一种从人外周血CTC中检测EML4-ALK融合基因亚型荧光定量PCR方法与流程

本发明涉及肿瘤细胞检测领域，具体涉及一种从人外周血ctc中检测eml4-alk融合基因多种常见亚型的荧光定量pcr方法。

背景技术：

随着生物分析技术的进步及信息化技术的发展，以及对基于基因医学理解的深入，精准医学（precisionmedicine）的概念从系统医学、转化医学、4p医学等概念中提炼出来，成为一种高度综合且细致的医学新模式，有望提高疾病预防和疾病的治疗水平。据哈佛大学医学院附属波士顿儿童医院教授吴柏林介绍，精准医学源自于基因组学，是指通过基因、分子水平上应用基因组学以及所衍生的各种组学（蛋白质组学、代谢组学、表现基因组学等）来诊断病因或检测出治。随着世界许多主要国家提出精准医学的战略，精准医学已经成为未来医学的发展方向，2015年成为了精准医学的元年，具有重要的历史意义，时至今日，精准医学已成不可以逆转的发展趋势。

液态活检最早由sorrells于1974年提出，是针对患者体内循环系统的一类非侵入性病理检测方法，能够快捷、无创伤地对肿瘤患者的诊断和治疗监测，当前液态活检技术已逐渐应用在肿瘤诊断治疗当中。对于个体而言，无论是ctc、ctdna还是外泌体，在病人个体层次存在较大的波动，尤其是在早期，浓度比较低的情况下，ctdna的检出率明显下降，而ctc目前作为预后评估的主要标准，对于早期肿瘤患者意义不大。迫切需要一种能够对ctc进行定性的液态活检的检测技术和方法。

eml4-alk融合基因是在2007年由日本学者soda等发现的，当时他们进行了一位62岁的吸烟史的肺腺癌患者的肺切除手术，从他的肺标本中发现了eml4-alk融合基因，他们通过cdna克隆构建文库筛选的方法发现了alk基因的3端和eml4基因的5端相互融合，并通过体外克隆性转化实验以及体内基因重排基础上的肺部选择性表达实验证实：不同的eml4-alk融合基因亚型都具有恶性转化和致癌性能力。

目前已有一些研究检测了非小细胞肺癌患者eml4-alk融合基因不同亚型的基因表达频率，早期的研究多数集中在亚裔非小细胞患者，亚裔非小细胞患者的不同的eml4-alk融合基因不同亚型的表达率为2.3%-6.7%，在目前全球已发布的17个报告中，没有选择性的非小细胞肺癌的患者eml4-alk融合基因的总发生率为3.4%，其中亚裔非小细胞患者为4.1%，日本人，韩国人和中国人分别为3.6%，3.6%和5.9%，而高加索非小细胞肺癌的患者为2.5%。

自新千年以来尤其是近几年，针对非小细胞肺癌的特定的靶点的个体化治疗成为治愈这种癌症的新希望，棘皮动物微管相关蛋白4-间变型淋巴瘤激酶（eml4-alk）融合基因越来越受到关注，由于它在非小细胞肺癌中的高表达，成为非小细胞肺癌的一个分子标志物，研究表明3%-13%的非小细胞肺癌患者含有此基因，它为非小细胞肺癌的个体化治疗提供了一个新的靶点，目前已经有多个针对该靶点的alk抑制剂进入了临床研究。

eml4-alk融合基因几种常见亚型包括亚型1（49.6%）、亚型2（10%）、亚型3a和3b（25.6%）、亚型4、亚型5a和5b、亚型6和亚型7。

eml4-alk融合基因亚型1（e13;a20）由eml4第13外显子和alk第20外显子融合而成；

eml4-alk融合基因亚型2（e20;a20）由eml4第20外显子和alk第20外显子融合而成；

eml4-alk融合基因亚型3a（e6;a20）由eml4第6外显子和alk第20外显子融合而成；

eml4-alk融合基因亚型3b（e6ins33;a20）由eml4第6外显子和alk第20外显子融合而成,第6外显子中插入了一段33bp片段；

eml4-alk融合基因亚型4（e14;ins11del49a20）由eml4第14个外显子和alk第20外显子融合而成，第20外显子中插入了一段11bp片段，删除了一段49bp片段；

eml4-alk融合基因亚型5a（e2;a2）0由eml4第2外显子和alk第20外显子融合而成；

eml4-alk融合基因亚型5b（e2;ins117a20）由eml4第2外显子和alk第20外显子融合而成，第20外显子插入了一段117bp片段；

eml4-alk融合基因亚型6（e3;ins69a20）由eml4第3外显子和alk第20外显子融合而成，第20外显子插入了一段69bp片段；

eml4-alk融合基因亚型7（e14;del12a20）由eml4第14外显子和alk第20外显子融合而成，第20外显子删除了一段12bp片段。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种从人外周血ctc中检测9种常见eml4-alk融合基因亚型荧光定量pcr方法，利用ctc高敏感性、高特异性、易检测的优点及高通量测序的通量高、灵敏度高、节约时间等优势，筛选80个与癌症发生发展密切相关的基因，利用杂交捕获的方法针对富集后的ctc中的相关基因的热点突变区域进行文库构建和目标高通量测序，从而对患者进行指导性的个体化用药，适合于肿瘤患者的不同阶段，包含但不限于早期、中期、晚期、手术前后、治疗检测及复发检测等。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种从人外周血ctc中检测eml4-alk融合基因亚型荧光定量pcr方法，具体包括以下步骤：

1）采用差减法从人外周血中富集ctc。

2）设计并获得eml4-alk融合基因亚型特异性引物和特异性taqman探针。

3）采用荧光定量pcr方法taqman探针法，eml4-alk融合基因亚型阳性质粒标准品为模板进行pcr扩增，并在pcr过程中利用taqman探针的水解，通过搜集特异荧光信号来检测eml4-alk融合基因亚型的表达。

eml4-alk融合基因亚型包括1、2、3a、3b、4、5a、5b、6、7。

eml4-alk融合基因亚型特异性taqman探针5’端标记fam荧光基团，3’端标记tamra荧光基团。

eml4-alk融合基因亚型1、2、3a、3b、4、5a、5b、6、7对应的taqman探针依次为序列表中1至9。

在进一步优化的技术方案中，本从人外周血ctc中检测eml4-alk融合基因亚型荧光定量pcr方法，特异性上下游引物具体为：

eml4-alk融合基因亚型1特异性上下游引物依次为序列表中10、11。

eml4-alk融合基因亚型2特异性上下游引物依次为序列表中12、13。

eml4-alk融合基因亚型3a特异性上下游引物依次为序列表中14、15。

eml4-alk融合基因亚型3b特异性上下游引物依次为序列表中16、17。

eml4-alk融合基因亚型4特异性上下游引物依次为序列表中18、19。

eml4-alk融合基因亚型5a特异性上下游引物依次为序列表中20、21。

eml4-alk融合基因亚型5b特异性上下游引物依次为序列表中22、23。

eml4-alk融合基因亚型6特异性上下游引物依次为序列表中24、25。

eml4-alk融合基因亚型7特异性上下游引物依次为序列表中26、27。

在进一步优化的技术方案中，本从人外周血ctc中检测eml4-alk融合基因亚型荧光定量pcr方法，eml4-alk融合基因亚型1、2、3a、3b、4、5a、5b、6、7阳性质粒标准品序列依次为序列表中序列28至36。

采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：

相对于已披露的技术方案，将本发明方法用于在人外周血ctc中检测eml4-alk融合基因几种常见亚型1、2、3a、3b、4、5a、5b、6、7。结果可用于临床个体化治疗，预测酪氨酸激酶（alk）抑制剂治疗的有效性，便于临床用药选择，显著提高治疗效果，使患者最大程度受益；同时，还可以避免不合理用药造成的病人医疗费用负担及社会医疗资源浪费，减少不必要的时效损失以及经济损失。

附图说明

附图1显示eml4-alk融合基因亚型1灵敏度检测结果。

附图2显示eml4-alk融合基因亚型2灵敏度检测结果。灵敏度即最低检测限，是qpcr体系中能检测到模板有扩增曲线的最低检测浓度。本发明中检测灵敏度的体系中是在野生型基因模板的背景下，检测到阳性标准品的最低检测浓度，代表着实验体系的灵敏程度，普通qpcr基本上都能达到1%的灵敏度。检测灵敏度的实验方法是用taqman探针法去检测不同比例的混合模板（由人野生型基因模板和阳性标准品混合而成）的体系中是否有扩增产物的出现，人野生型基因模板cdna含量10ng为6000copies/μl，eml4-alk融合基因亚型2模板阳性标准质粒含量分别为野生型基因模板cdna含量6000copies/μl的100%，50%，10%，5%，1%，0.5%，0.1%，0（6000，3000，600，300，60，30，6，0）。100%灵敏度意思是指未添加野生型基因模板cdna（稀释成拷贝数0）的情况下，检测到阳性标准品eml4-alk融合基因亚型2质粒（稀释成拷贝数6000copies/μl）为模板构成的qpcr体系进行pcr扩增，有s型扩增曲线就代表该体系达到了100%灵敏度；50%灵敏度意思是在添加野生型基因模板cdna（稀释成拷贝数6000copies/μl）的背景下，由阳性标准品eml4-al融合基因亚型2质粒（稀释成拷贝数6000copies/μl）和野生型基因模板两者混合而成的模板构成的qpcr体系进行pcr扩增，有s型扩增曲线就代表该体系达到了50%灵敏度，同理可得10%，5%，1%，0.5%，0.1%，0相关的灵敏度。

附图3显示eml1-alk融合基因亚型1检测结果阳性，即样品用eml1-alk融合基因亚型1体系检测亚型1阳性，有s型扩增曲线。

附图4显示eml1-alk融合基因亚型2检测结果阳性，即样品用eml1-alk融合基因亚型2体系检测亚型2阳性，有s型扩增曲线。

附图5显示eml1-alk融合基因亚型3a检测结果阳性，即样品用eml1-alk融合基因亚型3a体系检测亚型3a阳性，有s型扩增曲线。

附图6显示eml1-alk融合基因亚型3b检测结果阳性，即样品用eml1-alk融合基因亚型3b体系检测亚型3b阳性，有s型扩增曲线。

附图7显示eml1-alk融合基因亚型4检测结果阳性，即样品用eml1-alk融合基因亚型4体系检测亚型4阳性，有s型扩增曲线。

附图8显示eml1-alk融合基因亚型5a检测结果阳性，即样品用eml1-alk融合基因亚型5a体系检测亚型5a阳性，有s型扩增曲线。

附图9显示eml1-alk融合基因亚型5b检测结果阳性，即样品用eml1-alk融合基因亚型5b体系检测亚型5b阳性，有s型扩增曲线。

附图10显示eml1-alk融合基因亚型6检测结果阳性，即样品用eml1-alk融合基因亚型6体系检测亚型6阳性，有s型扩增曲线。

附图11显示eml1-alk融合基因亚型7检测结果阳性，即样品用eml1-alk融合基因亚型7体系检测亚型7阳性，有s型扩增曲线。

具体实施方式

下面结合附图1至11和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。

实施例一

人外周血循环肿瘤细胞的差减富集方法。

1.采集病人外周血：为避免上皮细胞污染，弃掉前2ml血液后，使用提供的采血管采集6.0ml血液，并立即头尾颠倒混匀采血管8次。

2.将采血管用天平配平，头尾颠倒混匀后室温离心，200×g20min。弃上清至棕红色沉淀上方5mm处，加入1×crc清洗液至采血管标签黄线满管处，盖上黄色管帽，头尾颠倒混匀10次。

3.于离心管a中加入3mlcytelligen细胞分离液，将采血管轻柔头尾颠倒混匀，使用电动移液器将采血管中的血细胞沿离心管a管壁液面处缓慢加到分离液顶层，切忌将血细胞加入到分离介质中。叠加后可见清晰的分界面，少量红细胞慢慢沉淀至管底。配平后室温离心，450×g7min。

4.离心后可见三层液体，上层为黄色液体（layer1），中间层为透明液体（layer2），底层为棕红色沉淀红细胞（layer3）。但个别患者因治疗等原因导致部分红细胞处于中间层，未离心至管底，仍按下述方法吸取上清。将a管中底层红细胞上的所有液体转移至50ml离心管b中，使用1ml加样器先从上层和中间层的液面交界处吸取液体，上清剩余2ml时从液面上吸取上清，切勿吸取到底层红细胞。然后竖直摇匀液体。

5.将洗涤后的免疫磁珠结合缓冲液充分混匀，按每管400μl的比例将磁珠缓慢加入离心管b中，边加边摇动离心管。将离心管以35-40°角倾斜固定于摇床上，室温摇动20min，125rpm（液面摇晃的最高处于刻度30-35ml之间）。

6.将管b置于磁力架上，2min时使用5ml枪头伸入管底中央轻柔吹打2下，2min后使用同一支枪头沿管b正中央将液体小心转移至50ml离心管c中，注意不要吸到吸附的磁珠。

7.于管c中加入1×crc清洗液至45ml，配平，颠倒混匀，室温离心700×g4min。弃上清至500μl，使用振荡混合仪（可调节速度）轻柔振荡混匀沉淀细胞，转移至15ml离心管中（不弃枪头），使用1ml1×crc清洗液清洗管c，用上述未弃的枪头将清洗液同样转移至15ml离心管中，于管中加入1×crc清洗液至14ml，配平，颠倒混匀，室温离心950×g4min。即可得富集的人外周血循环肿瘤细胞。

实施例二

荧光定量pcr方法taqman探针法检测eml4-alk融合基因亚型。

采用荧光定量pcr方法taqman探针法，通过设计高特异性的探针，pcr过程中，taqman探针的水解并搜集特异的荧光信号检测eml4-alk融合基因亚型的表达。

1.逆转录

针对各种目标检测的eml4-alk融合基因亚型，本发明先使用随机引物进行逆转录，将抽提的mrna反转录成cdna。

2.pcr扩增

从人外周血循环肿瘤细胞中检测eml4-alk融合基因亚型1、2、3a、3b、4、5a、5b、6、7，通过oligo7设计正向引物、反向引物和探针，使用步骤（1）逆转录而来的cdna作为模板，对亚型1、2、3a/b、4、5a/b、6、7进行扩增。

（1）灵敏度检测

灵敏度即最低检测限，是qpcr体系中能检测到模板有扩增曲线的最低检测浓度。本发明中检测灵敏度的体系中是在野生型基因模板的背景下，检测到阳性标准品的最低检测浓度，代表着实验体系的灵敏程度，普通qpcr基本上都能达到1%的灵敏度。检测灵敏度的实验方法是用taqman探针法去检测不同比例的混合模板（由人野生型基因模板和阳性标准品混合而成）的体系中是否有扩增产物的出现，人野生型基因模板cdna含量10ng为6000copies/μl，eml4-alk融合基因亚型1模板阳性标准质粒含量分别为野生型基因模板cdna含量6000copies/μl的100%，50%，10%，5%，1%，0.5%，0.1%，0（6000，3000，600，300，60，30，6，0）。100%灵敏度意思是指未添加野生型基因模板cdna（稀释成拷贝数0）的情况下，检测到阳性标准品eml4-alk融合基因亚型1质粒（稀释成拷贝数6000copies/μl）为模板构成的qpcr体系进行pcr扩增，有s型扩增曲线就代表该体系达到了100%灵敏度；50%灵敏度意思是在添加野生型基因模板cdna（稀释成拷贝数6000copies/μl）的背景下，由阳性标准品eml4-alk融合基因亚型1质粒（稀释成拷贝数6000copies/μl）和野生型基因模板两者混合而成的模板构成的qpcr体系进行pcr扩增，有s型扩增曲线就代表该体系达到了50%灵敏度，同理可得10%，5%，1%，0.5%，0.1%，0相关的灵敏度。

（2）采用taqman探针

eml4-alk融合基因亚型1、2、3a、3b、4、5a、5b、6和7对应的taqman探针依次为序列表中1至9，探针5’端标记fam荧光基团，3’端标记tamra荧光基团。

（3）采用pcr扩增引物

eml4-alk融合基因亚型1特异性上下游引物依次为序列表中10、11；

eml4-alk融合基因亚型2特异性上下游引物依次为序列表中12、13；

eml4-alk融合基因亚型3a特异性上下游引物依次为序列表中14、15；

eml4-alk融合基因亚型3b特异性上下游引物依次为序列表中16、17；

eml4-alk融合基因亚型4特异性上下游引物依次为序列表中18、19；

eml4-alk融合基因亚型5a特异性上下游引物依次为序列表中20、21；

eml4-alk融合基因亚型5b特异性上下游引物依次为序列表中22、23；

eml4-alk融合基因亚型6特异性上下游引物依次为序列表中24、25；

eml4-alk融合基因亚型7特异性上下游引物依次为序列表中26、27。

eml4-alk融合基因亚型1、2、3a、3b、4、5a、5b、6和7阳性质粒标准品

本发明根据eml4-alk融合基因亚型1、2、3a、3b、4、5a、5b、6和7的mrna序列，截取包含特异性上下游引物和探针的核酸片段作为阳性质粒标准品，合成片段并插入pgh载体，转化进大肠杆菌dh5α感受态细胞，并通过蓝白斑筛选出阳性质粒当做标准品，阳性质粒插入片段序列为序列表中序列28至36。

eml4-alk融合基因亚型1、2、3a、3b、4、5a、5b、6、7的扩增体系：

扩增体系（20μl）

扩增程序：

（3）结果检测与数据分析

使用本发明的引物和探针和反转录的阳性质粒标准样品（cdna样本），采用上述反应体系和程序，经过40个循环的扩增，如附图3到附图11所示，用bio-radiq5仪器和bio-radiq5实时定量pcr软件分析结果，可以得到eml4-alk融合基因亚型1、2、3a/b、4、5a/b、6、7等的单一的特异性扩增曲线，有上平台和下平台期，为s型曲线，如果反转录的cdna样本中不含有该亚型融合基因，则不会有扩增曲线，结果为阴性。

由技术常识可知，本技术方案可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

序列表

<110>江苏苏博生物医学股份有限公司

<120>一种从人外周血ctc中检测eml4-alk融合基因亚型荧光定量pcr方法

<130>2017

<140>2018102070609

<141>2018-03-14

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