一种变性泡介导的靶标核酸扩增方法及其专用试剂盒与应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种变性泡介导的靶标核酸扩增方法及其专用试剂盒与应用。

背景技术：

核酸可分为脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)，是所有生命形式的基本要素。dna携带遗传信息并负责编码蛋白质的基本单元氨基酸。rna在基因的编码、解码、调节和表达中起到重要的作用。因此，核酸被用作重要的生物标志物用于生物研究和医学诊断，而核酸扩增技术的出现为病原微生物以及肉源成分的检测提供了重要的理论依据，建立一种简单、易于操作和灵敏快速的核酸检测方法是生物检测领域中的主要目标。

聚合酶链式扩增反应(polymerasechainreaction，pcr)技术作为最早出现的核酸扩增技术，直至目前仍然应用广泛。该技术以长片段核酸作为靶标，设计上下游两条引物，高温退火解开双链，低温结合引物，适温时在聚合酶的存在下延伸，经反复循环，实现靶标片段的指数性扩增。传统的pcr技术扩增结果需要琼脂糖凝胶电泳进行验证，后来发展的实时荧光定量pcr技术通过加入荧光染料实现了荧光信号输出实验结果。但是由于三步扩增导致pcr技术总是离不开精密的控温仪器，限制了该技术的研究发展及基层应用。

自20世纪90年代初以来，各种等温扩增技术被开发成为pcr的替代品，如环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification，lamp)、依赖解旋酶的核酸等温扩增技术(helicase-dependentisothermaldeoxyribonucleicacid，hda)等技术。lamp技术因为灵敏度高、特异性好而被大家熟知，但是该技术易污染，且引物设计困难，无法实现高突变物种靶标的检测。而had技术的反应体系中需要两个酶，双酶体系容易引起非特异扩增，影响实验结果的判断。这些缺点在一定程度上限制了这些技术的推广使用。

1953年沃森和克里克提出了dna双螺旋结构。在生理条件下，dna是处在动态平衡中，由于波动，一些碱基氢键之间会发生断裂，双链dna会自发的变性，并导致双螺旋结构发生变化，该现象被称为dna的呼吸作用，解开的单链区域叫做dna变性泡。

基于变性泡介导的链交换扩增技术(strandexchangeamplification，sea)是一种基于dna呼吸作用引起的变性泡介导的等温核酸扩增技术。在基于sea技术检测靶核酸时，仅需设计上下游两条引物，该引物可通过侵入变性泡结构，在聚合酶的作用下延伸并置换下原有的互补链来形成指数式扩增。sea技术可以检测dna，也可以实现rna的一步法检测，具有简单、快速、特异性强等优点，可在等温条件下完成链交换扩增反应，摆脱了对大型复杂仪器的依赖，适合医疗机构的现场快速检测，基层单位的疾病筛查，食品致病微生物检测及物种鉴定、检验检疫机构、处理大型应急事件，军队野外快速检测等场合。

但是，目前报道的变性泡介导的链交换技术，最低检测限均较高，对于低浓度靶标的检出能力较弱。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何基于变性泡介导的链交换技术(sea)实现低浓度靶标核酸的快速检测。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种变性泡介导的靶标核酸扩增方法。

本发明提供的变性泡介导的靶标核酸扩增方法包括将待检测核酸样品在变性泡和dna聚合酶的作用下进行选择性扩增的步骤；

所述扩增的反应体系包括一对或多对用于扩增所述靶标核酸的寡核苷酸引物、一种或多种dna聚合酶、反应缓冲液、dntps和辅助解链的制剂；

所述辅助解链的制剂包括单链结合蛋白和/或聚乙二醇。

上述方法中，所述扩增为等温扩增。所述等温扩增的反应温度可为20-75℃。

进一步地，所述等温扩增的反应温度可为35-65℃。

更进一步地，所述等温扩增的反应温度可为55-65℃；优选为59℃、60℃、61℃或62℃。

上述方法中，所述靶标核酸可以为单链dna分子或单链rna分子，也可以为双链dna分子。

所述靶标核酸的长度可为20-60bp。

进一步地，所述靶标核酸的长度可为35-50bp。

更进一步地，所述靶标核酸的长度可为38-50bp。在本发明中，所述靶标核酸的长度具体为38bp、41bp、43bp或50bp。

上述方法中，所述反应体系中的所述寡核苷酸引物、所述dna聚合酶、所述dntps、所述单链结合蛋白和所述聚乙二醇的配比为10^-6mol：(1-30)×10⁶u：(0.1-10)×10^-3mol：(0.1-100)×10³μg：(0.001-0.2)l。

上述方法中，所述寡核苷酸引物为一对寡核苷酸引物，其中一条引物与所述靶标核酸的5'端杂交，另一条引物与所述靶标核酸的3'端杂交。

进一步地，所述寡核苷酸引物的熔解温度在所述等温扩增的反应温度±5℃的范围内。

所述寡核苷酸引物的长度可为15-30bp。

所述寡核苷酸引物的gc含量可为40-60％。

所述寡核苷酸引物在所述反应体系中的浓度可为10^-7-10^-5m，具体可为10^-6m。

在本发明中，所述靶标核酸是指模板中的部分序列，该部分序列的两端分别与两条引物序列互补，为一条引物5'端到另一条引物5'端之间的核酸部分。

上述方法中，所述dna聚合酶可选自大肠杆菌dna聚合酶i的klenow片段和bst聚合酶大片段，也可为与bst聚合酶大片段具有80％或80％以上同源性的聚合酶突变体或异构酶，还可为bst聚合酶大片段与其他化合物或核酸或蛋白质结合且具有热启动效果的酶的复合物。所述dna聚合酶缺少5'到3'外切核酸酶活性，具有链置换活性。

当靶标核酸为rna分子时，所述dna聚合酶除了具有聚合酶活性外还具有反转录活性。

进一步地，所述dna聚合酶在所述反应体系中的浓度可为1-30u/μl。

更进一步地，所述dna聚合酶在所述反应体系中的浓度可为8-24u/μl，具体可为8u/μl、16u/μl或24u/μl。

上述方法中，所述单链结合蛋白包括但不限于噬菌体t432ssb、e.colissb、噬菌体t72.5ssb和噬菌体phi29ssb，或它们的衍生物。

进一步地，所述单链结合蛋白为来源于大肠杆菌的极高热稳定性单链结合蛋白(etssb)。所述极高热稳定性单链结合蛋白在反应温度范围内仍然具有较高活性，可结合单链的dna或者rna，即能够使得由于呼吸作用解开的核酸双链更加稳定的以单链形式存在，从而增加引物和靶标的结合效率。除此之外，极高热稳定性单链结合蛋白还能够提高dna聚合酶的活性，从而加快反应速度。

所述单链结合蛋白在所述反应体系中的浓度可为0.1-100μg/ml。

更进一步地，所述单链结合蛋白在所述反应体系中的浓度可为1.0-50μg/ml，具体可为5μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml或50μg/ml，优选为5μg/ml。

上述方法中，所述聚乙二醇选自聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000。

进一步地，所述聚乙二醇为聚乙二醇200(peg200)。所述聚乙二醇200可加快杂交进程，增加互补双链dna的结合效率，从而加快反应速度。

所述聚乙二醇在所述反应体系中的体积分数可为0.1-20％。

更进一步地，所述聚乙二醇在所述反应体系中的体积分数可为1.0-10％，具体可为1.0％、2.5％、5％或10％，优选为2.5％。

上述方法中，所述dntps在所述反应体系中的浓度可为0.1-10mm。

进一步地，所述dntps在所述反应体系中的浓度可为0.5-1.5mm，具体可为0.5mm、0.8mm或1.0mm，优选为0.8mm。

上述方法中，所述反应缓冲液可为isothermalreactionbuffer，其配方如下：20mmtris-hcl，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，2mmmgso4，0.1％tritonx-100；ph8.8@25℃。

上述方法中，所述反应体系可为如下1)或2)：

所述1)中，所述反应体系由所述寡核苷酸引物、所述单链结合蛋白、所述聚乙二醇200、所述dna聚合酶、所述dntps、所述反应缓冲液、模板(待检测核酸样品)和水组成；

所述2)中，所述反应体系由buffera溶液、bufferb溶液和水组成；

所述buffera溶液由所述反应缓冲液、所述dntps、所述寡核苷酸引物和所述聚乙二醇组成；

所述bufferb溶液由所述反应缓冲液、所述dna聚合酶和所述单链结合蛋白组成。

进一步地，若采用荧光法检测所述扩增产物时，所述1)中反应体系或所述2)中buffera溶液还包括荧光染料；若采用比色法检测所述扩增产物时，所述1)中的反应体系和所述2)中反应体系还包括酸碱指示剂。

更进一步地，所述1)中的反应体系具体如下：模板(待检测核酸样品)1μl、一对寡核苷酸引物(在反应体系中的终浓度均为10^-6m)、dntps(10mm)0.8μl、isothermalreactionbuffer反应缓冲液(1×)、evagreen(20×)0.25μl、bst2.0warmstart^tmdnapolymerase(8u/μl)0.1μl、etssb(在反应体系中的终浓度为5μg/ml)、peg2000.25μl，加水补足体系总体积为10μl。

所述2)中的反应体系是将buffera和bufferb混匀，加水补足体系总体积为25μl。所述buffera配方具体如下：isothermalreactionbuffer(10×)1.75μl、dntps(10mm)2μl、一对寡核苷酸引物(在反应体系中的终浓度均为10^-6m)、peg2000.625μl、evagreen(20×)0.625μl；所述bufferb配方具体如下：isothermalreactionbuffer(10×)0.75μl、etssb(在反应体系中的终浓度为5μg/ml)、bst2.0warmstart^tmdnapolymerase(8u/μl)0.25μl。

上述方法还包括检测扩增产物的步骤；所述检测扩增产物的方法为荧光检测或电泳检测或比色法检测。

上述方法中，所述靶标核酸为来自生物样品中的病原体，可通过扩增所述靶标核酸来检测所述病原体。

上述方法中，所述靶标核酸位于染色体或线粒体或核糖体，所述方法还包括检测所述靶标核酸序列变异情况的步骤。所述检测靶标核酸序列变异的方法可为现有技术中的常规方法。所述序列变异可为单核苷酸多态性。

上述方法中，所述待检测核酸样品可为利用试剂盒提取的生物样品的基因组dna和rna，也可为将生物样品直接捣碎后混合裂解液，然后在95℃条件下加热5min，再离心收集的含有靶标核酸的上清液。

本发明的方法基于变性泡打开双链进行延伸的链交换反应(sea)。等温过程中引物可通过侵入变性泡结构，在聚合酶的作用下延伸并置换下原有的互补链来形成指数式扩增。另外，dna聚合酶在靶标链长度约100bp及以下时具有较强的反转录活性。而链交换反应设计检测全长约35-50bp之间的靶标，设计上下游两条引物在双链打开瞬间与靶标结合，通过dna聚合酶的作用在等温条件下扩增，可实现dna或者rna的一步法检测。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了靶标核酸扩增试剂盒。

本发明提供的靶标核酸扩增试剂盒包括上述寡核苷酸引物、上述dna聚合酶、上述反应缓冲液、上述dntps和上述辅助解链的制剂。

进一步地，所述试剂盒包括buffera溶液和bufferb溶液；

所述buffera溶液包括所述反应缓冲液、所述dntps、所述寡核苷酸引物和所述聚乙二醇；

所述bufferb溶液包括所述反应缓冲液、所述dna聚合酶和所述单链结合蛋白。

若采用荧光法检测所述扩增产物时，所述试剂盒中还包括荧光染料。

若采用比色法检测所述扩增产物时，所述试剂盒中还包括酸碱指示剂。

更进一步地，所述试剂盒由所述寡核苷酸引物、所述dna聚合酶、所述反应缓冲液、所述dntps、所述聚乙二醇、所述单链结合蛋白、所述荧光染料和水组成或所述试剂盒由buffera溶液、bufferb溶液和水组成。所述buffera溶液由所述反应缓冲液、所述dntps、所述寡核苷酸引物、所述聚乙二醇和所述荧光染料组成；所述bufferb溶液由所述反应缓冲液、所述dna聚合酶和所述单链结合蛋白组成。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述方法或上述试剂盒的新用途。

本发明提供了上述方法或上述试剂盒在病原微生物检测中的应用。

本发明还提供了上述方法或上述试剂盒在物种鉴定中的应用。

本发明还提供了上述方法或上述试剂盒在基因检测中的应用。

所述基因检测包括但不限于缺陷型基因检测、耐药基因检测、疾病检测、疾病风险预测或基因体检等检测领域。

本发明提供了一种变性泡介导的靶标核酸扩增方法及其所用试剂盒。通过实验证明：本发明的试剂盒具有更高的灵敏度，能够实现10^-14m靶标的检测，提高了sea技术1000倍的灵敏度，适合多种病原微生物以及物种鉴定等基因检测领域，且具有稳定性好，可长期存储的优点。

附图说明

图1为链交换反应原理图。链交换反应仅需上下游两条引物，一种dna聚合酶，在等温条件下实现核酸快速扩增检测。核酸双链自身的“呼吸”作用产生的变性泡使得核酸呈现单链状态，此时的上或下游引物与靶标结合，在聚合酶的存在下向3'端延伸，一个循环后形成35-70bp的短链靶dna，继续以此为靶标循环产生大量的反应产物，实现信号放大。

图2为etssb大幅提高反应效率的荧光图。其中－▆－代表10μl反应体系中含有终浓度为50μg/ml的etssb时的扩增曲线，－●－代表10μl反应体系中含有终浓度为25μg/ml的etssb时的扩增曲线，－▲－代表10μl反应体系中含有终浓度为12.5μg/ml的etssb时的扩增曲线，－▼－代表10μl反应体系含有终浓度为5.0μg/ml的etssb时的扩增曲线，－◆－代表10μl反应体系不添加etssb时的扩增曲线；代表10μl以水为靶标的反应体系中含有终浓度为50μg/ml的etssb时的扩增曲线，代表10μl以水为靶标的反应体系中含有终浓度为25μg/ml的etssb时的扩增曲线，代表10μl以水为靶标的反应体系中含有终浓度为12.5μg/mletssb时的扩增曲线，－★－代表10μl以水为靶标的反应体系含有终浓度为5μg/ml的etssb时的扩增曲线，代表10μl以水为靶标的反应体系不添加etssb时的扩增曲线。

图3为不同浓度的peg200对扩增试验的影响结果图。其中－▆－代表10μl反应体系中含有终浓度为1.0％的peg200时的扩增曲线，－●－代表10μl反应体系中含有终浓度为2.5％的peg200时的扩增曲线，－▲－代表10μl反应体系中含有终浓度为5.0％的peg200时的扩增曲线，－▼－代表10μl反应体系中含有终浓度为10.0％的peg200时的扩增曲线，－◆－代表10μl反应体系不添加peg200时的扩增曲线；代表10μl以水为靶标的反应体系中含有终浓度为1.0％的peg200时的扩增曲线，代表10μl以水为靶标的反应体系中含有终浓度为2.5％的peg200时的扩增曲线，代表10μl以水为靶标的反应体系中含有终浓度为5.0％的peg200时的扩增曲线，－★－代表10μl以水为靶标的反应体系中含有终浓度为10.0％的peg200的扩增曲线，代表10μl以水为靶标的反应体系中不添加peg200时的扩增曲线。

图4为不同浓度的bstdnapolymerase对扩增试验的影响结果图。其中－▆－代表10μl反应体系中含有8ubstdnapolymerase时的扩增曲线，－●－代表10μl反应体系中含有16ubstdnapolymerase时的扩增曲线，－▲－代表10μl反应体系中含有24ubstdnapolymerase时的扩增曲线，－▼－代表10μl反应体系中含有24ubstdnapolymerase但没有靶标核酸时的扩增曲线。

图5为不同体积的dntps对扩增试验的影响结果图。其中－▆－代表10μl反应体系中以水为靶标时的扩增曲线，－●－代表10μl反应体系中含有0.8μldntps时的扩增曲线，－▲－代表10μldntps反应体系中含有1μldntps时的扩增曲线，－▼－代表10μl反应体系中含有0.5μldntps时的扩增曲线。

图6为本发明试剂盒检测金黄色葡萄球菌可行性验证结果图。其中图a中－▼－代表以水为靶标的空白对照。其余三条荧光曲线是同一靶标浓度的三个重复性验证。图b为与图a对应的page图，其中泳道m为20bp的marker，泳道1-3对应三个阳性重复，泳道4为空白对照。图c为与图a对应的比色图，其中a-c对应三个阳性重复，d对应空白对照。

图7为两种不同方法得到的靶标核酸的sea扩增反应图。其中－●－代表由试剂盒提取的鸭肉基因组dna和rna混合物作为靶标时的扩增曲线，－▆－代表由简单裂解得到的鸭肉基因组dna和rna混合物作为靶标时的扩增曲线，－▲－代表以水为靶标的空白对照。

图8为本发明sea反应体系的老化实验。其中－▆－代表刚从-20℃冰箱中取出的反应mix的扩增曲线，－●－代表室温储存1个月的反应mix的扩增曲线，－▲－代表室温储存4个月的反应mix的扩增曲线，－▼－代表室温储存8个月的反应mix的扩增曲线，－◆－代表以水为靶标的空白对照。

图9为本发明sea反应体系的反复冻融实验。其中1代表反复冻融一次时阳性靶标的扩增曲线，2代表反复冻融两次时阳性靶标的扩增曲线，3代表反复冻融三次时阳性靶标的扩增曲线，4代表反复冻融四次时阳性靶标的扩增曲线，5代表反复冻融五次时阳性靶标的扩增曲线，6代表反复冻融六次时阳性靶标的扩增曲线，7代表反复冻融一次时以水为靶标的扩增曲线，8代表反复冻融两次时以水为靶标的扩增曲线，9代表反复冻融三次时以水为靶标的扩增曲线，10代表反复冻融四次时以水为靶标的扩增曲线，11代表反复冻融五次时以水为靶标的扩增曲线，12代表反复冻融六次时以水为靶标的扩增曲线。

图10为本发明的sea反应体系的检测限。其中－▆－代表靶标(金黄色葡萄球菌pcr产物)终浓度为10^-11m时的扩增曲线，－●－代表靶标(金黄色葡萄球菌pcr产物)终浓度为10^-12m时的扩增曲线，－▲－代表靶标(金黄色葡萄球菌pcr产物)终浓度为10^-13m时的扩增曲线，－▼－代表靶标(金黄色葡萄球菌pcr产物)终浓度为10^-14m时的扩增曲线，－◆－代表靶标(金黄色葡萄球菌pcr产物)终浓度为10^-15m时的扩增曲线，代表以水为靶标的空白对照。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中生物样品的基因组dna和rna(基因组dna和rna混合物)均通过dna/rnaisolationkit提取获得，dna/rnaisolationkit是天根生化科技(北京)有限公司的产品，货号为dp422。

下述实施例中isothermalreactionbuffer反应缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：20mmtris-hcl，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，2mmmgso4，0.1％tritonx-100；ph8.8@25℃。

实施例1：单链结合蛋白在提高sea反应效率中的应用

由于单链结合蛋白(ssb)能够加速dna聚合酶的作用效率，稳定单链dna的结构，极大促进扩增反应。本实施例将从大肠杆菌提取的极高热稳定性单链结合蛋白(etssb)作为辅助解链的制剂进行等温扩增，并优化得到etssb最佳浓度。具体步骤如下：

1、等温扩增的靶标核酸：以松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)28srrna基因(序列为5'-agccttctgggcgcgtgattggtgtttgtgcattgccg-3')(seqidno.1)为靶标核酸。

2、等温扩增的反应体系(sea反应体系)如下：

引物p1(序列为5'-agccttctgggcgcgt-3'(seqidno.2))：在sea反应体系中的终浓度为10^-6m；

引物p2(序列为5'-cggcaatgcacaaacacca-3'(seqidno.3))：在sea反应体系中的终浓度为10^-6m；

dntps(10mm)：0.8μl；

isothermalreactionbuffer反应缓冲液(1×)；

evagreen(20×)(bridgen，d013-1)：0.25μl；

bst2.0warmstart^tmdnapolymerase(8u/μl)(newenglandbiolabs，m0537l)：0.1μl；

genomicdnaandrnamixofb.xylophilus(松材线虫基因组dna和rna混合物)(10^-10m)：1μl；

除以上成分之外，向体系中加入不同体积的etssb溶液(500μg/ml)(newenglandbiolabs，#m2401s)，使etssb在反应体系中的终浓度分别为0、5μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml，其余用水补足体系总体积至10μl。

同时在含有不同浓度etssb的sea反应体系中均以未加入靶标核酸(ntc)作为对照，其余用水补足体系总体积至10μl。

3、等温扩增的反应条件：在62℃下利用伯乐cfx96^tm实时荧光定量pcr仪进行等温扩增，且每分钟对荧光信号进行扫描，结果如图2。

从图中可以看出，加入不同浓度的etssb对sea链交换反应具有明显的促进作用。和不加etssb相比较，在sea反应体系中加入适当浓度的etssb可以大幅度缩短反应时间，提高反应速率。其中，etssb在sea反应体系中的终浓度为5μg/ml时，起峰时间最早。

实施例2：sea反应体系的优化

一、聚乙二醇浓度优化实验

由于聚乙二醇能够增加互补核酸链的结合效率，在专利申请号为201610101384.5的基础上，将聚乙二醇作为辅助解链的制剂进行等温扩增，以进一步对聚乙二醇浓度进行优化。具体步骤如下：

1、等温扩增的靶标核酸：以松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)28srrna基因(序列为5'-agccttctgggcgcgtgattggtgtttgtgcattgccg-3')(seqidno.1)为靶标核酸。

2、等温扩增的反应体系如下：

引物p1(序列为5'-agccttctgggcgcgt-3'(seqidno.2))：在sea反应体系中的终浓度为10^-6m；

引物p2(序列为5'-cggcaatgcacaaacacca-3'(seqidno.3))：在sea反应体系中的终浓度为10^-6m；

dntps(10mm)：0.8μl；

isothermalreactionbuffer反应缓冲液(1×)；

evagreen(20×)：0.25μl；

etssb(500μg/ml)：0.1μl；

bst2.0warmstart^tmdnapolymerase(8u/μl)：0.1μl；

genomicdnaandrnamixofb.xylophilus(松材线虫基因组dna和rna混合物)(10^-10m)：1μl；

除以上成分之外，向体系中加入不同浓度的聚乙二醇200(peg200，sigmaaldrioh，1002300576p3015-250g)，使其在sea反应体系中的体积分数分别为1％、2.5％、5％和10％。

同时以sea反应体系中未加入靶标核酸且含有体积分数为10％的peg200(ntc)作为对照。

3、等温扩增的反应条件：在62℃下利用伯乐cfx96^tm实时荧光定量pcr仪进行等温扩增，且每分钟对荧光信号进行扫描，结果如图3。

从图中可以看出：加入不同浓度的peg200对sea链交换反应具有明显的促进作用。和不加peg200相比较，在sea反应体系中加入适当浓度的peg200可以大幅度缩短反应时间，提高反应速率。其中，peg200在sea反应体系中的体积分数为2.5％时，起峰时间最早。

二、bstdnapolymerase浓度优化实验

采用不同浓度的bstdnapolymerase进行等温扩增，研究bstdnapolymerase对扩增反应的影响。具体步骤如下：

1、等温扩增的靶标核酸：以松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)28srrna基因(序列为5'-agccttctgggcgcgtgattggtgtttgtgcattgccg-3')(seqidno.1)为靶标核酸。

2、等温扩增的反应体系如下：

引物p1(序列为5'-agccttctgggcgcgt-3'(seqidno.2))：在sea反应体系中的终浓度为10^-6m；

引物p2(序列为5'-cggcaatgcacaaacacca-3'(seqidno.3))：在sea反应体系中的终浓度为10^-6m；

dntps(10mm)：0.8μl；

isothermalreactionbuffer反应缓冲液(1×)；

evagreen(20×)：0.25μl；

etssb(500μg/ml)：0.1μl；

peg200(100％)：0.25μl；

genomicdnaandrnamixofb.xylophilus(松材线虫基因组dna和rna混合物)(10^-10m)：1μl；

除以上成分之外，向体系中分别加入0.1μl浓度为8u/μl、16u/μl和24u/μl的bst2.0warmstart^tmdnapolymerase，其余用水补足体系总体积至10μl。

同时以sea反应体系中未加入靶标核酸且含有24ubstdnapolymerase(ntc)作为对照。

3、等温扩增的反应条件：在62℃下利用伯乐cfx96^tm实时荧光定量pcr仪进行等温扩增，且每分钟对荧光信号进行扫描，结果如图4。

从图中可以看出：3种不同浓度的bstdnapolymerase下，阳性结果之间没有明显差别。

三、dntps浓度优化实验

采用不同体积的dntps进行等温扩增，研究dntps对扩增反应的影响。具体步骤如下：

1、等温扩增的靶标核酸：以单增李斯特菌(listeriamonocytogenes)16srrna基因(序列为5'-gtcattggaaactggaagactggagtgcagaagaggagagtgg-3'(seqidno.4))为靶标核酸。

2、等温扩增的反应体系如下：

引物p1(序列为5'-gtcattggaaactggaagactg-3'(seqidno.5))：在sea反应体系中的终浓度为10-⁶m；

引物p2(序列为5'-ccactctcctcttctgcac-3'(seqidno.6))：在sea反应体系中的终浓度为10-⁶m；

isothermalreactionbuffer反应缓冲液(1×)；

evagreen(20×)：0.25μl；

etssb(500μg/ml)：0.1μl；

peg200：0.25μl；

bst2.0warmstart^tmdnapolymerase(8u/μl)：0.1μl；

genomicdnaandrnamixofl.monocytogenes(单增李斯特菌基因组dna和rna混合物)(10-¹⁰m)：1μl；

除以上成分之外，分别向体系中加入0.5μl、0.8μl和1.0μl的dntps(10mm)，使其在体系中的终浓度分别为0.5mm、0.8mm和1.0mm，其余用水补足体系总体积至10μl。

同时以水作为靶标核酸(ntc)且含有1.0μl的dntps作为对照。

3、等温扩增的反应条件：在62℃下利用伯乐cfx96^tm实时荧光定量pcr仪进行等温扩增，且每分钟对荧光信号进行扫描，结果如图5。

从图中可以看出：不同浓度的dntps，对sea反应表现出不同的促进作用，加入反应体系的dntps体积为0.8μl时(dntps在反应体系中的终浓度为0.8mm)，阳性结果起峰时间更短，反应效率更高。

实施例3：用于靶标核酸检测的试剂盒的制备及其可行性验证

一、用于靶标核酸检测的试剂盒的制备

本发明的用于靶标核酸检测的试剂盒包括buffera和bufferb。buffera和bufferb的配方分别如下：

buffera配方如下：

isothermalreactionbuffer(10×)：1.75μl；

dntps(10mm)：2μl；

引物p1：在总反应体系中的终浓度为10^-6m；

引物p2：在总反应体系中的终浓度为10^-6m；

peg200：0.625μl；

evagreen(20×)：0.625μl；

bufferb配方如下：

isothermalreactionbuffer(10×)：0.75μl；

etssb(500μg/ml)：0.25μl；

bst2.0warmstart^tmdnapolymerase(8u/μl)：0.25μl。

当需要对靶标核酸进行检测时，将buffera和bufferb混匀，然后加入待检测核酸样品，等温条件下实现sea扩增检测。实际应用中，反应体系的总体积为25μl，加水补足总体积为25μl。也可以按照实施例1和2中的10μl体系进行sea扩增。

采用比色法进行结果检测时，buffera中不添加evagreen荧光染料，在反应体系中额外加入终浓度为10％的酸碱指示剂，实现反应监控。

二、用于靶标核酸检测的试剂盒的可行性检测

1、等温扩增的靶标核酸：以金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)16srrna基因(序列为5'-ggttcaaaagtgaaagacggtcttgctgtcacttatagatggatccgcgc-3'(seqidno.7))为靶标核酸。

扩增金黄色葡萄球菌靶标核酸的引物序列如下：5'-ggttcaaaagtgaaagacggtcttg-3'(seqidno.8)和5'-gcgcggatccatctataagtgac-3'(seqidno.9)。

2、等温扩增的反应体系：将buffera、bufferb和1μl金黄色葡萄球菌基因组dna和rna混合物(10^-10m)混匀得到sea反应体系。实验设置三个重复。

同时以水作为靶标核酸(ntc)作为空白对照。

3、等温扩增的反应条件：在61℃下利用伯乐cfx96^tm实时荧光定量pcr仪进行等温扩增。

4、结果检测

(1)荧光法实现检测

在61℃下利用伯乐cfx96^tm实时荧光定量pcr仪每分钟对荧光信号进行扫描，结果如图6a。

从图中可以看出：三个重复样在一分钟误差范围内同时起峰，空白对照没有荧光值变化。说明优化后的体系重复性好，稳定性强。

(2)page胶电泳法实现检测

将扩增产物进行10-18％的page电泳，先180v电压1min，再135v电压55min。结果如图6b。

从图中可以看出，泳道1-3在41bp有明显的产物条带，与设计长度一致，证明有产物。泳道4无任何产物条带，仅在20bp左右有未反应的引物带。

(3)酸碱指示剂指示的比色法实现检测

将能够指示酸碱性的酸碱指示剂(购自青岛耐德生物技术有限公司，货号为k3005)加入反应体系中，使其终浓度为10％。观察反应体系在反应前后的颜色变化情况。若反应体系在反应前后由黄色变为红色，则表明待测样品含有靶标核酸，若反应体系在反应前后没有发生颜色变化，则表明待测样品不含有靶标核酸。结果如图6c。

从图中可以看出，a-c在反应结束后颜色由黄色变为红色，空白对照没有颜色变化。

实施例4：本发明试剂盒的性能检测

一、不同方法获取的靶标核酸的检测效果比较

采用两种不同方式得到的鸭靶标进行等温扩增，具体步骤如下：

1、靶标核酸的获取

1)试剂盒提取：采用tiandna/rnaisolationkit提取绿头鸭(anasplatyrhynchos)鸭肉基因组dna和rna，得到鸭基因组dna和rna混合物(pork1)。

2)直接捣碎裂解：将绿头鸭(anasplatyrhynchos)鸭肉直接捣碎后，与pbs混匀，然后在95℃下加热5min，再用小型离心机离心，得到鸭基因组dna和rna混合物(pork2)。

2、靶标核酸的检测

以绿头鸭线粒体基因(序列为5'-cgcataaccctcctagtccaagccggacggactcgtatccc-3'(seqidno.10))为靶标核酸。

扩增绿头鸭线粒体基因靶标核酸的引物序列如下：5'-cgcataaccctcctagtccaag-3'(seqidno.11)和5'-ccctctgctcaggcaggc-3'(seqidno.12)。

分别以步骤1获得的鸭基因组dna和rna混合物(pork1)和鸭基因组dna和rna混合物(pork2)为模板，采用实施例3中的试剂盒进行靶标核酸的检测。

两种鸭基因组dna和rna混合物分别加入2.5μl。

同时以水作为靶标核酸(ntc)作为空白对照。

在61℃下利用伯乐cfx96^tm实时荧光定量pcr仪每分钟对荧光信号进行扫描，结果如图7。

从图中可以看出，试剂盒提取的鸭基因组dna和rna混合物(pork1)在17min荧光值开始起峰，直接捣碎裂解的鸭基因组dna和rna混合物(pork2)在24min处荧光值发生明显变化，说明本发明的扩增体系既能够快速检测基因组靶标，同时也可以检测未经过复杂前处理的样本，为现场检测提供了理论依据。

二、本发明试剂盒的老化实验

采用在不同条件下存放不同时间的buffera和bufferb对鸭靶标进行等温扩增，具体步骤如下：以步骤一获得的鸭基因组dna和rna混合物(pork1)为模板，采用实施例3中的试剂盒进行靶标核酸的检测。根据buffera和bufferb的存放时间和存放条件不同分为如下各组：

-20℃：从-20℃冰箱取出的buffera和bufferb进行靶标核酸的检测；

amonth：用室温储存1个月的buffera和bufferb进行靶标核酸的检测；

fourmonths：用室温储存4个月的buffera和bufferb进行靶标核酸的检测；

eightmonths：用室温储存8个月的buffera和bufferb进行靶标核酸的检测；

同时以水作为靶标核酸(ntc)作为空白对照。

在61℃下利用伯乐cfx96^tm实时荧光定量pcr仪每分钟对荧光信号进行扫描，结果如图8。

从图中可以看出：室温储存4个月的反应液仍然具有较好的反应效率，室温储存8个月的反应液比起室温储存4个月的反应液的反应时间长13min，但是检测能力并没有减弱。说明本发明试剂盒稳定性好，可以长时间储存且不易失效。

三、本发明试剂盒的反复冻融实验

采用自然冷冻以及融化不同次数的sea反应体系对鸭靶标进行等温扩增，具体步骤如下：以步骤一获得的鸭基因组dna和rna混合物(pork1)为模板，采用实施例3中的试剂盒进行靶标核酸的检测。将同一批次buffera和bufferb混合得到的sea反应体系分装到六个eppendorf管中，根据sea反应体系自然冷冻以及融化次数的不同分为如下各组：

自然冷冻及融化1次(反复冻融1次)；

自然冷冻及融化2次(反复冻融2次)；

自然冷冻及融化3次(反复冻融3次)；

自然冷冻及融化4次(反复冻融4次)；

自然冷冻及融化5次(反复冻融5次)；

自然冷冻及融化6次(反复冻融6次)。

同时上述六组分别以水为靶标作为空白对照。

在61℃下利用伯乐cfx96^tm实时荧光定量pcr仪每分钟对荧光信号进行扫描，结果如图9。

从图中可以看出，反复冻融6次时的buffer溶液除起峰时间相对靠后外，仍然可以达到很好的检测效果。

实施例5：本发明试剂盒的dna检测限

本实施例以不同浓度的靶标核酸为模板进行等温扩增，具体步骤如下：以不同浓度的金黄色葡萄球菌pcr产物(金黄色葡萄球菌pcr产物是以金黄色葡萄球菌的基因组dna为模板，采用seqidno.13和seqidno.14所示的引物进行pcr扩增得到的pcr产物)模板，采用实施例3中的试剂盒进行靶标核酸的检测，分别向每个反应管中加入同等体积不同浓度的金黄色葡萄球菌pcr产物进行等温扩增。根据金黄色葡萄球菌pcr产物在反应体系中的终浓度不同分为如下各组：金黄色葡萄球菌pcr产物终浓度为10^-11m；金黄色葡萄球菌pcr产物终浓度为10^-12m；金黄色葡萄球菌pcr产物终浓度为10^-13m；金黄色葡萄球菌pcr产物终浓度为10^-14m；金黄色葡萄球菌pcr产物终浓度为10^-15m。同时以水为靶标作为空白对照。

在61℃下利用伯乐cfx96^tm实时荧光定量pcr仪每分钟对荧光信号进行扫描，结果如图10。

从图中可以看出，本发明的sea反应体系的检测限达到10^-14m，与专利申请号为201610101384.5中的未经过优化的sea反应体系相比，灵敏度提高了1000倍，更加有利于低浓度靶标的检测，为现场快速检测提供优势。

序列表

<110>青岛大学

<120>一种变性泡介导的靶标核酸扩增方法及其专用试剂盒与应用

<160>14

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>38

<212>dna

<213>bursaphelenchusxylophilus

<400>1

agccttctgggcgcgtgattggtgtttgtgcattgccg38

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agccttctgggcgcgt16

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cggcaatgcacaaacacca19

<210>4

<211>43

<212>dna

<213>listeriamonocytogenes

<400>4

gtcattggaaactggaagactggagtgcagaagaggagagtgg43

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gtcattggaaactggaagactg22

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ccactctcctcttctgcac19

<210>7

<211>50

<212>dna

<213>staphylococcusaureus

<400>7

ggttcaaaagtgaaagacggtcttgctgtcacttatagatggatccgcgc50

<210>8

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ggttcaaaagtgaaagacggtcttg25

<210>9

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gcgcggatccatctataagtgac23

<210>10

<211>41

<212>dna

<213>anasplatyrhynchos

<400>10

cgcataaccctcctagtccaagccggacggactcgtatccc41

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

cgcataaccctcctagtccaag22

<210>12

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

ccctctgctcaggcaggc18

<210>13

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

cgtggataacctacctataagactgg26

<210>14

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

ggtaccgtcaagatgtgcacagttac26