一条光呼吸代谢改造支路及其在C3植物中的应用的制作方法

文档序号：15237954发布日期：2018-08-24 07:47阅读：812来源：国知局

本发明涉及植物基因工技术程领域，具体涉及一条光呼吸代谢改造支路及其相关基因与该支路在c3植物中的应用。

背景技术：

光呼吸又称为c2循环，是指植物绿色组织利用光能，吸收o2并放出co2的过程，光呼吸需要叶绿体、线粒体、过氧化物酶体和细胞质的共同参与，并依赖光和o2，两者缺一不可(bauweh,hagemannm,ferniear.photorespiration:players,partnersandorigin[j].trendsinplantscience,2010,15(6):330-336)。光呼吸是c3植物中仅次于光合作用的第二大代谢流，正常环境条件下，c3植物光呼吸可消耗其光合产物的25～30％，而高温、干旱、高光等逆境条件下这种损耗会更为严重(leegoodrc,leapj,adcockmd,etal..theregulationandcontrolofphotorespiration.journalofexperimentalbotany,1995,46(290):1397-1414；somervillecr.anearlyarabidopsisdemonstration.resolvingafewissuesconcerningphotorespiration.plantphysiology,2001,125(1):20-24)。高光呼吸不但会降低植物光合效率，而且其释放的co2对大气的碳排放的贡献也不容小觑；据估测，植物呼吸作用每年能向大气排放30gt左右的碳，其中大部分来自光呼吸(guillaumet.istherecoveryof(photo)respiratoryco2andintermediatesminimal？.neurosurgery,2013,198(2):334-338)。针对如何降低c3植物高呼吸，提高光能转化效率，科学家们已做了大量的研究探索，例如尝试提高rubisco的羧化/加氧比或将c4光合机理导入c3植物，然而，局限于技术和理论基础，这两方面至今尚未获得预期效果(zhuxg,longsp,ortdr.improvingphotosyntheticefficiencyforgreateryield.annualreviewofplantbiology,2010,61(4):235-261；voncs,quickwp,furbankrt.thedevelopmentofc4rice:currentprogressandfuturechallenges.science,2012,336(6089):1671-1672)。

近年来，通过在c3植物叶绿体中构建光呼吸代谢支路从而创建co2浓缩机制(ccms)已成为研究的热点。2007年，kebeish等人将大肠杆菌中代谢乙醇酸的3个酶(gdh、gcl、tsr)导入拟南芥并定位到叶绿体中，在叶绿体中形成了一条分流乙醇酸形成甘油酸同时释放co2的光呼吸捷径，这样不但能节省能量，还能提高叶绿体中rubisco周围的co2浓度，形成新的光合co2浓缩机制，从理论分析判断可以显著提高植物光合效率进而提高生物量。他们随后对转基因植株的分析结果显示，相对于野生型，转基因植株的光合效率和生物量确实得到了显著提升(kebeishr,niessenm,thiruveedhik,etal..chloroplasticphotorespiratorybypassincreasesphotosynthesisandbiomassproductioninarabidopsisthaliana.naturebiotechnology,2007,25(5):593-599)。在这以后，maier等(2012)尝试将植物中的乙醇酸氧化酶(glo)、过氧化氢酶(cat)、苹果酸合酶(ms)等基因导入拟南芥并定位到叶绿体中，转基因植株的分析结果显示，虽然其光合功能指标无明显改善，但生物量却有一定提升(maiera,fahnenstichh,voncaemmerers,etal..transgenicintroductionofaglycolateoxidativecycleintoa.thalianachloroplastsleadstogrowthimprovement.frontiersinplantscience,2012,3:38)；2015年，dalal等人成功在生物能源作物亚麻荠中重复了kebeish等人的结果，获得了油籽产量提高了57～73％的亚麻荠植株(dalalj,lopezh,vasaninb,etal..aphotorespiratorybypassincreasesplantgrowthandseedyieldinbiofuelcropcamelinasativa[j].biotechnologyforbiofuels,2015,8(1):175.)。研究者认为，kebeish等人的光呼吸代谢改造支路最为成功，有望应用于实际生产(peterhanselc,maurinovg.photorespirationredesigned.plantphysiology,2011,155(1):49-55)。然而，目前尚未有对粮食作物光呼吸进行代谢的报道，同时，新的更为高效的光呼吸代谢改造支路还有待进一步发掘。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一条光呼吸代谢改造支路(goc支路)，对c3植物光呼吸进行改造，从而降低光呼吸，提高光合效率，进而提高植物生物量。

本发明提供了一条新的光呼吸代谢改造支路，并证实可在粮食作物水稻中应用，获得了光合速率提高、生物量增加的水稻转基因株系，对深入阐明高光效机理、对作物与可再生能源生产、甚至对减少co2排放均具有深远意义。

本发明的另一目的是提供构成上述光呼吸代谢改造支路的三个融合蛋白tpc-osglo3、tpc-osoxo3和tpc-oscatc。

本发明的又一目的是提供上述融合蛋白tpc-osglo3、tpc-osoxo3和tpc-oscatc的编码基因。

本发明的又一目的是提供用于表达上述融合蛋白tpc-osglo3、tpc-osoxo3和tpc-oscatc的编码基因的表达盒序列。

本发明的再一目的在于提供上述光呼吸代谢改造支路、融合蛋白、编码基因或表达盒序列在制备转基因植物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一条goc光呼吸代谢改造支路，该支路包括osglo3、oscat2与osoxo3三个蛋白。

构成上述goc光呼吸代谢改造支路的三个融合蛋白，包括tpc-osglo3、tpc-osoxo3和tpc-oscatc；

为了将上述三个蛋白定位于植物叶绿体，在上述蛋白的n端融合水稻叶绿体信号肽tpc，从而组成tpc-osglo3、tpc-osoxo3与tpc-oscatc融合蛋白。

tpc-osglo3融合蛋白，其氨基酸序列如seqidno:3所示，或该序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且功能与seqidno:3所示序列相同的序列。

上述tpc-osglo3融合蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列优选如seqidno:1所示。或在严格条件下可与seqidno:1杂交并且编码上述tpc-osglo3融合蛋白的dna分子，所述的严格条件可为在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗杂交膜一次，或者与seqidno:1的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)，并且编码上述tpc-osglo3融合蛋白的dna分子。

上述tpc-osglo3融合蛋白编码基因的表达盒pubi-tpc-osglo3-tnos。该表达盒基因的核苷酸序列优选如seqidno:2所示。或在严格条件下可与seqidno:2杂交的dna分子，所述的严格条件可为在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗杂交膜一次，或者与seqidno:2的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)的序列。

tpc-osoxo3融合蛋白，其氨基酸序列如seqidno:6所示，或该序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且功能与seqidno:6所示序列相同的序列。

上述tpc-osoxo3融合蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列优选如seqidno:4所示。或在严格条件下可与seqidno:4杂交并且编码上述tpc-osglo3融合蛋白的dna分子，所述的严格条件可为在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗杂交膜一次。或者与seqidno:4的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)，并且编码上述tpc-osoxo3融合蛋白的dna分子。

上述tpc-osoxo3融合蛋白编码基因的表达盒2×p35s-tpc-osoxo3-t35s。该表达盒的核苷酸序列优选如seqidno:5所示。或在严格条件下可与seqidno:5杂交的dna分子，所述的严格条件可为在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗杂交膜一次。或者与seqidno:5的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)的序列。

tpc-oscatc融合蛋白，其氨基酸序列如seqidno:9所示，或该序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且功能与seqidno:9所示序列相同的序列。

上述tpc-oscatc融合蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列优选如seqidno:7所示。或在严格条件下可与seqidno:7杂交并且编码上述tpc-oscatc融合蛋白的dna分子，所述的严格条件可为在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗杂交膜一次。或者与seqidno:7的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)，并且编码上述tpc-oscatc融合蛋白的dna分子。

上述tpc-oscatc融合蛋白编码基因的表达盒pubi-tpc-oscatc-tnos。该表达盒的核苷酸序列优选如seqidno:8所示。或在严格条件下可与seqidno:8杂交的dna分子，所述的严格条件可为在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗杂交膜一次。或者与seqidno:8的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)的序列。

一种能够将goc光呼吸代谢改造支路引入植物的表达载体，是由上述tpc-osglo3、tpc-osoxo3及tpc-oscatc融合蛋白的编码基因表达盒通过插入多克隆位点或通过重组构建而成。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可以产生颜色变化的酶或是发光化合物的基因(如gus基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。

以上所述任意一种表达载体，所述的表达载体优选为pyl1305、pyltac380gw或其他衍生植物表达载体。

所述goc光呼吸代谢改造支路在制备转基因c3植物中的应用。

所述goc光呼吸代谢改造支路在制备提高c3植物光合效率与生物量中的应用。

携带有本发明的goc光呼吸代谢改造表达载体可以通过ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或是组织中。被转化的宿主植物可以是水稻或其它作物。

一种对水稻光呼吸代谢进行改造的方法，goc光呼吸代谢改造支路相关基因转化水稻愈伤组织细胞，再将转化后的水稻愈伤组织细胞培育成植株。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

实验结果表明，转goc光呼吸代谢改造支路植株表现为光合速率提高、生物量增加、叶绿素增加。该发明对深入阐明高光效机理、对作物与可再生能源生产、甚至对减少co2排放均具有深远意义，在实际应用中可以将goc光呼吸代谢改造支路转入不同的c3植物中以培育更加高产想的品种。

附图说明

图1是di载体核心部分；其中，loxp、1l、2r为重组位点；i-scei和pi-scei为归位内切酶位点；mcs：多克隆位点。

图2是pubi-di载体核心部分；其中，loxp、1l、2r为重组位点；i-scei和pi-scei为归位内切酶位点；pubi：玉米泛素基因启动子；tnos：nos终止子；mcs：多克隆位点。

图3是2×p35s-dii载体核心部分；其中，loxp、2l、1r为重组位点；i-scei和pi-scei为归位内切酶位点；2×p35s：花椰菜花叶病毒35s增强型启动子；t35s：花椰菜花叶病毒35s终止子；mcs：多克隆位点。

图4是pyl1305载体核心部分；其中，loxp、a2为重组位点；i-scei为归为内切酶位点；hpt，潮霉素抗性基因；lb，左边界；rb，右边界。

图5是goc-pyl1305载体核心部分；其中，loxp、1l、2rl为重组位点；i-scei和pi-scei为归位内切酶位点；pubi：玉米泛素基因启动子；tnos：nos终止子；2×p35s：花椰菜花叶病毒35s增强型启动子；t35s：花椰菜花叶病毒35s终止子；mcs：多克隆位点；hpt，潮霉素抗性基因；lb，左边界；rb，右边界。

图6是转基因植株的阳性检测；其中，ck+：阳性对照；wt：野生型水稻；1到6为t0代转化苗。

图7是半定量pcr分析转基因植株中goc光呼吸代谢改造支路基因的表达；其中，wt：野生型；goc2-3-7、goc3-6-6和goc4-2-3：goc-pyl1305转基因株系；β-actin为内参基因，扩增循环数为27。

图8是goc-pyl1305转基因植株在灌浆期表型观察；其中，wt：野生型；goc2-3-7、goc3-6-6和goc4-2-3：goc-pyl1305转基因株系。

图9是goc-pyl1305转基因植株的净光合速率测定；其中，wt：野生型；goc2-3-7、goc3-6-6和goc4-2-3：goc-pyl1305转基因株系。

图10是goc-pyl1305转基因植株地上部分生物量测定；其中，wt：野生型；goc2-3-7、goc3-6-6和goc4-2-3：goc-pyl1305转基因株系。

图11是goc-pyl1305转基因植株叶片叶绿素含量测定；其中，wt：野生型；goc2-3-7、goc3-6-6和goc4-2-3：goc-pyl1305转基因株系。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成及测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成。

实施例中所用的材料：粳稻品种中花11号为常规市售产品。

pubi-di，对载体pyl322d1(由华南农业大学刘耀光研究员提供，zhu,q.,yu,s.,etal.developmentof"purpleendospermrice"byengineeringanthocyaninbiosynthesisintheendospermwithahigh-efficiencytransgenestackingsystem.molecularplant,2017,10(7):918-929)改造获得。改造方法为首先利用常规的分子克隆手段对pyl322d1的多克隆位点的两个noti间进行改造，改造后的载体命名为di，载体图谱见图1。然后利用常规的分子克隆手段在di的多克隆位点内的xbai与psti之间插入pubi启动子序列及bamhi与smai之间插入tnos终止子序列，载体图谱见图2。其中，pubi启动子序列和tnos终止子序列来源于载体pylcrispr/cas9pubi-h(由华南农业大学刘耀光研究员提供，ma,x.,zhang,q.,etal.arobustcrispr/cas9systemforconvenient,high-efficiencymultiplexgenomeeditinginmonocotanddicotplants.molecularplant2015,8:1274-1284)。

2×p35s-dii，对载体pyl322d2(由华南农业大学刘耀光研究员提供，zhu,q.,yu,s.,etal.developmentof"purpleendospermrice"byengineeringanthocyaninbiosynthesisintheendospermwithahigh-efficiencytransgenestackingsystem.molecularplant,2017,10(7):918-929)改造获得。改造方法为利用常规的分子克隆手段在载体pyl322d2的多克隆位点内的ecori与xhoi之间插入2×p35s启动子序列及sali与hindiii之间插入t35s终止子序列，载体图谱见图3。其中，2×p35s启动子序列和t35s终止子序列来源于载体pylcrispr/cas9pubi-h(由华南农业大学刘耀光研究员提供)。

pyl1305，由华南农业大学刘耀光研究员提供。该载体由商业载体pcambia1305.1改造而得，改造方法为利用常规分子克隆手段在pcambia1305.1载体的多克隆位点区的psti单酶切插入loxp/cre同源重组序列，载体图谱见图4。其中，loxp/cre同源重组序列来源于载体pyltac380gw。pyltac380gw在文献“zhu,q.,yu,s.,etal.developmentof"purpleendospermrice"byengineeringanthocyaninbiosynthesisintheendospermwithahigh-efficiencytransgenestackingsystem.molecularplant,2007,10(7):918-929”中公开。

实施例1tpc-osglo3、tpc-osoxo3、tpc-oscatc融合蛋白表达基因的获得

(1)tpc-osglo3融合蛋白表达基因的获得

根据ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的关于osglo3和tpc的cdna序列设计引物，引物序列如下：

osglo3-f：5′-catgagatctatggagctaatcacaaac-3′(下划线为限制性内切酶bglii识别位点)。

osglo3-r：5′-ttaatggtgatggtgatgatgcctgtcgctgtcggtgat-3′(下划线部分为his标签序列)。

tpc-1f：5′-atggccccctccgtgatg-3′；

tpc-1r：5′-ctacagatctcatgcacctgatcctgcc-3′(下划线为限制性内切酶bglii识别位点)。

以粳稻品种中花11号2周的幼苗叶片cdna为模板，在引物osglo3-f和osglo3-r，引物tpc-1f和tpc-1r的引导下，用常规方法分别扩增osglo3与tpc基因。反应结束后，对pcr扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化osglo3(约1100bp)与tpc(约150bp)的dna片段；将上述回收片段经过bglii酶切消耗后，用t4连接酶连接，并作为模板，在引物tpc-1f与osglo3-r的引导下，进行第二轮pcr扩增。反应结束后，对扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化tpc-osglo3的dna片段(约1300bp)，将片段克隆到pmd18-t载体(购自takara公司)上，获得pmd18-tpc-osglo3载体，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，dna片段的序列如seqidno:1所示；编码序列表中seqidno:3所示的蛋白。

(2)tpc-osoxo3融合蛋白表达基因的获得

根据ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的关于osoxo3和tpc的cdna序列设计引物，引物序列如下：

osoxo3-f：5′-catgggtaccatggagtacggcttcaaa-3′(下划线为限制性内切酶kpni识别位点)。

osoxo3-r：5′-atccttagtacccgccggtgaa-3′；

tpc-2r：5′-ctacggtacccatgcacctgatcctgcc-3′(下划线为限制性内切酶kpni识别位点)。

以粳稻品种中花11号2周的幼苗叶片cdna为模板，在引物osoxo3-f和osoxo3-r，引物tpc-1f和tpc-2r的引导下，用常规方法分别扩增osoxo3与tpc基因。反应结束后，对pcr扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化osoxo3(约700bp)与tpc(约150bp)的dna片段；将上述回收片段经过kpni酶切消耗后，用t4连接酶连接，并作为模板，在引物tpc-1f与osoxo3-r的引导下，进行第二轮pcr扩增。反应结束后，对扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化tpc-osoxo3的dna片段(约900bp)，将片段克隆到pmd18-t载体(购自takara公司)上，获得pmd18-tpc-osoxo3载体，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，dna片段的序列seqidno:4所示；编码序列表中seqidno:6所示的蛋白。

(3)tpc-oscatc融合蛋白表达基因的获得

根据ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的关于oscatc的cdna序列设计引物，引物序列如下：

oscatc-f：5′-catgggtaccatggatccctacaagcat-3′(下划线为限制性内切酶kpni识别位点)。

oscatc-r：5′-ttaatggtgatggtgatgatgcatgctcggcttcgcgctgag-3′(下划线部分为his标签序列)。

以粳稻品种中花11号2周的幼苗叶片cdna为模板，在引物oscatc-f和oscatc-r，引物tpc-1f和tpc-2r的引导下，用常规方法分别扩增oscatc与tpc基因。反应结束后，对pcr扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化oscatc(约1500bp)与tpc(约150bp)的dna片段；将上述回收片段经过kpni酶切消耗后，用t4连接酶连接，并作为模板，在引物tpc-1f与oscatc-r的引导下，进行第二轮pcr扩增。反应结束后，对扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化tpc-oscatc的dna片段(约1700bp)，将片段克隆到pmd18-t载体(购自takara公司)上，获得pmd18-tpc-oscatc载体，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，dna片段的序列如seqidno:7所示；编码序列表中seqidno:9所示的蛋白。

实施例2tpc-osglo3、tpc-osoxo3、tpc-oscatc融合蛋白表达盒序列的获得

(1)tpc-osglo3融合蛋白表达盒pubi-tpc-osglo3-tnos的获得

根据tpc-osglo3融合蛋白表达基因序列(seqidno:1)设计引物，引物序列如下：

tpc-osglo3-f：5′-gactctgcagatggccccctccgtgatg-3′(下划线为psti识别位点)。

tpc-osglo3-r：5′-cagtggatccctaatggtgatggtgatgatg-3′(下划线为bamhi识别位点)。

以实施例1中所述pmd18-tpc-osglo3载体为模板，在引物tpc-osglo3-f和tpc-osglo3的引导下，用常规方法扩增tpc-osglo3基因，电泳回收后将该基因克隆入重组供体载体pubi-di(载体图谱见图2)多克隆位点的psti和bamhi酶切位点之间，得到载体pubi-di-tpc-osglo3。

根据pubi-di载体上的pubi启动子序列和tnos终止子序列设计引物，引物序列如下：

pubi-f：5′-gaattcgtcgtgcccctctc-3′；

tnos-r：5′-cccgatctagtaacatagat-3′；

以上述pubi-di-tpc-osglo3载体为模板，在引物pubi-f和tnos-r的引导下，用常规方法扩增tpc-osglo3基因表达盒pubi-tpc-osglo3-tnos，电泳回收后将该表达盒克隆入pmd18-t载体得到载体pmd18--pubi-tpc-osglo3-tnos。送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，dna片段的序列如seqidno:2所示。

(2)tpc-osoxo3融合蛋白表达表达盒2×p35s-tpc-osoxo3-t35s的获得

根据tpc-osoxo3融合蛋白表达基因序列(seqidno:4)设计引物，引物序列如下：

tpc-osoxo3-f：5′-ataggaattcatggccccctccgtgatg-3′(下划线为ecori识别位点)。

tpc-osoxo3-r：5′-ccatggatccttagtacccgccggtgaa-3′(下划线为bamhi识别位点)。

以实施例1中所述pmd18-tpc-osoxo3载体为模板，在引物tpc-osoxo3-f和tpc-osoxo3-r的引导下，用常规方法扩增tpc-osoxo3基因，电泳回收后将该基因克隆入植物瞬时表达载体2×p35s-dii(载体图谱见图3)多克隆位点的ecori和bamhi酶切位点之间，得到载体2×p35s-dii-tpc-osoxo3。

根据2×p35s-dii载体上的2×p35s启动子序列和t35s终止子序列设计引物，引物序列如下：2×p35s-f：5′-gaattcgtcgtgcccctctc-3′；

t35s-r：5′-cccgatctagtaacatagat-3′；

以上述2×p35s-dii-tpc-osoxo3载体为模板，在引物2×p35s-f和t35s-r的引导下，用常规方法扩增tpc-osoxo3基因表达盒2×p35s-tpc-osoxo3-t35s，电泳回收后将该表达盒克隆入pmd18-t载体得到载体pmd18-2×p35s-tpc-osoxo3-t35s。送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，dna片段的序列如seqidno:5所示。

(3)tpc-oscatc融合蛋白表达表达盒pubi-tpc-oscatc-tnos的获得

根据tpc-oscatc融合蛋白表达基因序列(seqidno:7)设计引物，引物序列如下：

tpc-oscatc-f：5′-gtacaagcttatggccccctccgtgatg-3′(下划线为hindiii识别位点)。

tpc-oscatc-r：5′-gatcactagtttaatggtgatggtgatg-3′(下划线为spei识别位点)。

以实施例1中所述pmd18-tpc-oscatc载体为模板，在引物tpc-oscatc-f和tpc-oscatc-r的引导下，用常规方法扩增tpc-oscatc基因，电泳回收后将该基因克隆入重组供体载体pubi-di(载体图谱见图2)多克隆位点的hindiii和spei酶切位点之间，得到载体pubi-di-tpc-oscatc。

以上述pubi-di-tpc-oscatc载体为模板，在上述引物pubi-f和tnos-r的引导下，用常规方法扩增tpc-oscatc基因表达盒pubi-tpc-oscatc-tnos，电泳回收后将该表达盒克隆入pmd18-t载体得到载体pmd18--pubi-tpc-oscatc-tnos。送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，dna片段的序列如seqidno:8所示。

实施例3goc光呼吸代谢支路改造载体goc-pyl1305的获得

以pubi-di-tpc-osglo3、2×p35s-dii-tpc-osoxo3和pubi-di-tpc-oscatc为供体载体，pyl1305(载体图谱见图4)为受体载体，参考lin等人的方法(linl,liuyg,xux,etal..efficientlinkingandtransferofmultiplegenesbyamultigeneassemblyandtransformationvectorsystem.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2003,100(10):5962-5967)，通过三轮重组，最终获得goc光呼吸代谢改造支路载体goc-pyl1305，载体图谱如图5所示。具体重组方法如下：

(1)供体质粒和受体质粒的准备

收集过夜的菌液10ml，采用质粒小量提取试剂盒提取质粒，电泳检测并测质粒浓度，质粒浓度控制在100～200ng/μl。

(2)供体质粒与受体质粒共转重组

按供体受体质粒摩尔比3：1的比例混合质粒3～4μl，混匀后按热激转化的方法转化ns3529感受态细胞(购买于takara，japan)；涂布500μl转化菌液于准备好的双抗lb平板上，培养过夜；奇数轮重组使用含50mg/l卡那霉素和17mg/l氯霉素的lb平板，偶数轮重组使用50mg/l卡那霉素和50mg/l氨苄青霉素的lb平板。

(3)洗板与质粒提取

用无菌水将过夜培养的平板上的菌落洗下，离心收集菌体；采用质粒提取试剂盒提取质粒，回收后的质粒测浓度，控制在200ng/μl左右。

(4)质粒酶切

采用归位内切酶i-scei(奇数轮)或pi-scei(偶数轮)37℃酶切2h，酶切后的质粒转化大肠杆菌top10感受态细胞(购买于takara，japan)并涂布与含50mg/l卡那霉素的lb平板上，培养过夜。

(5)重组子的筛选

进行菌液pcr筛选阳性克隆，一次检验94个克隆，没有发现阳性克隆的情况下，重复一次，筛选出阳性克隆后进行测序确认；上游引物和测序引物均为i-ceui-f(5′-ccaactataacggtcctaaggtagcg-3′)，检测的下游引物根据目标基因接入供体的方向选择，如果目标基因的接入方向与mcs的标注方向相同(上游为loxp位点)，采用接入目标基因的反向引物，反之采用正向引物。

实施例4goc-pyl1305的获得及表型分析与光合指标分析

将goc光呼吸代谢改造支路载体goc-pyl1305利用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11号的成熟胚的愈伤组织，方法如下述文献描述(hieietal,efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna,plantj.1994,6:271-282)，经过预分化、分化，得到6株转化植株，经过pcr鉴定潮酶素抗性基因hpt，全部为阳性(图6)，pcr引物序列如下：

hpt-f：5′-ctgaactcaccgcgacgtctgtc-3′；

hpt-r：5′-tagcgcgtctgctgctccataca-3′；

pcr扩增条件为：94℃2min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。

经过pcr鉴定为阳性的转基因植株后，提取t1代转基因植株叶片基因组dna进行southernblot检测插入基因的拷贝数，选择单拷贝的转基因植株分单株收取种子，然后取100粒以上种子发芽后利用潮霉素进行筛选，若没有死亡则表明种子已经纯合；选择已经纯合的转基因种子和野生型水稻中花11种子萌发后，利用木村b营养液(调ph为4.8)培养水稻至4叶期，然后提取水稻rna，检测总rna浓度和完整度后再合成cdna第一链，以水稻actin作为内参基因，加入等量的cdna模板，在pcr仪进行半定量分析，从图7可以看出，在转基因植株叶片中tpc-osglo3、tpc-osoxo3、tpc-oscatc三个基因均有表达；所用pcr引物序列如下：

actin扩增引物：actin-f：5′-gacattcagcgttccagccatgtat-3′；

actin-r：5′-tggagcttccatgccgatgagagaa-3′；

tpc-osglo3扩增引物：glo3-tf：5′-ccaagttgaccgctctct-3′；

his-r：5′-atggtgatggtgatgatg-3′；

tpc-oscatc扩增引物：catc-tf：5′-tcgctcaagcccaacccc-3′；

his-r：5′-atggtgatggtgatgatg-3′；

tpc-osoxo3：oxo3-tf：5′-gaggtgacggtgaacggg-3′；

oxo3-tr：5′-tgagcgggacgaagacga-3′；

pcr扩增条件为：95℃10min；95℃15sec，60℃1min，27个循环；60～95℃分析溶解曲线。

木村b营养液具体配方为：(nh4)2so4(0.365mm)，kh2po4(0.182mm)，kno3(0.183mm)，k2so4(0.086mm)，ca(no3)2(0.366mm)，mgso4(0.548mm)，edta-feiii(0.020mm)，mncl2·4h2o(0.091×10^-3mm)，znso4·7h2o(0.77×10^-3mm)，cuso4·5h2o(0.32×10^-3mm)，h3bo3(0.0462mm)，(nh4)6mo7o24·4h2o(0.145×10^-3mm)。

通过以上实验，我们成功将goc光呼吸代谢改造支路引入水稻，获得了具有明显表型的转基因水稻株系goc2-3-7、goc3-6-6和goc4-2-3(图8)，相对于野生型，其表型主要有光合效率提高(图9)、生物量增加(图10)、叶绿素含量增加(图11)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一条光呼吸代谢改造支路及其在c3植物中的应用

<160>38

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1254

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>tpc-osglo3融合蛋白编码基因序列

<400>1

atggccccctccgtgatggcgtcgtcggccaccaccgtcgctcccttccaggggctcaag60

tccaccgccggcatgcccgtcgcccgccgctccggcaactccagcttcggcaacgtcagc120

aatggcggcaggatcaggtgcatgagatctatggagctaatcacaaacgtctccgagtat180

gagcagcttgcaaagcagaagctgccgaagatgatctacgactactacgcctctggtgca240

gaagatcaatggactctcaaggagaacagggaggccttctcaagaattctgtttcgaccg300

cgaatactgattgatgtatcccgtatcaacatggctacaaatgtcttgggcttcaacatt360

tccatgcccataatgattgctccctcagccatgcagaaaatggcccaccccgaaggagag420

cttgctactgcaagagcagcttctgctgcaggaacaataatgacattgtcttcatggtcc480

acttctagtgttgaagaggttaattcagcagcgccggggatacgtttcttccaactctat540

gtttacaaggataggaatatagtacggcaacttgtcagaagggctgaattggctggtttt600

aaggcgattgcactcactgtcgacactccaaggcttggtcgcagggaagctgacatcaag660

aacagattcaacttacctccacatctggtattgaagaattttgaagcgctggatctcggc720

aagatggacaagacaaatgattctggccttgcttcctatgttgctagccaagttgaccgc780

tctctgtcttggacggacgtgaagtggctacagacaatcacctcgttgccgatcttagtg840

aaaggagtcatgactgcagaagatactaggcttgctgtcgaaagtggcgcggccggtatc900

atcgtgtccaaccatggagctcgccagctagattatgttcctgcaactatcagctgcctg960

gaagaggtcgtcagggaggcaaaggggcggctgccggtgttcctcgacggcggcgtccgc1020

cgtggcacggacgtgttcaaggccctggcgctgggagcttcaggagtatttattggcagg1080

ccggtgctgttctcgctggccgtggacggcgaggccggcgtgaggaaggtgctgcagatg1140

ctccgcgacgagctggagctcaccatggcgctcagcggatgcacgtcgctggccgagatc1200

acccgcaaccacgtcatcaccgacagcgacaggcatcatcaccatcaccattag1254

<210>2

<211>3602

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>tpc-osglo3融合蛋白表达盒pubi-tpc-osglo3-tnos序列

<400>2

gaattcgtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaatt60

accacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatata120

tttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttag180

agaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaaca240

ggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagct300

tcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatg360

gtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaa420

gaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaa480

ataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacat540

ttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggac600

accaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctc660

tgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgt720

cggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcc780

tcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcc840

cttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtg900

ttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctcc960

gcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcg1020

ttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgt1080

gtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacac1140

gttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgt1200

tccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcc1260

cttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttt1320

tttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaa1380

ttctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccataca1440

tattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacat1500

gttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatg1560

atgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaa1620

ctacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagtta1680

cgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggtttt1740

actgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtac1800

ctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatg1860

atggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatt1920

tgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgttaggtgttacttctgcagat1980

gactagtggatccacgcgtcctacatcgtataaattagcctatacgaagttatgttccac2040

tgagcgtcagaccgagcgcagcgagtttggtgttacttctgcagatggccccctccgtga2100

tggcgtcgtcggccaccaccgtcgctcccttccaggggctcaagtccaccgccggcatgc2160

ccgtcgcccgccgctccggcaactccagcttcggcaacgtcagcaatggcggcaggatca2220

ggtgcatgagatctatggagctaatcacaaacgtctccgagtatgagcagcttgcaaagc2280

agaagctgccgaagatgatctacgactactacgcctctggtgcagaagatcaatggactc2340

tcaaggagaacagggaggccttctcaagaattctgtttcgaccgcgaatactgattgatg2400

tatcccgtatcaacatggctacaaatgtcttgggcttcaacatttccatgcccataatga2460

ttgctccctcagccatgcagaaaatggcccaccccgaaggagagcttgctactgcaagag2520

cagcttctgctgcaggaacaataatgacattgtcttcatggtccacttctagtgttgaag2580

aggttaattcagcagcgccggggatacgtttcttccaactctatgtttacaaggatagga2640

atatagtacggcaacttgtcagaagggctgaattggctggttttaaggcgattgcactca2700

ctgtcgacactccaaggcttggtcgcagggaagctgacatcaagaacagattcaacttac2760

ctccacatctggtattgaagaattttgaagcgctggatctcggcaagatggacaagacaa2820

atgattctggccttgcttcctatgttgctagccaagttgaccgctctctgtcttggacgg2880

acgtgaagtggctacagacaatcacctcgttgccgatcttagtgaaaggagtcatgactg2940

cagaagatactaggcttgctgtcgaaagtggcgcggccggtatcatcgtgtccaaccatg3000

gagctcgccagctagattatgttcctgcaactatcagctgcctggaagaggtcgtcaggg3060

aggcaaaggggcggctgccggtgttcctcgacggcggcgtccgccgtggcacggacgtgt3120

tcaaggccctggcgctgggagcttcaggagtatttattggcaggccggtgctgttctcgc3180

tggccgtggacggcgaggccggcgtgaggaaggtgctgcagatgctccgcgacgagctgg3240

agctcaccatggcgctcagcggatgcacgtcgctggccgagatcacccgcaaccacgtca3300

tcaccgacagcgacaggcatcatcaccatcaccattagggatcctatcacgttcaaacat3360

ttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatata3420

atttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttat3480

gagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaa3540

aatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcg3600

gg3602

<210>3

<211>417

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>tpc-osglo3融合蛋白质序列

<400>3

metalaproservalmetalaserseralathrthrvalalaprophe

151015

glnglyleulysserthralaglymetprovalalaargargsergly

202530

asnserserpheglyasnvalserasnglyglyargileargcysmet

354045

argsermetgluleuilethrasnvalserglutyrgluglnleuala

505560

lysglnlysleuprolysmetiletyrasptyrtyralaserglyala

65707580

gluaspglntrpthrleulysgluasnargglualapheserargile

859095

leupheargproargileleuileaspvalserargileasnmetala

100105110

thrasnvalleuglypheasnilesermetproilemetilealapro

115120125

seralametglnlysmetalahisprogluglygluleualathrala

130135140

argalaalaseralaalaglythrilemetthrleusersertrpser

145150155160

thrserservalglugluvalasnseralaalaproglyileargphe

165170175

pheglnleutyrvaltyrlysaspargasnilevalargglnleuval

180185190

argargalagluleualaglyphelysalailealaleuthrvalasp

195200205

thrproargleuglyargargglualaaspilelysasnargpheasn

210215220

leuproprohisleuvalleulysasnpheglualaleuaspleugly

225230235240

lysmetasplysthrasnaspserglyleualasertyrvalalaser

245250255

glnvalaspargserleusertrpthraspvallystrpleuglnthr

260265270

ilethrserleuproileleuvallysglyvalmetthralagluasp

275280285

thrargleualavalgluserglyalaalaglyileilevalserasn

290295300

hisglyalaargglnleuasptyrvalproalathrilesercysleu

305310315320

glugluvalvalargglualalysglyargleuprovalpheleuasp

325330335

glyglyvalargargglythraspvalphelysalaleualaleugly

340345350

alaserglyvalpheileglyargprovalleupheserleualaval

355360365

aspglyglualaglyvalarglysvalleuglnmetleuargaspglu

370375380

leugluleuthrmetalaleuserglycysthrserleualagluile

385390395400

thrargasnhisvalilethraspserasparghishishishishis

405410415

his

<210>4

<211>834

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>tpc-osoxo3融合蛋白编码基因序列

<400>4

atggccccctccgtgatggcgtcgtcggccaccaccgtcgctcccttccaggggctcaag60

tccaccgccggcatgcccgtcgcccgccgctccggcaactccagcttcggcaacgtcagc120

aatggcggcaggatcaggtgcatgggtaccatggagtacggcttcaaagcagctgggttg180

gtgttcgtcgtgctgctcctgcagcaggcgcccgtgttaatccgagccaccgacgcggac240

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tgcaagccggcgtcggccgccggcgacgagttcctcttctcctccaagattgccacgggc360

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ctcgtcggcatcatcggcaccctcgacaccgggaacaggtactactccaaggtggtccgt600

gccggcgagacgttcgtcatcccgagggggctcatgcacttccagttcaacgttggcaag660

acggaggccaccatggtggtgtccttcaacagccagaaccccggcatcgtcttcgtcccg720

ctcacattgttcggctccaacccgcccatcccgacgccggtgcttgtcaaggcactccgc780

gtggatgctggtgtagttgagctgctcaagtccaaattcaccggcgggtactaa834

<210>5

<211>1665

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>tpc-osoxo3融合蛋白表达盒2×p35s-tpc-osoxo3-t35s序列

<400>5

aaagcaagtggattgatgtgataacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaa60

tatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaat120

atccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagt180

ggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttga240

agatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtgga300

aaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactga360

cgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaag420

ttcatttcatttggagaggacgtcgagagttctcaacacaacatatacaaaacaaacgaa480

tctcaagcaatcaagcattctacttctattgcagcaatttaaatcatttcttttaaagca540

aaagcaattttctgaaaattttcaccatttacgaacgataggaattcatggccccctccg600

tgatggcgtcgtcggccaccaccgtcgctcccttccaggggctcaagtccaccgccggca660

tgcccgtcgcccgccgctccggcaactccagcttcggcaacgtcagcaatggcggcagga720

tcaggtgcatgggtaccatggagtacggcttcaaagcagctgggttggtgttcgtcgtgc780

tgctcctgcagcaggcgcccgtgttaatccgagccaccgacgcggaccctctgcaggatt840

tctgcgtcgctgacctcaacagcgaggtgacggtgaacgggcacgcgtgcaagccggcgt900

cggccgccggcgacgagttcctcttctcctccaagattgccacgggcggcgacgtgaacg960

ccaacccgaacggctccaacgtcacggagctcgacgtcgccgagtggcccggcgtcaaca1020

cgctcggcgtgtccatgaaccgcgtcgacttcgcgcccggtggcaccaacccgccgcacg1080

tccacccgcgcgccaccgaggtcggcatcgtgctccgcggcgagctcctcgtcggcatca1140

tcggcaccctcgacaccgggaacaggtactactccaaggtggtccgtgccggcgagacgt1200

tcgtcatcccgagggggctcatgcacttccagttcaacgttggcaagacggaggccacca1260

tggtggtgtccttcaacagccagaaccccggcatcgtcttcgtcccgctcacattgttcg1320

gctccaacccgcccatcccgacgccggtgcttgtcaaggcactccgcgtggatgctggtg1380

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tagtcgacgtccgcaaaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctctatttttc1500

tccagaataatgtgtgagtagttcccagataagggaattagggttcttatagggtttcgc1560

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caataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtgacaagctt1665

<210>6

<211>277

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>tpc-osoxo3融合蛋白质序列

<400>6

metalaproservalmetalaserseralathrthrvalalaprophe

151015

glnglyleulysserthralaglymetprovalalaargargsergly

202530

asnserserpheglyasnvalserasnglyglyargileargcysmet

354045

glythrmetglutyrglyphelysalaalaglyleuvalphevalval

505560

leuleuleuglnglnalaprovalleuileargalathraspalaasp

65707580

proleuglnaspphecysvalalaaspleuasnsergluvalthrval

859095

asnglyhisalacyslysproalaseralaalaglyaspglupheleu

100105110

pheserserlysilealathrglyglyaspvalasnalaasnproasn

115120125

glyserasnvalthrgluleuaspvalalaglutrpproglyvalasn

130135140

thrleuglyvalsermetasnargvalaspphealaproglyglythr

145150155160

asnproprohisvalhisproargalathrgluvalglyilevalleu

165170175

argglygluleuleuvalglyileileglythrleuaspthrglyasn

180185190

argtyrtyrserlysvalvalargalaglygluthrphevalilepro

195200205

argglyleumethispheglnpheasnvalglylysthrglualathr

210215220

metvalvalserpheasnserglnasnproglyilevalphevalpro

225230235240

leuthrleupheglyserasnproproileprothrprovalleuval

245250255

lysalaleuargvalaspalaglyvalvalgluleuleulysserlys

260265270

phethrglyglytyr

275

<210>7

<211>1647

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>tpc-oscatc融合蛋白编码基因序列

<400>7

atggccccctccgtgatggcgtcgtcggccaccaccgtcgctcccttccaggggctcaag60

tccaccgccggcatgcccgtcgcccgccgctccggcaactccagcttcggcaacgtcagc120

aatggcggcaggatcaggtgcatgggtaccatggatccctacaagcaccgcccgtcgagc180

tcgttcaacggcccgctgtggagcaccaactccggcgcccccgtatggaacaacaacaac240

tcgctcaccgtcggctcccgaggcccgatccttctggaggactaccacctggttgagaag300

ctggccaacttcgacagggagcgtatcccggagcgcgtggtgcacgcccgcggcgccagc360

gccaagggcttcttcgaggtcacccacgacatcacccacctcacctgcgccgacttcctc420

cgcgccccgggcgtccagaccccggtcatcgtccgcttctccaccgtcatccacgagcgc480

ggcagcccggagaccctccgcgacccgcgtggcttcgccatcaagttctacacccgggag540

ggcaactgggacctcgtcggcaacaacttccccgtcttcttcatccgcgacggcatgaag600

ttcccggacatggtgcactcgctcaagcccaaccccaagtcgcacgtccaggagaactgg660

cgcatcctcgacttcttctcccaccacccggagagcctccacatgttcaccttcctcttc720

gatgacatcggcatccccgccgactaccgccacatggacggctccggcgtcaacacctac780

acgctcgtcaaccgcgccggcaagtcgcactacgtcaagttccactggaagcccacctgc840

ggcgtcaagtcgctgctcgacgacgaggccgtcaccgtcggcgggaccaaccacagccac900

gccacgcaggacctctacgactccatcgccgccggcaacttcccggagtggaagctgttc960

atccagaccatcgaccccgaccacgaggaccgcttcgacttcgacccgctcgacgtcacc1020

aagacgtggcccgaggacatcgtcccgctgcagcccgtggggaggatggtgctcaaccgc1080

aacatcgacaacttcttctcggagaacgagcagctggcgttctgccccgggatcatcgtg1140

ccggggatctactactccgacgacaagctgctgcagacgaggatcttctcctactccgac1200

acgcagcgccaccgcctcggaccaaactacctgctgctcccgcccaacgcgcccaagtgc1260

gcccaccacaacaaccactacgacggcttcatgaacttcatgcaccgcgacgaggaggtc1320

gactacttcccatcccgctacgatcctgccaagcacgccccccgctaccccatcccctcc1380

gccaccctcaccggccgccgcgagaaggtggtgattgccaaggagaacaacttcaagcag1440

ccaggggagaggtaccgttcatgggatccggcaaggcaagaccggttcatcaagagatgg1500

atcgacgcactctctgaccctcgcctcacccacgagatcaggagcatctggctctcctac1560

tggtctcaggctgacaggtctctgggtcagaaactggcgagccgtctcagcgcgaagccg1620

agcatgcatcatcaccatcaccattaa1647

<210>8

<211>3939

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>tpc-oscatc融合蛋白表达盒pubi-tpc-oscatc-tnos序列

<400>8