本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及美人鱼发光杆菌溶血素hlych蛋白的制备及鉴定方法。
背景技术：
美人鱼发光杆菌(photobacteriumdamselae)是嗜盐病原菌中的重要成员，感染该菌的患病鱼临床以出血性败血症为典型特征，发病迅速，死亡率高，对海洋经济鱼类养殖业造成了重大经济损失。人和其他哺乳动物也能发生感染，与一种人-兽-鱼共患的致病菌。已知高致病力的美人鱼发光杆菌通常携带约150kb的毒力质粒，编码两种关键性的毒力因子-溶血素dly蛋白和hlyapl蛋白，同时染色质中也携带溶血素hlych基因，这三种溶血素都对细菌的毒力有不同程度的影响。溶血素是美人鱼发光杆菌重要的毒力因子之一，能够作用于红细胞的脂质双分子层，使细胞膜形成空洞，改变细胞膜的通透性，引起红细胞的破裂溶解，从而释放出更多的血红素，为其提供更多的fe3+，最终导致海水养殖动物组织器官的坏死，甚至造成感染动物的死亡。
2015年11月，秦皇岛昌黎县某海水养殖厂养殖的大菱鲆(turbot)大量发病，病鱼表现为体表溃疡、鳍部出血、尾部溃烂、严重腹水，致死率高达80％，凸显出重要的病原学意义。本课题组从腹水中分离鉴定了美人鱼发光杆菌，并由中国海洋微生物保藏中心命名为mccc1k03226。鉴于美人鱼发光杆菌的高致病力以及溶血素的重要作用，研究美人鱼发光杆菌溶血素的携带情况及溶血素的免疫保护效果，以期开发基因工程亚单位疫苗，最终达到控制该病的目的，是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌溶血素hlych蛋白，本发明利用原核表达系统对其表达和纯化，分析溶血素hlych蛋白的免疫原性，并进行动物保护实验。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌溶血素hlych蛋白，在开发美人鱼发光杆菌基因工程亚单位疫苗中应用。
进一步地，所述的一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌溶血素hlych蛋白的制备方法，具体步骤如下
1)重组载体pmd18t-hlych的构建
提取美人鱼发光杆菌的基因组dna，所述美人鱼发光杆菌的菌种保藏编号为mccc1k03226，以基因组dna为模板，以hlych-f、hlych-r为引物扩增去除信号肽编码序列的hlych基因，采用降落pcr扩增hlych基因全长，所述引物hlych-f、hlych-r的序列如下：
hlych-f：5'-gcggatccgacgttatatcaatattaagcag-3'；带有bamhⅰ酶切位点；seqidno：10；
hlych-r：5'-gcgtcgacttactgatttatggttgatgggtc-3'；带有sali酶切位点；seqidno：11；
将获得的所述hlych基因与t载体连接，获得重组载体pmd18t-hlych，并对所述重组载体pmd18t-hlych进行测序，进行蛋白质亚细胞定位；
2)重组表达载体pet32a-hlych的构建
使用限制性内切酶bamhi和sali分别对所述重组载体pmd18t-hlych和表达载体pet32a(+)进行双酶切，凝胶电泳回收酶切产物，按比例混合，22-25℃连接2-3h，转化大肠杆菌感受态细胞中，接入lb平板一中，37℃培养过夜；挑取单菌落摇菌，使用载体通用引物进行pcr鉴定；将阳性菌落扩大培养，保存菌种并提取质粒pet32a-hlych；
3)hlych的原核表达
将所述质粒pet32a-hlych转化表达菌株bl21中，涂布到lb平板二中，37℃培养过夜；挑取所述lb平板二的单菌落摇菌过夜，次日吸取1ml菌液接种100ml的液体lb培养基中，220r/min摇菌，至od600值达为0.6-0.8，加入iptg诱导表达4-6h。
进一步地，步骤2)中所述重组载体pmd18t-hlych与所述表达载体pet32a(+)酶切回收产物的比值为3:1。其中，所述重组载体pmd18t-hlych与所述表达载体pet32a(+)酶切回收产物的比值过高或者过低，则会导致重组表达载体pet32a-hlych难以构建成功。
进一步地，步骤2)中所述感受态细胞为dh5α。
进一步地，步骤2)中所述lb平板一与所述lb平板二为含有氨苄青霉素的固体lb平板，所述氨苄青霉素的浓度为45-55μg/l。其中，氨苄青霉素的浓度过低或过高，均会导致筛选阳性菌落失败。
进一步地，步骤3)中所述液体lb为含有氨苄青霉素的液体lb，所述氨苄青霉素的浓度为45-55μg/l。其中，氨苄青霉素的浓度过低则筛选压力不够，重组表达载体容易丢失，过高则细菌生长不良。
进一步地，步骤3)中所述iptg的浓度为1mm。其中，iptg的浓度过高，细菌生长抑制，过低则蛋白表达量不足。
美人鱼发光杆菌溶血素hlych蛋白的鉴定方法，包括sds-page分析和westernblot验证；
将所述菌悬液离心并收集菌体，pbs洗涤3次后重悬，加入loadingbuffer煮沸裂解，进行sds-page，电泳结束后，凝胶染色脱色观察结果；同时进行westernblot验证目的蛋白的表达。
进一步地，所述sds-page电泳中分离胶浓度为12％。其中，使用12％含量的丙烯酰胺，蛋白分离效果较好。
进一步地，所述westernblot方法中，一抗为带his标签单克隆抗体，浓度为1:6000、二抗为羊抗鼠igg-hrp，浓度为1:4000。
所述美人鱼发光杆菌溶血素hlych蛋白，通过elisa评价其免疫原性；步骤如下：
诱导hlych蛋白表达，后利用超声裂解菌体，离心，分别取上清和沉淀进行sds-page，确定hlych蛋白为包涵体表达；利用qiagenni-nta柱对蛋白纯化；以10ng/孔蛋白包被酶标板，小鼠免疫血清为一抗，hrp-羊抗兔二抗为酶标抗体，进行elisa测定，测定抗体效价。
所述美人鱼发光杆菌溶血素hlych蛋白，通过动物实验评估其免疫保护力；
所述动物实验评估方法为：加强免疫后，隔两周进行细菌攻毒，腹腔注射balb/c小鼠美人鱼发光杆菌mccc1k03226，剂量为5ld50(即6×107cfu)，感染后一周内统计死亡小鼠数量。
本发明公开提供了美人鱼发光杆菌溶血素hlych蛋白的制备及鉴定方法，至少有以下优点：
(1)美人鱼发光杆菌的hlych蛋白具有良好的免疫原性，可以用于建立elisa诊断方法，为高毒力美人鱼发光杆菌病的快速诊断奠定了基础。
(2)本发明公开的美人鱼发光杆菌的hlych蛋白免疫小鼠后能够使65％的免疫小鼠得到保护，即本发明中的美人鱼发光杆菌的hlych蛋白在美人鱼发光杆菌疫苗研究中具有广阔的前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的美人鱼发光杆菌mccc1k03226单菌落在绵羊血平板上的溶血活性；
图2附图为本发明提供的美人鱼发光杆菌mccc1k03226单菌落在兔血平板上的溶血活性；
图3附图为本发明提供的溶血素基因检测的pcr琼脂糖凝胶电泳图；
其中，泳道m为marker；泳道1为hlych；泳道2为hlypl；泳道3为dly；
图4附图为本发明提供的hlych基因pcr琼脂糖凝胶电泳图；
其中，泳道m为marker；泳道1为hlych；
图5附图为本发明提供的hlych蛋白二级结构预测图；
图6附图为本发明提供的溶血素hlych蛋白的sds-page电泳图；
其中，泳道1为溶血素蛋白hlych；泳道2为空载对照；
图7附图为本发明提供的溶血素hlych蛋白的westernblot电泳图；
其中，泳道1为溶血素蛋白hlych；泳道2为空载对照；
图8附图为本发明提供的纯化溶血素hlych蛋白的sds-page电泳图；
其中，泳道m为marker；泳道1为纯化前的溶血素hlych蛋白；泳道2为纯化后的溶血素hlych蛋白；
图9附图为本发明提供的血清westernblot验证分析电泳图；
其中，泳道m为marker；泳道1为阳性血清；泳道2为阴性对照。
图10附图为本发明提供的hlych蛋白的小鼠免疫保护率。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
细菌溶血活性观察
分别制备绵羊血和兔血平板，挑取美人鱼发光杆菌mccc1k03226单菌落，在绵羊血和兔血平板上划线，30℃培养24h，观察其溶血活性，结果如图1和图2所示，其中如图1为绵羊血，图2为兔血。由图1和图2可知，该菌在绵羊血和兔血平板平板上均呈β型溶血，显示该菌具有非常强的溶血活性。
实施例2重组载体pmd18t-hlych的构建
从ncbi下载photobacteriumdamselaesubsp.damselaecip102761(phddcip102761，基因登录号：nz_adbs00000000)全基因组序列，找到dly、hlyapl和hlyach基因序列，设计引物，引物序列见表1；其中dly基因序列为seqidno：1；hlyapl基因序列为seqidno：2；hlyach基因序列为seqidno：3。使用细菌基因组提取试剂盒提取菌种mccc1k03226dna的基因组dna，以基因组dna为模板，使用表1中引物，采用降落pcr进行扩增，反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3，其中引物dly-f检、dly-r检扩增dly基因部分长度，用于检测溶血素dly蛋白；引物hlypl-f检、hlypl-r检扩增hlypl基因部分长度，用于检测质粒编码的溶血素；引物hlych-f检、hlych-r检扩增hlych基因部分长度，用于检测染色质编码的溶血素。
表1：引物序列表
由图1可知，三种溶血素dly蛋白、hlypl蛋白和hlych蛋白中，hlych基因约为420bp检测为阳性，因此判断该菌mccc1k03226dna携带hlych基因，而不携带hlypl和dly基因。
进一步以菌种mccc1k03226dna的基因组dna为模版，根据ncbi公布的hlych基因序列，利用signaip进行信号肽预测，利用引物hlych-f、hlych-r采用降落pcr的方法扩增去除信号肽编码序列的hlych基因全长，反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4。由图4可知，扩增条带大小与预期符合，约为1812bp。
将hlych基因全长与t载体按常规方法连接，获得重组载体pmd18t-hlych，并将重组载体pmd18t-hlych进行测序，对测序结果应用ncbi的blastn工作区进行同源性比对，发现扩增的hlych基因与美人鱼发光杆菌溶血素hlya基因同源性达到99％，因此确定成功获得了美人鱼发光杆菌mccc1k03226的hlych基因全长。
进一步应用在线软件protparam(http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam)分析其基本理化特性；应用在线软件psortb(http://www.psort.org/psortb/)进行蛋白质亚细胞定位分析，可知该基因编码蛋白大小(去除信号肽)为64.7kda；半衰期为20h(体外哺乳动物细胞内)，稳定系数为40.17，属易降解蛋白；蛋白质亚定位分析显示hlych蛋白为胞外蛋白，这与其发挥的生物学功能相适应，即蛋白被分泌出细菌，从而引起宿主红细胞溶血。进一步利用dnastar分析hlych蛋白二级结构，结果如图5。由图5可知，hlych蛋白二级结构包括14个ɑ螺旋，22个β折叠和50个转角。
实施例3重组表达载体pet32a-hlych的构建与原核表达
使用限制性内切酶bamhi和sali分别对pmd18t-hlych和表达载体pet32a(+)进行双酶切，凝胶电泳回收酶切产物并按照3:1的比例混合，22℃连接2h，将结合物转化到大肠杆菌感受态dh5α中，涂布在含amp的lb平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落摇菌，使用载体通用引物进行pcr鉴定。挑取阳性菌落扩大培养，保存菌种并提取质粒，重组质粒记为pet32a-hlych。
用提取的重组质粒转入表达菌株bl21中涂布在含amp的lb固体平板，37℃培养过夜。挑取amp平板上的单菌落摇菌过夜，次日吸取1ml菌液接种于100ml含amp的液体lb培养基，220r/min摇菌，至od600值达到0.6，加入iptg诱导表达4h。
实施例4美人鱼发光杆菌溶血素hlych蛋白的鉴定方法
离心收集菌体，pbs洗涤3次后pbs重悬，加入loadingbuffer煮沸裂解，进行sds-page，其中分离胶的浓度为12％，电泳结束后，凝胶染色脱色观察结果，结果如图6，由图6可知，目的蛋白符合预期蛋白大小约为79kda，而空质粒对照(emptyvector)表达的蛋白约20kda。
同时，以带his标签单克隆抗体为一抗，浓度为1:600-1000、羊抗鼠igg-hrp为二抗，浓度为1:1000-2000，进行westernblot验证目的蛋白的表达，结果如图7所示，由图7可知，在79kda处出现了预期印迹条带，由图6和图7得出hlych蛋白获得了表达。
实施例5hlych蛋白的鼠源抗血清的制备及效价测定
诱导hlych蛋白表达，后利用超声裂解菌体，离心，分别取上清和沉淀进行sds-page，确定hlych蛋白为包涵体表达；利用qiagenni-nta柱对蛋白纯化，纯化结果如图8，由图8可知，蛋白纯化效果良好。
纯化蛋白加入弗氏完全佐剂，比例为1:1，乳化后免疫6周龄balb/c小鼠，免疫剂量为100μg/只；3周后纯化蛋白加入弗氏不完全佐剂比例为1:1进行乳化，进行二次免疫，再两周后加强免疫，步骤与二次免疫一致。其中二次免疫和加强免疫剂量均为50μg/只，免疫结束后小鼠眼球取血，分离血清，将血清1:200稀释后，进行westernblot分析，结果如图9。由图9可知，在约79kda处出现了明显的印迹条带，与预期蛋白大小一致，说明hlych蛋白具有一定的免疫原性。
将培养至对数期的美人鱼发光杆菌mccc1k03226，使用1mlpbs洗涤重悬，加入loadingbuffer煮样后，进行westernblot分析。
以10ng/孔蛋白包被酶标板，小鼠免疫血清为一抗，hrp-羊抗兔二抗为酶标抗体，进行elisa测定，测定抗体效价。经过elisa检测，抗体效价为1:5000，说明hlych蛋白具有较高的免疫原性。
实施例6hlych蛋白的免疫保护力评价
免疫方法同实施例5：纯化蛋白加入弗氏完全佐剂，比例为1:1，乳化后免疫6周龄balb/c小鼠，免疫剂量为100μg/只；3周后纯化蛋白加入弗氏不完全佐剂比例为1:1进行乳化，进行二次免疫，再两周后加强免疫，步骤与二次免疫一致，其中二次免疫和加强免疫剂量均为50μg/只。加强免疫两周后，进行细菌攻毒，腹腔注射balb/c小鼠美人鱼发光杆菌mccc1k03226，剂量为5ld50(即6×107cfu)，感染后一周内统计死亡小鼠数量。由图10可知，hlych蛋白免疫小鼠后，其免疫保护力较高，能够达到65％。
综上所述，本发明美人鱼发光杆菌的hlych蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护力，可以用于开发基因工程亚单位苗，为美人鱼发光杆菌病的防控奠定了基础。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110>河北科技师范学院
<120>一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌溶血素hlych蛋白
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
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<213>artificialsequence
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