本发明属于生物技术领域，尤其是一种白洗猪lyrm1基因真核载体的构建方法
背景技术：
lyrm1基因是利用抑制性差减杂交(suppressionsubtractivehybridization，ssh)技术，从肥胖网膜脂肪组织中筛选出的特异性高表达基因，属于lyr家族，lyrm蛋白被鉴定为线粒体oxphos复合物的辅助亚基或装配因子，且已被证明与古代线粒体蛋白质有相互作用。
rt-pcr检测表明lyrm1基因广泛表达于不同组织中，但在脂肪组织中表达水平最高，并具有调节前脂肪细胞池大小和影响脂肪组织稳态的潜力。邱洁等(2009)研究表明对人前体细胞株诱导分化的第2天时lyrm1基因的核酸和蛋白表达水平显著上调。zhang等(2012)对lyrm1基因的研究表明其具有促进3t3-l1前体脂肪细胞增殖和抑制其凋亡的作用。zhu等(2010)对lyrm1基因的研究表明可显著增加胚胎干细胞p19细胞的增殖，认为lyrm1可能具有调节细胞生长，凋亡和心脏发育的潜力，对lyrm1基因的多态性研究显示，lyrm1基因可作为影响秦川牛体重和肉质特征的辅助选择。
技术实现要素：
本发明的目的是：提供一种白洗猪lyrm1基因真核载体的构建方法，它能免除从组织中提取蛋白的繁琐步骤，简化操作。
本发明是这样实现的：白洗猪lyrm1基因真核载体的构建方法，包括以下步骤：提取白洗猪皮下脂肪组织的rna，经逆转录获得白洗猪的cdna，将cdna经pcr扩增获得lyrm1基因的cds区序列，将扩增后产物胶回收与pucm-t载体连接，转化进入top10感受态细胞进行培养，蓝白斑筛选，选取白色菌落经lb液体培养基扩培，pcr检测验证，质粒提取测序验证；回收重组质粒和pegfp-n3载体的双酶切的目的片段进行连接，获得pegfp-n3(+)-lyrm1重组载体；
所述的引物包括上游引物xhoⅰ和下游引物kpnⅰ，其中上游引物xhoⅰf的序列5-ccg
所述的pcr反应体系为：所述的pcr扩增的反应总体系20ul:上、下游引物各1.0μl，模板cdna1.0μl，2×estaqmastermix10μl，ddh2o7μl，pcr的反应条件为：95℃预变性5min；{95℃变性30s，57℃退火15s，72℃延伸30s}×35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。
用1.5％的琼脂糖凝胶对pcr产物进行电泳检测，切胶回收目的条带和pucm-t载体连接；连接体系：pucm-t载体1ul，目的片段5ul，buffer1ul，t4dna连接酶1ul，ddh2o1ul；将反应混合物在16℃金属浴连接过夜；将反应产物连接到100ul感受态细胞中，培养后选取白色单菌落分别加入盛有amp抗性的lb液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h～16hpcr检测菌液阳性克隆，提取重组质粒测序验证。
双酶切体系如下：重组质粒、pegfp-n3(+)空载体各18ul，kpnⅰ3ul，xhoi3ul，10×quickcutgreenbuffer6ul，37℃恒温水浴锅中酶切3h，用1.5％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测，切胶回收目的条带和pegfp-n3(+)空载体；连接体系：pegfp-n3(+)空载体10ul，目的片段2ul，buffer1.5ul，t4dna连接酶1.5ul；将反应混合物在16℃金属浴连接过夜；将反应产物连接到100ul感受态细胞中，培养后选取白色单菌落分别加入盛有5mlkana抗性的lb液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h～16h菌液检测阳性克隆，提取重组质粒，双酶切鉴定，阳性克隆。
由于采用了以上技术方案，本发明能在构建白洗猪lyrm1基因真核载体时，免除从组织中提取蛋白的繁琐步骤，简化操作。本发明通过简单的方法克隆白洗猪lyrm1基因并构建真核表达载体，为白洗猪基因检测方法的建立提供基础，可从细胞生物学探究lyrm1蛋白对脂肪形成的影响，为白洗猪的从分子选种培育提供理论依据。
附图说明
图1lyrm1基因cds区扩增产物；
图2lyrm1基因的菌液pcr结果；
图3lyrm1t载体连接后重组质粒的凝胶电泳结果；
图4lyrm1t载体连接后重组质粒的双酶切结果；
图5lyrm1pfgfp-n3(+)重组质粒的凝胶电泳结果；
图6pfgfp-n3(+)-lyrm1重组质粒的双酶切结果。
具体实施方式
本发明的实施例：白洗猪lyrm1基因真核载体的构建方法
材料和方法
试验样品
试验动物来自贵州省施秉县贵州优匹克生态农业发展有限公司白洗猪种质资源保护基地。参照国家《生猪屠宰操作规程》(gb/t17236～1998)标准进行屠杀白洗猪，采取皮下脂肪组织样。锡箔纸装编号放入液氮罐中保存，带回试验室，提取rna进一步逆转录为cdna用于后续实验的操作。
试验试剂
本试验所需主要试剂有：逆转录试剂盒、琼脂糖、高纯度质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒等购自北京康为世纪生物科技有限公司；t-克隆pcr产物克隆试剂盒等购自生工生物工程技术有限公司，goldview染料2×taqmastermix、琼脂糖、、top10感受态细胞、lb培养基、iptg、x-gal、氨苄霉素等购自北京鼎国生物工程技术有限公司等。dm2000dnamarker、限制性内切酶kpni、xhoi和t4dnaligase均购自大连宝生物工程有限公司。
实验方法
白洗猪皮下脂肪组织rna的提取
(1)取约100mg组织样品于研钵中加入液氮研磨成粉末状，转移至含有1mltrizol的1.5ml离心管中,上下颠倒混匀，静置10min后，再加入200μl氯仿，冰上放置3min；
(2)4℃12000rpm，离心15min，移液枪吸取上清至新离心管，加入500μl异丙醇颠倒混匀，冰上静置10min，4℃12000rpm，离心10min；
(3)弃上清，保留白色沉淀物(白色沉淀为rna)，加入75％的乙醇1ml，冰上静置2min，4℃7500rpm，离心10min。重复操作此步骤一次；
(4)弃上清，将离心管倒置在滤纸上晾10min。加入30μldepc水，放置55-60℃孵化箱中孵育15min；
(5)取1μlrna于超微量紫外分光光度计进行浓度和纯度检测，od260/od280的值在1.8～2.0效果最佳，将rna于-80℃冰箱保存备用。
rna的逆转录反应
将提取的质量符合标准的皮下脂肪rna按照thermoscientificrevertaidtmfirststrandcdnasynthesis试剂盒说明操作，进行cdna第一链的合成，具体步骤如下：
(1)将rna原液和反转录试剂盒的5×reactionbuffer、oligo(dt)18nrimer、ribolocktmrnainhibitor、10mmdntpmix、revertaidtmm-mulvrt、water(nucleasefree)各成分置于冰上解冻，融化后瞬时离心备用。
(2)在超净工作台中，按照(1)中试剂的顺序依次各取1ul、4ul、1ul、1ul、2ul、1ul、10ul加入到200ul无酶的离心管中，振荡混匀，配成20ul的反应体系。
(3)42℃，60min；70℃，5min，反应结束冰上冷却至室温，超微量紫外分光光度计进行浓度检测，将合格的cdna分装于-80℃保存。
lyrm1基因的引物设计
根据genebank上传的lyrm1基因的cds区序列，设计lyrm1基因的引物(primier5.0软件)，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，lyrm1基因的引物序列信息见表1.
表1lyrm1基因的引物序列信息
lyrm1基因cds区扩增
以逆转录获得的cdna为模板进行lyrm1基因cds区扩增，反应总体系20ul:上、下游引物各1.0μl(10μm)，模板cdna1.0μl，2×estaqmastermix10μl，ddh2o7μl，pcr的反应条件为：95℃预变性5min；{95℃变性30s，57℃退火15s，72℃延伸30s}×35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。将pcr扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
lyrm1基因cds区扩增产物的回收纯化
(1)切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，装入称量后的1.5ml离心管中，称量凝胶的重量；
(2)加入3个凝胶体积的bufferde-a，混合均匀后放置75℃水浴锅中加热，使凝胶完全熔化；
(3)加0.5个体积bufferde-a体积的bufferde-b，混合均匀；
(4)将步骤3中的混合液，转移到dna制备管中，12000g离心1min，倒掉滤液；加入500μlbufferw1，12000g离心30s，弃滤液；
(5)加入700μlbufferw2，12000g离心1min，弃滤液，重复此步骤一次；
(6)将制备管放回2ml离心管中，12000g空离心2min；
(7)将制备管置于1.5ml离心管中，加入30μleluent，室温静置5min，12000×g离心1min洗脱dna；
(8)用eluent校正超微量紫外分光光度计，对胶回收产物进行浓度和纯度的检测，存于-20℃冰箱；
cds区扩增胶回收产物与pucm-t载体连接
在pcr管中依次加入pucm-t载体(50ng)1ul，目的条带回收产物5μl，10×ligationbuffer1μl，50％peg40001μl，sterilizedddh2o1μl，t4dnaligase1μl，混匀构建10μl的连接反应体系，16℃金属浴连接过夜。
质粒转化与蓝白斑筛选
质粒转化：
(1)将100ul感受态细胞置于冰上解冻，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮；
(2)加入上述5ul连接液，轻轻混匀，冰上放置30min；
(3)42℃水浴热激90sec，在冰上放置20min；
(4)加入700ullb培养基，37℃摇床200rpm振荡培养1h；
(5)4000rpm离心5min，用移液枪吸掉500ul上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；
(6)将细菌悬液均匀涂布在含20uliptg(100mm)和100ulx-gal(20mg/ml)的氨苄青霉素抗性的lb平板上；
(7)先将平板正向放置1小时，以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
筛选
在超净工作台中，观察氨苄青霉素抗性的lb平板上菌落的生长情况，用移液枪在火焰旁挑取单个白色单菌落分别加入盛有amp抗性的lb液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h～16h。
2.3.5菌液pcr鉴定
以培养的菌液为模板，按照如下体系和条件进行pcr扩增，初步检测载体构建情况。pcr反应体系：上、下游引物各1.0μl，模板1.0μl，2×estaqmastermix10μl，ddh2o补充至20ul。pcr的反应条件为：95℃预变性5min；{95℃变性30s，57℃退火15s，72℃延伸30s}×35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。将pcr扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶成像系统观察目的条带。重组质粒提取
按照康为世纪高纯度质粒小提试剂盒说明书对pcr鉴定正确的菌液进行质粒提取，按如下步骤进行操作：
(1)取2ml过夜培养的菌液加入离心管中，6200×g离心3min收集菌体沉淀，尽量吸弃上清。
(2)向菌体沉淀中加入250ul的bufferp1(已加入rnasea)，涡旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀，确保菌块彻底混匀。
(3)向离心管中加入250ulbufferp2，温和地上下颠倒混匀4-6次，充分混匀使菌体裂解，此时溶液清凉粘稠。注意温和混匀，不要剧烈震荡，以免造成基因组dna污染，此步骤所用时间应不超过5min，以免质粒受到破坏。
(4)向离心管中加入350ulbuffern3，立即温和的上下颠倒混匀4-6次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，16200×g离心10min。注意buffern3加入后立即混匀，以避免产生局部沉淀。
(5)将步骤(4)中所得的上清液转移到已装入收集管的吸附柱中，16200×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管。
(6)向吸附柱中加入750ul的bufferpw(已加入无水乙醇)，16200×g离心1min，倒掉收集管中的废液。
(7)将吸附柱重新放回收集管中，16200×g离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以将残存的乙醇去除，将收集的质粒置于-20℃保存备用。选取克隆成功的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
重组质粒和pegfp-n3(+)空载体的双酶切
对重组质粒和pegfp-n3(+)空载体进行xhoi和kpni双酶切，酶切体系如下；
37℃恒温水浴锅中酶切4h，用1％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测，按照sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书对目的条带和pegfp-n3(+)空载体的大片段进行凝胶回收，按如下体系和条件进行连接反应：
pegfp-n3(+)-lyrm1重组载体的克隆纯化
按照该章1.3.4步骤对pegfp-n3(+)-lyrm1重组载体进行克隆纯化，1.3.5和1.3.6步骤分别进行菌液pcr鉴定和质粒提取，1.3.7步骤对重组质粒进行双酶切鉴定，对鉴定正确的菌液送上海英维捷基生物有限公司双向测序。
2.3.9重组载体的菌液保存
将鉴定正确的重组质粒的菌液加入到2ml离心管中，等比例加入50％的甘油，上下颠倒混匀，用pv膜封口，-80℃冰箱保存。
序列表
<110>贵州大学
<120>白洗猪lyrm1基因真核载体的构建方法
<130>nm:
<160>2
<170>patentinversion
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
atgacaacggcaacacgacaa21
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
ggaaacctcatcgtgagactg21