤中，astn2基因(id：23245)和pappa基因(id：5069)发生了融合，形成了新的融合蛋白astn2-pappa，并确定了发生融合的部位及其序列。

(1)融合蛋白astn2-pappa的核苷酸序列如下所示：

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其中，*标记为发生融合的位点。

(2)融合蛋白astn2-pappa的氨基酸序列

maaagarlspgpgsglrgrprlcfhpgpppllpllllfllllppppllagataaasrepdspcrlktvtvstlpalresdigwsgaragagagtgagaaaaaaspgspgsagtaaesrlllfvrnelpgriavqddldntelpfftlemsgtaadislvhwrqqwlengtlyfhvsmsssgqlaqataptlqepseiveeqmhilhisvmggliallllllvftvalyaqrrwqkrrripqksasteatheihyipsvllgpqaresfrssrlqthnsvigvpiretpilddydceedeepprranhvsredefgsqvthtldslghpgeekvdfekkaaaeatqetveslmqkfkesfrantpieigqlqpplrstsagkrkrrsksrggisfgrakgtsgseaddetqltfyteqyrsrrrskgllkspvnktaltliavsscilamvcgsqmscpltvkvtlhvpehfiadgssfvvsegsyldisdwlnpaklslyyqinatspwvrdlcgqrttdaceqlcdpetgecschegyapdpvhrhlcvrsdwgqsegpwpyttlergydlvtgeqapekilrstfslgqglwlpvsksfvvppvelsinplascktdvlvtedpadvreeamlstyfetindllssfgpvrdcsrnnggctrnfkcvsdrqvdssgcvcpeelkpmkdgsgcydhskgidcsdgfnggceqlclqqtlplpydatsstifmfcgcveeyklapdgksclmlsdvcegpkclkpdskfndtlfgemlhgynnrtqhvnqgqvfqmtfrennfikdfpqladgllviplpveeqcrgvlseplpdlqlltgdirydeamgypmvqqwrvrsnlyrvklstitlaagftnvlkiltkessreellsfiqhygshyiaealygseltciihfpskkvqqqlwlqyqkettelgskkelksmpfitylsglltaqmlsddqlisgveirceekgrcpstchlcrrpgkeqlsptpvlleinrvvplytliqdngtkeafksalmssywcsgkgdviddwcrcdlsafdanglpncspllqpvlrlsptvepsstvvslewvdvqpaigtkvsdyilqhkkvdeytdtdlytggflsfaddllsglgtscvaagrshgevpevsiysvifkclepdglykftlyavdtrgrhselstvtlrtacplvddnkaeeiadkiynlyngytsgkeqqmayntlmevsasmlfrvqhhynshyekfgdfvwrsedelgprkahlilrrlervsshcssllrsayiqsrvetvpylfcrseevrpagmvwysilkdtkitceekmvsmarntygeskgr*sqcpglntrvliptvsyseelllsegmcfhlqkrmdsphepslsnhtglasghavitlclldedhvgsmhiqitfytrhpw(seqidno.1)

其中，*标记为发生融合的位点。

实施例2抗原表达载体的构建

1.设计引进限制性酶切位点的克隆引物

f(noti)：5’—gtcaatggcccgaaacacg—3’(seqidno：3)

r(xhoi)：5’—ggttcatggggactgtccatc—3’(seqidno：4)

2.以flag-a-p/ppycagip质粒为模板(模板示意图如图1所示)，用f(noti)和r(xhoi)引物进行pcr得到162bp目的片段，该目片段的序列在上述seqidno.2中用下划线示出；

3.用noti和xhoi酶切pcr产物，并进行胶回收(电泳结果如图2所示)，同时用noti和xhoi酶切pgex-4t-1质粒(购自amershambiosciences)，并跑胶回收5kb载体片段；

4.连接插入目的片段与载体片段，4℃过夜；

5.将连接产物转化至大肠杆菌dh5α中；

6.挑菌，小抽酶切鉴定，取正确的a-p/pgex-4t-1克隆进行测序。

实施例3抗原纯化

1.将实施例2制备得到的a-p/pgex-4t-1质粒转化至bl21感受态中；

2.挑菌到5mlyta(蛋白胨16g/l；酵母提取物10g/l；氯化钠5g/l)中小摇过夜；

3.1∶30接种2lyta摇3h；30℃0.2mm(gst)或1mm(his)iptg诱导3h；

4.10000g，3min离心收菌，分4管装，分别用15mlpbs(gst)重悬，1∶100加入

pmsf(终浓度1mm)；

5.超声，强度：10-12；时间：8-10min；间隔：2s；

6.超声后加入1％tritonx-100，离心10000g，10min，取上清；

7.离心期间处理gstbeads：洗3次，10倍体积pbs，500g，5min；(存储：80％)将离心后的菌液上清与处理后的gstbeads(每ml可结合5-10mg蛋白)混匀，4℃，旋转结合2-4h；

8.洗涤：用10倍体积pbs洗3次，每次rt转动5-10min，离心；

9.洗脱；洗脱缓冲液：0.1mtris-cl，0.2mnacl，61.5ngglutathine，0.1％

tritonx-100；4℃转动30min-1h，离心；洗脱2-3次；

10.跑胶，考马斯亮蓝染色定量。

其中，gst是一个标签蛋白，它能与谷胱甘肽相结合。因此将本申请的抗原多肽与gst融合后，就能通过融合蛋白上的gst与固相化在载体上的谷胱甘肽亲和结合，再利用谷胱甘肽交换洗脱的原理来纯化融合蛋白。

实施例4免疫兔子

将实施例3制备得到的gst融合蛋白抗原分别注射两只成年雄性兔子，分两次进行免疫，两次之间间隔1-2个月左右，总共用5mg的实施例3制备得到的gst融合蛋白抗原。

第二次免疫结束后对兔子血清中抗体的效价进行elisa检测(elisa结果如图3所示)，当效价达到1:1000时，即可将兔子放血，收集血清，用于纯化抗体。

实施例5抗体纯化(盐析法)

1.将5ml含有抗体的血清(由实施例4制得)与0.01mpbs在离心管内等体积混合，向其中加入10ml饱和硫酸铵溶液，边滴加边摇匀，然后置于2到8摄氏度静置过夜。

2.将步骤1中的待分离物于离心机内离心，8000r/min离心15到20分钟，除上清。

3.将步骤2中离心后的沉淀用2ml0.01mpbs溶解，然后缓慢加入3ml饱和硫酸铵溶液，边滴加边摇匀，然后置于2到8摄氏度静置2小时。

4.将步骤3中的待分离物于离心机内离心，8000r/min离心15到20分钟，除上清。

5.将步骤4中离心后的沉淀用1.65ml0.01mpbs溶解，然后缓慢加入3.35ml饱和硫酸铵溶液，边滴加边摇匀，然后置于2到8摄氏度静置2小时。

6.将步骤5中的待分离物于离心机内离心，8000r/min离心15到20分钟，除上清。

7.将步骤6中离心后的沉淀用1ml0.01mpbs溶解,转移到md14000透析袋内，用0.01mpbs进行透析，透析4次以上，每次至少1小时以上。

8.将最终得到的抗体溶液分装保存，每管500ul，分别收取a-p过表达组(a-p)、a-p敲除组(sha-p)和野生型细胞(wt)的蛋白，wb检测抗体的特异性。

结果如图4所示，在a-p组检测到较高水平的a-p，在sha-p组检测到很低水平的a-p，在wt组检测到中等水平a-p，说明该抗体可以特异性靶向融合蛋白a-p。

实施例6人融合蛋白astn2-pappa多克隆抗体的应用

(1)本发明制备得到高特异性的人融合蛋白a-p多克隆抗体采用westernblot实验可检测正常细胞、肿瘤细胞及用药后肿瘤细胞的表达差异(如图5所示)。

(2)本发明提供的抗体在实际应用中能够应用于ihc、elisa等免疫学试验中检测人融合蛋白a-p在正常组织向癌组织转化过程中的变化情况，从而探讨人融合蛋白在肿瘤相关疾病中的意义(如图6所示)。

(3)本发明提供的多克隆抗体有助于探讨融合蛋白a-p在肿瘤疾病发生发展过程中的作用机制，在临床应用中更利于抑制药物对肿瘤抑制作用的研究。融合蛋白a-p的抗体在肿瘤相关研究及治疗方面的应用，包括但不限于以上所述。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

sequencelisting

<110>张灏

<120>一种融合蛋白和多克隆抗体及其应用

<130>2018

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<213>智人

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