本发明属于生物学和基因工程技术领域，尤其涉及近一种编码蛋白pm_mf的鉴定方法和应用。蛋白基因pm_mf属于近海游动球菌新型mf(majorfacilitator)家族。
背景技术：
目前，业内常用的现有技术是这样的：
据了解，目前我国约有5亿亩盐碱土地，并且干旱半干旱地区有1亿多人口正处在耕地盐碱化威胁之中。东北盐碱地在黑土区的西边，黑土区也受到盐碱的威胁。新疆耕地盐碱化已经严重威胁当地群众生存，成为最突出的民生问题。因此，盐碱土地的开发治理对保障区域资源安全、粮食安全、生态安全和社会稳定具有重大战略意义。
目前国内常用的盐碱地改良技术中，生物改良法利用微生物肥料调节改善土壤盐碱度被认为是最具有可持续发展意义的环保科学治理方法之一。但是可作为微生物肥料的细菌耐盐碱能力却十分有限，诸如根瘤菌、固氮菌、磷细菌、钾细菌和根际促生菌等，因此，嗜盐菌中关键耐盐碱基因对于耐盐碱微生物肥料的研发具有重要意义，甚至其耐盐碱分子遗传机制对理解植物的耐盐碱分子遗传机制，以及进一步构建可种植的耐盐碱农作物具有重要的启示作用。
pm_mf是一个新型具有耐盐碱能力，同时具有多药物外排能力的mf(majorfacilitator)家族蛋白，其具体功能仍然被注释，对本研究发现的该蛋白的双功能也没有明确鉴定，因此，对pm_mf蛋白的多药物外排和阳离子(na+、li+、k+)的转运功能分析，对进一步开发应用该蛋白于耐盐碱生物肥料，或研发高效耐盐转基因作物具有重要研究意义；并且同时具有的多药物抗性功能还可以作为抗性筛选标记，在微生物肥料的制作以及转基因作物的杂合基因分离纯化具有显著的辅助作用。
综上所述，现有技术存在的问题是：
对于研发耐盐碱转基因作物时基因的选定没有优质的基因选择，在研发针对盐碱土壤的微生物肥料的耐盐碱微生物选择，或引入的基因没有明确合适的选择；对于具体功能未注释的基因pm_mf缺乏功能分析鉴定的技术，尤其是对其负责转运多种抗生素药物和阳离子na+、li+、k+的功能鉴定存在困难。
现有的研究技术对进一步理解mf(majorfacilitator)家族蛋白转运多种抗生素药物分子机制与钠(锂)/氢逆向转运蛋白耐盐碱的分子机制之间的关系缺乏足够理论支持和技术支持，导致在双功能蛋白的应用上不能切入机制根本，解决此问题将极大的提高该蛋白的应用价值，明确如何充分合理利用该蛋白耐盐碱与多药物抗性的双功能优势，实现双功能共同作用在微生物肥料研发，以及有效规避新环境问题的引入，为实现根本上治理盐碱土壤的危害提供新的指导方向。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种一种编码蛋白pm_mf的鉴定方法和应用。蛋白基因pm_mf为近海游动球菌新型mf(majorfacilitator)家族蛋白基因。
本发明的目的是从近海游动球菌中获得新型或者高效耐盐碱的关键基因，用以深入分析细菌耐盐碱的分子机制，以及构建转基因耐盐碱作物和微生物，进而充分开发和利用盐碱地。因此，通过基因文库和功能互补相结合的方法，本发明在基因文库构建中常以载体所携带的抗性作为筛选条件之外，利用盐敏感缺陷株e.coliknabc的生理特性，还在筛选培养基中加入0.2mnacl作为第二条件，成功地从近海游动球菌中克隆到一种近海游动球菌新型mf(majorfacilitator)家族蛋白基因pm_mf，编码一个1272bp的完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列如seqidno.1所示，近海游动球菌基因组序列已经公开，然而其基因功能注释为未知功能蛋白(hypotheticalprotein)。
一种编码蛋白pm_mf的鉴定方法，所述编码蛋白pm_mf的鉴定方法应用蛋白pm_mf；所述蛋白pm_mf具有na+(li+、k+)/h+逆向转运蛋白活性，所述活性具有ph依赖性；
所述蛋白pm_mf还具有多药物外排活性，用于药物eb和诺氟沙星的输出。
进一步，所述编码蛋白pm_mf的鉴定方法包括以下步骤：
1)通过基因文库和功能互补相结合的方法，以0.2mnacl的氨苄抗性固体培养基作为筛选工具，得到含有耐盐碱基因的片段；
2)利用生物信息学软件对基因片段进行分析，确定耐盐碱的基因，通过pcr扩增得到pm_mf基因，所述pm_mf基因的核苷酸序列如seqidno.1；构建含有pm_mf基因的原核表达载体；
3)通过基因功能互补的方法，对pm_mf基因的生理功能进行鉴定；
4)通过westernblot实验，对预测为膜蛋白的蛋白pm_mf进行细胞定位鉴定；
5)再通过荧光猝灭技术手段，对pm_mf蛋白功能进行鉴定，pm_mf蛋白的氨基酸序列如seqidno.2；
步骤4)中，westernblot细胞定位方法包括：利用超离法将knabc/pet-pm_mf细胞的胞浆蛋白与膜蛋白分离开，再通过蛋白印迹杂交westernblot的方法，分别对提取的细胞全蛋白、胞浆蛋白和膜蛋白进行检测；
步骤5)中，所述荧光猝灭技术手段，包括：以吖啶橙ao作为荧光探针，检测荧光猝灭及恢复情况；向盛2.5ml缓冲液b的石英杯中加入2μm荧光探针吖啶橙ao和40μg的反转膜，抽吸混匀；再加入终浓度为5mm的tris-d-乳酸并混匀反应体液；乳酸作为底物，通过呼吸链产生跨膜ph梯度δph，此时荧光强度已开始下降；利用荧光分光光度计来监控跨膜ph梯度的变化；
荧光监控参数设置：激发光ex波长492nm，发射光(em波长526nm；当荧光强度下降至稳定状态时，向反应体系加入终浓度为5mm的nacl、kcl、licl，以破坏ph梯度δph，此时荧光强度开始升高；根据荧光强度的恢复程度判断并表示na+(li+，k+)/h+逆向转运蛋白活性的有无及大小；
所述构建含有pm_mf基因的原核表达载体包括构建pet-pm_mf原核表达载体，构建方法包括：
根据pm_mf基因序列，首先利用primer5软件设计特性引物pm_mf-f与pm_mf-r特异引物，并在基因的5’和3’端分别引入ndei、bamhi两个酶切位点，然后进行pm_mf的pcr扩增；
将pcr扩增产物末端加“a”后连入peasy-t3载体，然后化转到trans1-t1感受态细胞中，进行蓝白斑筛选出亚克隆；再用ndei、bamhi两种内切酶处理重组质粒peasy-pm_mf，并同时对pet19b原核表达载体做相同处理，对处理后的pet19b和pm_mf片段进行回收并连接，通过热激法将构建好的表达载体pet-pm_mf导入异源表达宿主e.coliknabc中。其具体方法如下：
取e.coliknabc感受态细胞，向其中加入适量的pet-pm_mf重组质粒，轻轻混匀，冰浴30min；然后将盛有上述混合物的离心管至于42℃水浴中热激90s；之后快速移至冰浴，放置10min；再将入37℃预热的新鲜培养基进行复苏45min；最后，取适当体积均匀涂布在含有氨苄抗性的lbk培养基上。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述编码蛋白pm_mf的鉴定方法构建的用于鉴定蛋白pm_mf具有的多药物外排功能的大肠杆菌dh5αacraacrb基因敲除突变株。
本发明的另一目的在于提供一种所述大肠杆菌dh5αacraacrb基因敲除突变株的构建方法，包括以下步骤：
使用野生型大肠杆菌e.colik12为实验菌株，以pkd46作为同源重组的协助质粒，pkd3为pcr扩增提供氯霉素抗性基因的模表达宿主e.coliknabc中；具体方法包括：
设计敲除acraacrb基因的同源重组引物acrab-p1，acrab-p2，5’端为36nt的acraacrb基因两侧的同源臂，3’端为20nt的用于扩增氯霉素抗性基因的引物，以pkd3质粒为模板，扩增氯霉素抗性基因cat，产物片段长1115bp，胶回收后用于电转化，经氯霉素抗性筛选得到的突变株；在acraacrb基因上下游200-300bp设计验证引物acrabverifyf，acrabverifyr，用于pcr扩增敲除后基因组，并用于测序验证；
acraacrb基因敲除后，大肠杆菌多药物外排能力：大肠杆菌k12中acraacrb基因敲除后，失去多药物外排能力，在含有特定浓度抗生素的lb培养基中的无法生长。
本发明的另一目的在于提供一种一种所述编码蛋白pm_mf的鉴定方法中药物eb外排蛋白活性的鉴定方法，包括以下步骤：
cm2/puc18、cm2/puc-pmmf在lb培养基中培养至对数生长期后期，离心收菌；
用不含葡萄糖的m9基本培养基洗涤2次，重悬至od600为0.2；
向菌悬液中加入终浓度2.5mmeb,37℃培养1h；
再次离心收菌，并用含有终浓度2.5mmeb的m9培养基洗涤2次；
相同培养基重悬至od600为0.2；
细胞样品37℃预孵育5min；
荧光检测：检测前向2ml样品体系中加入终浓度20mm的葡萄糖用于供能，随后监测荧光值变化情况；
荧光监控参数设置：激发光ex波长500nm，发射光em波长580nm。
本发明的另一目的在于提供一种所述编码蛋白pm_mf的鉴定方法中诺氟沙星外排蛋白活性的鉴定方法，包括：
cm2/puc18与cm2/puc-pm29在含有40mm乳酸钾的lb培养基中37℃过夜培养，od600值达1.0；
收获细胞，用0.1mtris-hcl(ph7.0)溶液将菌体重悬洗涤三次，洗涤后用相同溶液重悬，使最终细胞密度od600值为1.0；
将菌悬液样品室温孵育5min后，加入终浓度为100μm的诺氟沙星，按照5min，10min，15min的时间间隔逐次取样1ml，8000rpm，30s，4℃离心，0.1mtris-hcl溶液洗涤一次，并用0.1m甘氨酸-盐酸溶液重悬；
取样后向孵育诺氟沙星体系中继续加入cccp至终浓度为100μm，按照5min，10min，15min的时间间隔逐次取样1ml，8000rpm，30s，4℃离心，并用0.1m甘氨酸-盐酸溶液重悬；
以上取样室温下25℃剧烈震荡1h后再次离心，15000rpm离心10min，留上清，0.1m甘氨酸-盐酸溶液将上清液进行两倍稀释后，直接用于荧光定量检测；
荧光监控参数设置：激发光ex波长227nm，发射光em波长488nm。
本发明的另一目的在于提供一种一种利用所述编码蛋白pm_mf的鉴定方法中编码蛋白pm_mf制备的微生物肥料。
其中，近海游动球菌新型mf家族蛋白基因pm_mf编码的蛋白pm_mf，所述蛋白pm_mf的氨基酸序列为seqidno.2。
蛋白基因pm_mf为一个1272bp的完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列如seqidno.1。
本发明的优点及积极效果为：
本发明所提出的pm_mf基因对盐碱地土壤改良具有重要意义，可用于构建高的效耐盐碱工程菌、开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的转基因领域。
本发明近海游动球菌中获取的pm_mf基因可使盐敏感突变株knabc的耐盐碱能力有稳定明显的提高；本发明所提出的蛋白pm_mf为膜蛋白，该蛋白具有na+(li+、k+)/h+逆向转运蛋白活性。丰富了微生物耐盐碱基因资源，可用于构建高效耐盐碱工程菌或抗逆作物等，特别是耐盐和耐碱胁迫的植株具有重大价值。
本发明的pm_mf同时是一个主要负责输出eb和诺氟沙星的新型多药物外排蛋白，可提供一种抗性基因筛选标记，同时可以在引入该基因的应用中提供纯化筛选条件。
本发明的pm_mf的鉴定以及对其功能分析，对进一步揭示mf(majorfacilitator)家族蛋白行使功能的分子机制具有重要研究意义，而且有助于指导对pm_mf蛋白耐盐碱和多药物抗性的双功能作用机制关系的理解，进而指导对性的分子改造与应用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的在线生物软件分析pm_mf蛋白的跨膜区及疏水性图；
图中：a.蛋白的跨膜区预测(红方块表示跨膜区)；b.蛋白的疏水性分析。
图2是本发明实施例提供的pet-pm_mf原核表达载体构建流程图；
图3是本发明实施例提供的pm_mf的pcr产物电泳图；
图中：m:markeriv。
图4是本发明实施例提供的重组质粒peasy-pm_mf蓝白斑验证电泳图；
图中：1:peasy-pm_mf连接转化的蓝斑质粒；2-3:pesay-pm_mf重组质粒(白斑)，m:markeriv；
图5是重组质粒pet-pm_mf的ndei、bamhi双酶切验证图；
图中：m:markeriv。
图6是本发明实施例提供的大肠杆菌(e.coli)knabc阳性克隆转化株的耐盐碱生长测试图；
图中：a.nacl，b.licl，c.ph。
图7是本发明实施例提供的蛋白pm_mf细胞定位图；
图中：a:sds-page电泳图，b：westernblot细胞定位图，m为预染蛋白分子量标准marker，1、3、5泳道为knabc/pet-pm_mf表达pm_mf蛋白的相应样品，2、4、6泳道为阴性对照knabc/pet19b相应处理样品。
图8是本发明实施例提供的pm_mf蛋白活性的鉴定图；
图中：a.na+/h+逆向转运活性，b.li+/h+逆向转运活性，c.k+/h+逆向转运活性。
图9是本发明实施例提供的不同ph值条件pm_mf活性的ph轮廓图；
图中：
●-na+/h+逆向转运活性；■-li+/h+逆向转运活性；▲-k+/h+逆向转运活性。
图10是本发明实施例提供的pm_mf对na+、li+、k+的亲和能力图。
图中：(a)、na+、li+、k+的k0.5值分别是0.72±0.11mm；(b)na+、li+、k+的k0.5值分别是0.98±0.11mm；(c)na+、li+、k+的k0.5值分别是0.89±0.15mm。
图11是本发明实施例提供的大肠杆菌(e.coli)k12的acraacrb基因敲除策略流程；
图12是本发明实施例提供的pm_mf蛋白eb药物外排活性的鉴定图；
图13是本发明实施例提供的pm_mf蛋白诺氟沙星药物外排活性鉴定图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有技术对于具体功能未注释的基因pm_mf缺乏功能分析鉴定的技术，尤其是对其负责转运多种抗生素药物和阳离子na+、li+、k+的功能鉴定；对进一步揭示mf(majorfacilitator)家族蛋白转运多种抗生素药物分子机制以及钠(锂)/氢逆向转运蛋白耐盐碱的分子机制缺乏足够理论支持和技术支持；现有技术对基因pm_mf的耐盐碱功能的转基因作物应用没有指导方向；对于在耐盐碱微生物肥料方面的应用没有指导意义；对于基因pm_mf的多药抗性功能的抗性筛选标记的应用没有明确方向；尤其是对于盐碱耐受、药物耐受双功能的基因应用没有明确指向。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作详细描述。
本发明实施例提供一种利用蛋白pm_mf，氨基酸列如seqidno.2。
所述蛋白pm_mf具有na+(li+、k+)/h+逆向转运蛋白活性，所述活性具有ph依赖性。同时，该蛋白具有多药物外排活性，即同时具有多药物外排蛋白和钠/氢逆向转运蛋白的双重功能，属于新型mf(majorfacilitator)家族蛋白。
所述编码蛋白pm_mf的鉴定方法应用蛋白pm_mf；所述蛋白pm_mf具有na+(li+、k+)/h+逆向转运蛋白活性，所述活性具有ph依赖性；
所述蛋白pm_mf还具有多药物外排活性，用于药物eb和诺氟沙星的输出。
所述编码蛋白pm_mf的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)通过基因文库和功能互补相结合的方法，以0.2mnacl的氨苄抗性固体培养基作为筛选工具，首先得到含有耐盐碱基因的片段；
(2)利用生物信息学软件对基因片段进行分析，确定耐盐碱的基因，通过pcr扩增得到pm_mf基因，该基因的核苷酸序列如seqidno.1；构建含有mf基因的原核表达载体，构建方法包括：
根据pm_mf基因序列，首先利用primer5软件设计特性引物pm_mf-f、pm_mf-r特异引物，并在基因的5’和3’端分别引入ndei、bamhi两个酶切位点，然后进行pm_mf的pcr扩增；将pcr扩增产物末端加“a”后连入peasy-t3载体，然后化转到trans1-t1感受态细胞中，进行蓝白斑筛选出亚克隆；再用ndei、bamhi两种内切酶处理重组质粒peasy-pm_mf，并同时对pet19b原核表达载体做相同处理，对处理后的pet19b和pm_mf片段进行回收并连接，通过热激法将构建好的表达载体pet-pm_mf导入异源表达宿主e.coliknabc中。
(3)通过基因功能互补的方法，首先对该基因的生理功能进行鉴定；
(4)通过westernblot实验，对该预测为膜蛋白的蛋白pm_mf进行细胞定位；
(5)再通过荧光猝灭技术手段(以吖啶橙(ao)作为荧光探针，检测荧光猝灭及恢复情况。即向盛2.5ml缓冲液b的石英杯中加入2μm荧光探针吖啶橙(ao)和40μg的反转膜，抽吸混匀；再加入终浓度为5mm的tris-d-乳酸并混匀反应体液，这里乳酸作为底物，通过呼吸链产生跨膜ph梯度，所以此时荧光强度已开始下降。利用荧光分光光度计来监控跨膜ph梯度(即δph)的变化。荧光监控参数设置：激发光(ex)波长492nm，发射光(em)波长526nm；当荧光强度下降至稳定状态时，向反应体系加入终浓度为5mm的nacl、kcl、licl，以破坏δph，此时荧光强度开始升高；根据荧光强度的恢复程度判断并表示na+(li+，k+)/h+逆向转运蛋白活性的有无及大小，对蛋白pm_mf进行功能鉴定。
本发明提供一种应用于鉴定上述基因pm_mf多药物外排功能的大肠杆菌dh5αacraacrb基因敲除突变株。
本发明提供一种如上述大肠杆菌dh5αacraacrb基因敲除突变株的构建方法，其构建方法包括以下步骤：
使用野生型大肠杆菌e.colik12为实验菌株(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，以pkd46作为同源重组的协助质粒，pkd3((购自优宝生物))为pcr扩增提供氯霉素抗性基因的模板，为重组转化体提供筛选标记；
设计敲除acraacrb基因的同源重组引物acrab-p1，acrab-p2，5’端为26nt的acraacrb基因两侧的同源臂，3’端为20nt的用于扩增氯霉素抗性基因的引物，以pkd3质粒为模板，扩增氯霉素抗性基因cat，产物片段长1115bp，胶回收后用于电转化，经氯霉素抗性筛选得到突变株；在acraacrb基因上下游200-300bp设计验证引物acrabverifyf，acrabverifyr，用于pcr扩增敲除后基因组，并用于测序验证；
acraacrb基因敲除后，大肠杆菌多药物外排能力丧失：大肠杆菌k12中acraacrb基因敲除后，失去多药物外排能力，在含有特定抗生素浓度的培养基中无法生长。
本发明提供一种eb药物外排蛋白活性的鉴定方法，鉴定方法主要包括以下步骤：
cm2/puc18、cm2/puc-pmmf在lb培养基中培养至对数生长期后期，离心收菌。
用不含葡萄糖的m9基本培养基洗涤2次，重悬至od600为0.2。
向菌悬液中加入终浓度2.5mmeb,37℃培养1h。
再次离心收菌，并用含有终浓度2.5mmeb的m9培养基(无葡萄糖)洗涤2次。
相同培养基重悬至od600为0.2左右。
细胞样品需37℃预孵育5min。
荧光检测：检测前向2ml样品体系中加入终浓度20mm的葡萄糖以供能，随后即监测荧光值变化情况。
荧光监控参数设置：激发光(ex)波长500nm，发射光(em)波长580nm。
eb可以直接被激发光激发而产生可监测波长的荧光，在加入葡萄糖恢复细胞代谢后，若eb可以被蛋白外排至胞外，则会造成胞外局部eb浓度过高，从而发生荧光猝灭，表现为荧光值下降。因此可以根据较比阴性对照荧光强度是否下降鉴定蛋白的eb外排活性。
本发明提供一种诺氟沙星外排蛋白活性的鉴定方法，鉴定方法主要包括以下步骤：
cm2/puc18与cm2/puc-pm29在含有40mm乳酸钾的lb培养基中37℃过夜培养，od600值达1.0。
收获细胞，用0.1mtris-hcl(ph7.0)溶液将菌体重悬洗涤三次，洗涤后用相同溶液重悬，使最终细胞密度od600值为1.0。
将上述菌悬液样品室温孵育5min后，加入终浓度为100μm的诺氟沙星，按照5min，10min，15min的时间间隔逐次取样1ml，8000rpm，30s，4℃离心，0.1mtris-hcl(ph7.0)溶液洗涤一次，并用0.1m甘氨酸-盐酸(ph3.0)溶液重悬。
取样后向孵育诺氟沙星体系中继续加入cccp至终浓度为100μm，按照5min，10min，15min的时间间隔逐次取样1ml，8000rpm，30s，4℃离心，并用0.1m甘氨酸-盐酸(ph3.0)溶液重悬。
以上取样室温下(25℃)剧烈震荡(180rpm)1h后再次离心，15000rpm离心10min，留上清，0.1m甘氨酸-盐酸(ph3.0)溶液将上清液进行两倍稀释后，直接用于荧光定量检测。
荧光监控参数设置：激发光(ex)波长227nm，发射光(em)波长488nm。
诺氟沙星可以直接被激发光激发而产生可监测波长的荧光，当细胞被诺氟沙星药物处理时，若细胞膜上存在有诺氟沙星外排活性的蛋白，则可以将细胞内积累的诺氟沙星外排到细胞外，此时检测细胞裂解液中诺氟沙星的荧光值，则会低于阴性对照，即膜蛋白没有外排诺氟沙星能力的样品，由此可以实现蛋白诺氟沙星外排活性的检测。
本发明提供一种上述近海游动球菌基因pm_mf的微生物肥料制备的应用。
本发明提供一种利用上述近海游动球菌基因pm_mf构建的提高耐盐碱性的转基因植物。
本发明提供一种利用上述基因pm_mf构建基因工程载体抗性筛选标记的应用。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作详细描述。
本发明借助大肠杆菌(escherichiacoli)knabc(δnhaa，δnhab，δchaa)菌株盐敏感的生理特征，利用基因文库筛选和功能互补相结合的技术手段，成功的在近海游动球菌中分离出一种新型的耐盐碱基因pm_mf。经过对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，同源比对和系统发育进化树分析，推测pm_mf很可能是一种新型有效的耐盐碱基因。因此本发明继续进行了该预测的验证。功能互补法指导的生理实验结果显示pm_mf能够恢复大肠杆菌(e.coli)knabc对0.2mnacl、5mmlicl以及碱性ph的抗性，表明基因pm_mf确实具有耐盐碱能力。进而本发明利用westernblot技术成功将该蛋白定位于细胞膜，验证了pm_mf为膜蛋白的预测分析结果。利用荧光猝灭技术，发现pm_mf具有钠/氢逆向转运蛋白活性。
根据上述基因序列分析，该基因被认为是mf(majorfacilitator)家族中的成员，进而于已鉴定功能的mf(majorfacilitator)家族蛋白构建系统发育进化树，分析得出pm_mf蛋白与mdth聚簇，可能具有类似mdth的多药物外排功能。
为了进一步验证该推测，本发明成功构建了e.colicm2(δacraδacrb)，即大肠杆菌多药物外排泵缺失突变株，突变后菌株e.colicm2(δacraδacrb)不具有多药物抗性能力。
进而，本发明以e.colicm2为宿主进行了多药物最小抑制浓度(mic)检测，结果表明：pm_mf具有多药物外排能力,其中以eb和诺氟沙星为主要代表。
更进一步，本发明鉴定了pm_mf蛋白的eb外排活性。同时鉴定了pm_mf的诺氟沙星外排活性。结果表明，pm_mf同时具有明显的eb外排活性和诺氟沙星外排活性。
综合上述结果，pm_mf被认为是一个新型mf(majorfacilitator)家族蛋白基因，同时具有钠/氢逆向转运和多药物外排双重功能。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1.
pm_mf基因以及蛋白pm_mf的生物信息学分析，如图1所示。
通过基因文库与基因功能互补相结合的筛选技术，从近海游动球菌中获得含有耐盐碱相关的基因片段，所述的耐盐碱相关的基因片段中含有一个长1272bp的完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列如seqidno.1所示；序列分析显示，其与一个推测的mf(majorfacilitator)家族转运蛋白表现出最高同源性，为98％，由此推测该基因同样编码一个mf(majorfacilitator)家族的蛋白，故将该基因命名为pm_mf。
本发明利用在线预测网站http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/和http://web.expasy.org/protscale/对pm_mf基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析，发现该基因编码的蛋白pm_mf具有12个跨膜区，且蛋白呈现出高疏水性。
借助dnaman6.0对蛋白pm_mf的氨基酸残基组成分析显示，pm_mf由424个氨基酸残基组成，预测的分子量为47922.92daiton，等电点pi为8.99。氨基酸残基依次为leu(55/424)、phe(47/424)、ala(41/424)、val(33/424)、gly(31/424)、ile(31/424)、ser(26/424)、thr(24/424)、glu(18/424)、arg(17/424)、met(17/424)、lys(15/424)、trp(14/424)、tyr(13/424)、pro(12/424)、gln(10/424)、asp(10/424)、asn(8/424)、his(1/424)和cys(1/424),其中最高丰度的氨基酸为leu(55/424)；最低丰度的氨基酸为his(1/424)和cys(1/424)。
实施例2.
pm_mf与已鉴定na+/h+逆向转运蛋白的系统发育进化树以及于同系物的同源性比对，
根据预测的mf(majorfacilitator)家族定位，本发明建立了家族同系物与已鉴定na+/h+逆向转运蛋白的系统发育进化树，进化树显示mf(majorfacilitator)家族蛋白形成独立分支，阙值为99％，而与已鉴定的na+/h+逆向转运蛋白或具有na+/h+逆向转运活性的其他蛋白系统发育关系较远，因此认为pm_mf编码一个新型na+/h+逆向转运蛋白。本发明同时进行了同系物的同源性比对，结果显示出了高度同源性，获得了高度保守的氨基酸残基，其中带负电氨基酸残基包括d67、d127、e187、d223、e341；带正电氨基酸残基包括r71；极性氨基酸残基包括n146、q242、w328、y364。
实施例3.
pet-pm_mf原核表达载体的构建流程；如图2所示；
根据pm_mf基因序列，首先利用primer5软件设计seqidno.3：pm_mf-f；seqidno.4：pm_mf-r特异引物(如表1所示)，并在基因的5’和3’端分别引入ndei、bamhi两个酶切位点，然后进行pm_mf的扩增(如表2所示)，预期扩增中间序列片段长度约为1272bp(如图2-a所示)。
表1pm_mf基因表达载体构建引物序列
表2pcr扩增反应
将上述pcr产物末端加“a”后连入peasy-t3载体，然后化转到trans1-t1感受态细胞中，进行蓝白斑筛选出亚克隆。再用ndei、bamhi两种内切酶处理重组质粒peasy-pm_mf，并同时对表达载体pet19b做相同处理，对处理后的pet19b和pm_mf基因片段进行回收并连接，通过化转的发法将构建好的表达载体pet-pm_mf导入异源表达宿主e.coliknabc中。
图3是本发明实施例提供的pm_mf的pcr产物电泳图；
图中：m:markeriv。
图4是本发明实施例提供的重组质粒peasy-pm_mf蓝白斑验证电泳图；
图中：1:peasy-pm_mf连接转化的蓝斑质粒；2-3:pesay-pm_mf重组质粒(白斑)，m:markeriv；
图5是重组质粒pet-pm_mf的ndei、bamhi双酶切验证图；
图中：m:markeriv。
实施例4.
pm_mf的生理功能的鉴定：
为了鉴定pm_mf的生理功能，本发明以knabc/pet19为负对照，以原始克隆knabc/puc-pm29为正对照，鉴定不同盐碱胁迫条件下knabc/pet-pm_mf的生长情况，以上菌液培养时间均为24h，接菌量为1％。
以大肠杆菌(e.coli)knabc为宿主菌株的耐盐碱测试表明，在0.2mnacl、5mmlicl以及碱性ph胁迫条件下，pm_mf能够恢复大肠杆菌(e.coli)knabc的生长(如图6所示)，这表明pm_mf具有耐盐碱能力，同时可能具有na+/h+逆向转运蛋白活性。
实施例5.
pm_mf蛋白的细胞定位
本发明将含有pet-pm_mf和pet19b的knabc细胞，用法式细胞破碎机进行细胞破碎，利用超离法将knabc/pet-pm_mf和knabc/pet19b细胞的胞浆蛋白与膜蛋白分离开，再通过蛋白印迹杂交(westernblot，简称wb)的技术手段，分别对提取的细胞全蛋白(细胞破碎液)、胞浆蛋白(超离上清液)和膜蛋白(超离沉淀)进行检测。理论上，wb实验只能在制备的细胞全蛋白和膜蛋白样品中检测阳性信号，而胞浆蛋白样品(超离上清液)则检测不出目的条带。
如图7-b所示：与负对照相比(1,3,5泳道)，pm_mf蛋白只在细胞的全蛋白和膜蛋白样品中被检测出条带(2、6泳道)，而胞浆蛋白样品中没有(4泳道)，综上所述，pm_mf的确是位于在内膜上的膜蛋白，因此可以利用反转膜样品进行na+(li+，k+)/h+逆向转运蛋白活性检测。
实施例6.
pm_mf蛋白功能的鉴定
一、pm_mf蛋白na+(li+，k+)/h+逆向转运蛋白活性的鉴定
利用上述反转膜样品，以吖啶橙作为荧光指示剂，检测其na+(li+，k+)/h+逆向转运蛋白活性(如图8所示)。结果发现：在荧光猝灭的最低平衡点加入单一的单价阳离子溶液，knabc/pet-pm_mf制备的反转膜的荧光值升高(图8-a&b&c左侧)，而负对照knabc/pet19b在加入单价阳离子溶液后荧光值没有变化(图8-a&b&c右侧)。因此本发明认为pm_mf具有na+(li+、k+)/h+逆向转运蛋白活性。
二、pm_mf蛋白na+(li+，k+)/h+逆向转运蛋白活性的ph轮廓
钠/氢逆向转运蛋白对ph是具有一定的依赖性的，即其转运活性会随环境中ph的变化而改变。因此，本发明在不同ph(6.5-9.5)的反应体系中，检测pm_mf的蛋白活性。如图9所示，图中，
●-na+/h+逆向转运活性；■-li+/h+逆向转运活性；▲-k+/h+逆向转运活性。
在ph6.5-9.5的范围内，pm_mf对na+、li+、k+的转运活性会随ph的变化而改变，而且当反应体系中的ph为8.5时，pm_mf的钾离子转运活性最高，当反应体系中的ph为9.0时，钠离子和锂离子转运活性最高。
三、pm_mf对na+、li+、k+的亲和能力
由于pm_mf对na+、li+、k+三种离子转运能力是有差别的，即对底物偏好性不同。当k0.5值越小时，就表示对某一底物的转运偏好性越好。所以，本发明通过originpro8.6数据分析软件计算k0.5值(如图10)发现，当转运活性达到最大反应活性的一半时，na+、li+、k+的k0.5值分别是0.72±0.11mm(图11a)、0.98±0.11mm(图10b)、0.89±0.15mm(图10c)，换而言之，pm_mf对na+的偏好性最好，对三种离子的偏好由强到弱依次为：na+>k+>li+。
实施例7.
pm_mf与mf(majorfacilitator)家族已鉴定多药物外排泵的系统发育关系
为了进一步预测pm_mf具有的功能，本发明将pm_mf与mf(majorfacilitator)家族已鉴定多药物外排泵共同建立系统发育树(如图11所示)。系统发育分析结果显示pm_mf与大肠杆菌多药物外排泵(multi-drugtransporter)ec_mdth聚簇。阙值87％，表明pm_mf与ec_mdth系统发育关系较近。由此推测pm_mf还具有与ec_mdth相似的多药物外排泵功能。
实施例8.
大肠杆菌(e.coli)k12的acraacrb基因敲除
为了进一步检测pm_mf是否多药物外排蛋白，本发明选用野生型大肠杆菌e.colik12制备的多药物外排蛋白的基因突变株；选择敲除在大肠杆菌(e.coli)k12中基因编码多药物外排蛋白的基因acraacrb；选用pkd46(orir101，repa101ts，parab-gam-bet-exo，amp)为同源重组的协助质粒；pkd3(orirγ，cat，bla)携带的氯霉素抗性基因为pcr扩增模板，为重组转化体提供筛选标记，方法概述如下：
本发明设计了同源重组的引物(acrab-p1，acrab-p2，序列见表3)扩增氯霉素抗性基因cat，产物片段长1115bp，胶回收后用于电转化，电转化宿主为预先转化了pkd46的大肠杆菌(e.coli)k12，并以氯霉素抗性为筛选标记获得突变株e.colicm2(δacraacrb)。得到的重组子使用验证引物acrab-verify-f、acrab-verify-r直接菌液pcr扩增敲除后基因组，产物直接测序验证。
seqidno.5：acrab-p1；
seqidno.6：acrab-p2；
seqidno.7：acrab-verify-f；
seqidno.8：acrab-verify-r。
基因敲除后降低宿主菌株的抗药背景，显明基因本身的药物外排能力。
大肠杆菌(e.coli)cm2基因敲除突变株失去多药物外排能力，含有特定浓度药物的培养基中的无法生长。
表3acraacrb基因敲除相关引物
实施例9
pm_mf的多药物最小抑制浓度mic测试，如下表所示：
进而，本发明以e.colicm2为宿主进行了mic测试，结果表明：24h内，突变株e.colicm2以及cm2/puc18在lb基本培养基中eb的最小生长抑制浓度为100μg/ml，而cm2/puc-pm29在lb基本培养基中的最小生长抑制浓度增长到200μg/ml，与大肠杆菌(e.coli)dh5α类似；cm2以及cm2/puc18在lb基本培养基中诺氟沙星的最小生长抑制浓度为0.025μg/ml，而cm2/puc-pm29在lb基本培养基中的最小生长抑制浓度增长到0.05μg/ml。以上结果表明，pm_mf具有多药物外排能力,其中以eb和诺氟沙星为主要代表。
实施例10.
pm_mf的eb外排活性鉴定
eb可以直接被激发光激发而产生可监测波长的荧光，在加入葡萄糖恢复细胞代谢后，若eb可以被蛋白外排至胞外，则会造成胞外局部eb浓度过高，从而发生荧光猝灭，表现为荧光值下降。因此可以根据较比阴性对照荧光强度是否下降鉴定蛋白的eb外排活性。如图12所示，在加入葡萄糖后，较比于cm2/puc18，cm2/puc-pm29样品荧光值明显下降，这表明pm_mf具有显著的eb外排活性。
实施例11.
pm_mf的诺氟沙星外排活性鉴定
诺氟沙星可以直接被激发光激发而产生可监测波长的荧光，当细胞被诺氟沙星处理时，若细胞膜上存在有诺氟沙星外排活性的蛋白，则可以将细胞内积累的诺氟沙星外排到细胞外，此时检测细胞内的诺氟沙星的荧光值，则会低于阴性对照，即膜蛋白没有外排诺氟沙星能力的样品，由此可以实现蛋白诺氟沙星外排活性的检测。如图13所示，cm2/puc-pm29样品荧光值始终低于cm2/puc18样品荧光值，这表明pm_mf具有诺氟沙星外排活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>东北农业大学
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<212>核苷酸
<213>人工序列(artificialsequence)
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