本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原/真核双表达载体及其构建、应用所述原/真核双表达载体进行免筛选pcr重组克隆目的基因的方法以及获得的包含目的基因的重组载体。
背景技术：
pcr技术可以在短时间内在体外大量获取(扩增)目的基因，然后在后续基因工程操作中将目的基因克隆入载体中。将pcr产物克隆入载体的技术称为pcr克隆技术，目前主流的、并具有商业化试剂盒供应的pcr克隆技术主要有三种：1)t-a克隆技术，利用taq酶扩增的pcr产物3’突出的一个a与t载体3’突出的一个t通过粘性末端连接进行克隆，市场上有众多公司提供t-a克隆试剂盒；2)平末端pcr克隆技术，利用高保真酶taq扩增的平末端pcr产物与平末端载体通过平末端连接进行克隆，市场上有少数公司提供平末端pcr克隆试剂盒；3)重组酶介导的pcr克隆技术，其利用重组酶将pcr产物通过同源重组克隆入载体，市场上也有少数公司提供重组酶介导的pcr克隆试剂盒。
pcr克隆技术的主要目的之一是为了表达目的基因。目的基因表达技术可用于基因功能研究、药物开发(如重组表达胰岛素)和疫苗开发(如人用重组表达乙肝疫苗)等。目的基因表达技术根据目的基因表达所用宿主细胞的不同分为原核表达和真核表达，用于表达目的基因的载体称为表达载体，原核表达载体主要为质粒载体，真核表达载体主要有质粒载体和病毒载体，构建包含目的基因的重组表达载体是基因表达的基础。
现有克隆、表达目的基因的标准程序均至少需要两步：首先，需要通过pcr克隆技术(如常用的t-a克隆技术)将pcr扩增的目的基因片段克隆入克隆载体；然后，通过内切酶和连接酶将克隆载体上的目的基因亚克隆到表达载体，上述标准程序即使对于技术熟练的实验者，也需要耗时1周左右，且需要两种内切酶、连接酶和t-a克隆试剂盒，实验成本高；此外，现有的通用或商业化质粒表达载体分为原核表达载体和真核表达载体，二者不能通用，因此当一个目的基因既需要进行原核表达又需要进行真核表达时(如dna疫苗研究)，必须分别构建包含目的基因的原核表达载体和真核表达载体，时间成本和经济成本都较高。因此，设计一种既能在原核中表达又能在真核中表达的原/真核双表达载体，具有重要的应用价值。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种既能在原核中表达又能在真核中表达的原/真核双表达载体，尤其是一种具有免筛选pcr重组克隆功能的原/真核双表达载体。
本发明的第二个目的是提供一种利用本发明原/真核双表达载体进行免筛选pcr重组克隆目的基因的方法。
本发明的第三个目的是利用本发明提供的原/真核双表达载体和免筛选pcr重组克隆方法获得目的基因的重组载体。
为实现上述发明目的，提供以下技术方案：
一种原/真核双表达载体，其包含真核启动子及其表达调控元件，原核启动子及其表达调控原件，kozak序列、真核加尾信号序列和原核终止子，其特征在于：原核启动子及其核糖体结合位点(rbs)序列位于真核启动子序列与kozak序列之间，kozak序列位于原核启动子的rbs下游5-10bp的位置，原核终止子位于真核加尾信号序列下游。
根据本发明的原/真核双表达载体，其还包含自杀基因表达盒，所述自杀基因表达盒位于kozak序列的下游与真核加尾信号序列之间。
根据本发明的原/真核双表达载体，其还包含一段含6his-tag的22bp序列5’cagccaccatcatcaccaccac3’，所述6his-tag序列紧接kozak序列下游，位于kozak序列与自杀基因表达盒之间。
根据本发明所述的原/真核双表达载体，其是包含真核启动子及其表达调控元件，原核启动子及其表达调控原件，kozak序列、真核加尾信号序列和原核终止子的质粒。
根据本发明所述的原/真核双表达载体，其是包含真核启动子及其表达调控元件，原核启动子及其表达调控原件，kozak序列、真核加尾信号序列、原核终止子和自杀基因表达盒的质粒。
根据本发明所述的原/真核双表达载体，其是包含真核启动子及其表达调控元件，原核启动子及其表达调控原件，kozak序列、6his-tag序列、真核加尾信号序列、原核终止子和自杀基因表达盒的质粒。
根据本发明所述的原/真核双表达载体，其中所述的真核启动子为具有真核细胞广谱性的强启动子。
根据本发明所述的原/真核双表达载体，其中所述的真核启动子选自cmv启动子、sv40启动子、cag启动子、u6启动子、h1启动子。
根据本发明所述的原/真核双表达载体，其中所述的真核启动子为cmv启动子。
根据本发明所述的原/真核双表达载体，其中所述的原核启动子为具有原核细胞广谱性的强启动子。
根据本发明所述的原/真核双表达载体，其中所述的原核启动子选自t7启动子、lac启动子、tac启动子、trp启动子、pl启动子和pr启动子。
根据本发明所述的原/真核双表达载体，其中所述的原核启动子为t7启动子。
根据本发明所述的原/真核双表达载体，其中所述的自杀基因表达盒为对通用大肠杆菌克隆菌株具有强致死性的自杀基因表达盒。
根据本发明所述的原/真核双表达载体，其中所述的自杀基因表达盒选自噬菌体φx174的lysisgenee或ccdb基因表达盒。
在一些优选的实施方案中，本发明的原/真核双表达载体，其包含真核启动子及其表达调控元件，原核启动子及其表达调控原件，kozak序列、自杀基因表达盒、真核加尾信号序列和原核终止子，其特征在于：原核启动子及其核糖体结合位点(rbs)序列位于真核启动子序列与kozak序列之间，kozak序列位于原核启动子的rbs下游5-10bp的位置，自杀基因表达盒位于kozak序列的下游与真核加尾信号序列之间，原核终止子位于真核加尾信号序列下游。
在另一些优选的实施方案中，本发明的原/真核双表达载体，其包含真核启动子及其表达调控元件，原核启动子及其表达调控原件，kozak序列、6his-tag序列、自杀基因表达盒、真核加尾信号序列和原核终止子，其特征在于：原核启动子及其核糖体结合位点(rbs)序列位于真核启动子序列与kozak序列之间，kozak序列位于原核启动子的rbs下游5-10bp的位置，6his-tag序列紧接kozak序列下游，位于kozak序列的下游与自杀基因表达盒之间，自杀基因表达盒位于6his-tag序列与真核加尾信号序列之间，原核终止子位于真核加尾信号序列下游。
在一些具体的实施方案中，本发明的原/真核双表达载体，其是包含真核启动子及其表达调控元件，原核启动子及其表达调控原件，kozak序列、6his-tag序列、自杀基因表达盒、真核加尾信号序列和原核终止子的质粒，其特征在于：原核启动子及其核糖体结合位点(rbs)序列位于真核启动子序列与kozak序列之间，kozak序列位于原核启动子的rbs下游5-10bp的位置，6his-tag序列紧接kozak序列下游，位于kozak序列的下游与自杀基因表达盒之间，自杀基因表达盒位于6his-tag序列与真核加尾信号序列之间，原核终止子位于真核加尾信号序列下游，所述的真核启动子为cmv启动子，所述的原核启动子为t7启动子，所述的自杀基因表达盒选自噬菌体φx174的lysisgenee或ccdb基因表达盒。
本发明的原/真核双表达载体由于具备兼容的原核表达调控元件和真核表达调控元件，因此克隆入本发明载体的目的基因既能进行原核表达又能进行真核表达。本发明载体在kozak序列与真核加尾信号序列之间含有一个高效自杀基因表达盒，因此采用本发明提供的pcr重组克隆技术克隆目的基因时，目的基因将插入本发明提供的原/真核双表达载体的kozak序列与真核加尾信号序列之间并替换原有的高效自杀基因表达盒，从而自动筛选出阳性重组载体克隆。因此，应用本发明载体仅需一对pcr引物和两次pcr反应即可获得目的基因的原/真核双表达重组载体，无需使用内切酶、连接酶和其它dna修饰酶，极大地节约时间成本和经济成本。
本发明的原/真核双表达载体通过在kozak序列的下游与真核加尾信号序列之间引入自杀基因表达盒，不仅能实现原核/真核双表达，而且可以实现免筛选pcr重组克隆的功能，其用于免筛选pcr重组克隆目的基因的方法是：
1)在目的基因上、下游pcr引物的5’端分别添加一段与自杀基因表达盒两端序列同源的序列，pcr扩增目的基因，纯化；
2)以步骤1)获得的pcr扩增的目的基因产物为重组pcr反应的引物，以本发明的原/真核双表达载体为模板进行重组pcr反应；反应中目的基因序列通过步骤1)加入的同源序列与本发明原/真核双表达载体进行重组，插入本发明原/真核双表达载体并替换两个同源序列之间的序列，也就是自杀基因表达盒序列，获得克隆了目的基因的重组原/真核双表达载体；
根据本发明的原/真核双表达载体用于免筛选pcr重组克隆目的基因的方法，还包含步骤3)：将步骤2)获得的克隆了目的基因的重组原/真核双表达载体转化至大肠杆菌克隆菌株或表达菌株的感受态细胞。
根据本发明的原/真核双表达载体用于免筛选pcr重组克隆目的基因的方法，步骤1)中所述的两段同源序列在20nt以上且其tm值在60-65℃之间。根据本发明的原/真核双表达载体用于免筛选pcr重组克隆目的基因的方法，步骤2)所述重组pcr反应为18-20个循环。
当用上述重组pcr反应产物进行转化大肠杆菌克隆菌株时时，作为重组pcr反应模板的空质粒，也就是本发明原/真核双表达载体的转化子会因自杀基因的表达而死亡，无法生成菌落克隆，而插入了目的基因序列并替换自杀基因表达盒的重组载体的转化子则正常长成菌落克隆，从而使得本发明载体具备了免筛选pcr重组克隆功能。
在本发明的一个实施例中，以通用的真核表达质粒载体pcdna3.1+为基础，构建了pomni，如图1所示。
本领域技术人员可以利用上述原/真双表达载体构建各种含有外源目的基因的重组载体，用于基因的功能研究及各种应用，因此，本发明还包括利用本发明原/真核双表达载体进行pcr重组构建的包含目的基因的重组载体，含有所述重组载体的宿主细胞，如原核细胞、真核细胞，以及将本发明的重组载体转化或转染至宿主细胞，在合适条件下培养所述宿主细胞以使细胞生长和/或增值并表达目的基因，获得基因表达产物的方法。
术语解释
本发明所述的kozak序列是指符合kozak序列规则的碱基序列，所述的kozak序列规则是指第一个atg侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律，如将第一个atg中的碱基a，t，g分布标为1，2，3，则满足的kozak序列规则为：1)第4位的偏好碱基为g；2)atg的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基t。
本发明所述的“同源序列”是指一段完全相同或高度近似的dna序列。
本发明所述的“目的基因”也叫靶基因，包括所有需要研究的基因。
本发明所述的“通用大肠杆菌克隆菌株”包括但不限于dh5a，jm109，xl1-blue，top10等大肠杆菌克隆菌株。
附图说明
图1为按实施例1构建的pomni载体的物理图谱。3710bp为pomni载体的大小，pcmv为真核表达启动子，t7为原核表达启动子，kozak为真核表达起始序列，其中包含与原核表达相兼容的起始密码子atg，suicidegene为自杀基因表达盒，自杀基因为噬菌体φx174的lysisgenee，由pl启动子表达，bghpa为真核表达加尾信号序列，pucori为质粒复制起始区序列，ampr为氨苄抗性基因。
pomni载体中目的基因克隆区域附近序列，可用以下的示意结构表示：
其中，pcmv为真核表达启动子，pt7为原核表达启动子，lacoperator为t7启动子的调控序列，rbs为t7启动子的核糖体结合位点，kozak为pcmv的真核表达起始序列，其中的起始密码子atg为原/真核表达共用，6his-tag为6组氨酸标签，克隆入本载体的目的基因n端将与其融合表达，以方便表达产物的检测和纯化，suicidegene为自杀基因表达盒，自杀基因为噬菌体φx174的lysisgenee，bghpoly(a)为真核表达的加尾信号序列，t7terminator为原核表达终止子，两段具有阴影背景的序列为上、下游同源重组区序列，两端含有这两段同源序列目的基因pcr扩增产物将在重组pcr反应中重组入本载体这两段序列之间并替换其间的自杀基因表达盒。
图2为实施例2中应用实施例1载体pomni采用所述pcr重组克隆技术克隆绿色荧光蛋白基因egfp转化入bl21菌株后在紫外照射下的转化子菌落照片。
图3为实施实例2中应用实施例1载体pomni采用所述pcr重组克隆技术克隆绿色荧光蛋白基因egfp后转染hela真核细胞的激光共聚焦图像，转染成功的hela细胞呈现出强烈的绿色荧光。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1：具有免筛选pcr重组克隆功能的原/真核双表达载体pomni的构建
以通用的非专利真核表达质粒载体pcdna3.1+为出发载体，按如下步骤和方法构建pomni：
1自杀基因表达载体plys的构建：
按常规分子克隆技术，将pcr扩增的噬菌体φx174的lysisgenee编码序列(273bp)通过ecori和psti内切酶位点将lysisgenee定向克隆入通用表达载体pbbv220(该表达载体为温控表达载体，克隆的基因在42℃时才能启动表达)，所得重组表达载体为plys。含plys的dh5a菌株在28℃培养时能正常生长，而在42℃培养时不能生长，证明plys中的自杀基因lysisgenee能在大肠杆菌中正确表达并对宿主细胞具有强致死性。
2中间载体pc3.1的构建：
采用大连宝生物公司的dna突变试剂盒mutanbestkit，并按其说明书操作，对pcdna3.1+进行删除突变改造，所用引物为5'ctcggtcgttcggctgcg3'、5'ggcgcgtggggataccc3'，该突变删除了pcdna3.1+中的sv40和neomycingene序列，使得载体的大小由5428bp减少到3210bp，这一突变的目的是提高目标载体克隆大片段外源基因的能力，所获得的中间载体名为pc3.1。
3中间载体pc3.2的构建：
采用大连宝生物的dna突变试剂盒mutanbestkit，并按其说明书操作，对pc3.1进行序列插入突变改造，所用引物为5’gctagcggaatgtagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcatcatcatcatcacgtttaaacttaagcttggtaccgagc3’和5'cagcttgggtctccctatagtgagt3'，上游引物下划线部分为本发明设计并引入的序列，其中包含了t7启动子的lacoperator序列；t7启动子的核糖体结合位点rbs；包含原、真核表达共用起始密码子的kozak序列和6his-tag(详见图2)，所获得的中间质粒名为pc3.2。
4中间载体pc3.3的构建：
采用大连宝生物的dna突变试剂盒mutanbestkit，并按其说明书操作，对pc3.2进行序列插入突变改造，所用引物为5'ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgttcgaaggcggtaatacggttatccacag3'和5'agccatagagcccaccgca3'，上游引物下划线部分为引入的t7终止子序列，引入的位置在pc3.2中真核表达的加尾信号bghpoly(a)序列下游，所获得的中间质粒名为pc3.3。
5本载体pomni的构建：
采用重组pcr克隆技术对中间质粒pc3.3进行插入突变改造，所用引物为5'gggcagcagccaccatcatcaccaccacacctaccaaacaatgcccc3'和5'gcaactagaaggcacagtcgaggcacagaagcttggctgcagtac3'，两个引物5’端下划线序列分别与pc3.3中包含6his-tag的一段序列及bghpoly(a)序列上游一段序列同源。用该对引物以第1步构建的自杀基因表达载体plys为模板，扩增自杀基因lysisgenee表达盒(包含其上游的启动子和lysisgenee)，扩增产物长609bp；以250ng割胶回收的扩增产物为引物，以5ngpc3.3为模板，采用高保真taq酶进行20个循环的重组pcr反应(95℃30sec.,60℃45sec.,72℃3min.)；用10ul重组pcr反应产物转化能对自杀基因lysisgenee的表达进行反式调控的大肠杆菌菌株(如1210)，28℃复苏后涂板过夜培养；次日随机挑取数个单菌落接种于amp-lb液体培养基，28℃震荡培养1小时后取出部分菌液于42℃震荡过夜培养，在28℃正常生长但在42℃不能生长的克隆即为含有自杀基因表达盒的重组克隆，所得质粒即为本发明载体pomni。
实施例2：具有免筛选pcr重组克隆功能的原/真核双表达载体pomni的应用验证
以绿色荧光蛋白egfp基因为例，验证实施实例1中构建的免筛选原/真核双表达质粒载体克隆并表达目的基因的能力。
1)以任何含有egfp基因完整编码序列的dna为模板，用引物5'cagccaccatcatcaccaccacatggccacaaccatggtgag3'和5'tgcacgtaatttttgacgcacgttacttgtacagctcgtccatgc3'(两个引物5’端下划线所示为引入的分别与pomni中kozak序列下游22bp和bghpoly(a)上游22bp同源的序列)和高保真taq酶扩egfp基因全序列，产物长约770bp。
2)以250ng割胶回收的扩增产物为引物，以5ngpomni为模板，采用高保真taq酶进行20个循环的重组pcr反应(95℃30sec.,60℃45sec.,72℃3min.)。
3)用10ul未经纯化的重组pcr反应产物直接转化表达菌株bl21，将全部转化产物涂布于含2mmiptg的amp-lb平板，37℃过夜培养，长出约140个菌落克隆，所有菌落在长波紫外光下均呈现强烈的绿色荧光(见图2)，克隆阳性率为100％。
4)随机挑取一个步骤3)中获得的pomni-egfp克隆接种amp-lb，过夜震荡培养后按常规方法提取重组表达质粒pomni-egfp；采用高效转染试剂transfectin(bio-rad,usa)并按厂家提供的操作规程用500ng纯化的pomni-egfp转染hela细胞，培养24小时后经pbs洗涤三次，4％的多聚甲醛固定15分钟，pbs洗涤三次，然后用vectashieldmountingmediumcontainingdapi(vector，usa)上样，用激光共聚焦显微镜confocalmicroscope(zeisslsm780)照相观察，被转染的细胞呈现强烈的绿色荧光(见图3)。
本实施实例结果表明：(1)应用本发明载体pomni采用所述快捷的pcr重组克隆技术能成功克隆外源目的基因，而且克隆阳性率为100％，具备免筛选的效果；(2)应用本载体pomni克隆的外源基因可以在大肠杆菌获得正确表达；(3)应用本载体pomni克隆的外源基因可以在真核细胞中得到正确表达。