本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，涉及一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白flic。
背景技术：
迟缓爱德华菌(edwardsiellatarda，e.tarda)在水产养殖上危害严重，鱼类感染该菌后死亡率高、易反复、免疫力低下，传统抗生素和化学药物疗效不确切，急需开发新型、高效、安全的防治方法。疫苗使用在畜禽生产上的巨大成功给水产养殖提供诸多借鉴，多种水产疫苗被开发应用，展现良好前景，遗憾的是，目前尚无商品化疫苗用于防控迟缓爱德华菌感染。除此之外，迟缓爱德华菌可以引起人的多种类型感染，近年来人通过食源途径感染的报道不断增多，揭示了本菌的公共卫生学价值。
鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要结构蛋白之一，在细菌运动、粘附和侵染宿主过程中发挥重要作用，是细菌的重要毒力因子。研究发现，细菌鞭毛蛋白能够活化宿主免疫反应，起到疫苗佐剂的作用，进一步研究发现，鞭毛蛋白可以通过tlr5通路诱导炎症反应发生并促使树突状细胞成熟。该蛋白无论是与抗原混合还是融合表达，均表现出良好的免疫效果。除此之外，鞭毛蛋白本身具有较强的免疫原性，具有一定的免疫保护力。flic是构成鞭毛丝的主要蛋白成分，是目前鞭毛研究的焦点蛋白，其生物学功能得到一定程度解析。本发明通过原核表达方法获得大量纯化的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白flic的重组蛋白，并进一步利用动物实验评估该重组蛋白的免疫原性和对于模型动物的保护力，表明迟缓爱德华菌鞭毛蛋白flic能够用于研制亚单位疫苗。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白flic，具体通过原核表达方法，获得迟缓爱德华菌鞭毛蛋白flic重组蛋白，从而进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白flic在亚单位疫苗中的应用。
进一步，所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白flic的制备方法，具体步骤如下：
(1)以迟缓爱德华菌et-cl基因组序列为模板，p1和p2为引物，pcr扩增flic基因；pcr扩增的反应体系共20μl，其中2×taqpcrmix10μl，模板1μl，引物p1(20μm)和p2(20μm)各1μl，ddh2o7μl；pcr扩增的反应程序为94℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃60s，25个循环，72℃10min；其中引物p1和p2为：
p1：5’-atggcacaagtaattaatacc-3’；seqidno：1；
p2：5’-acgcagcagagacaggacg-3’；seqidno：2；
(2)构建pmd18-t-flic载体，对flic基因进行序列测定；
(3)测序结果正确的菌株扩大培养，提取质粒，以pmd18-t-flic为模板，p3和p4为引物，pcr扩增flic基因，获得纯化目的基因；pcr扩增的反应体系共20μl，其中2×taqpcrmix10μl，引物p3(20μm)和p4(20μm)各1μl，模板1μl，ddh2o7μl；pcr扩增的反应程序为94℃预变性5min，94℃30s，52℃30s，72℃60s，30个循环，72℃10min；其中引物p3和p4为：
p3：5’-cgggatccatggcacaagtaattaatacc-3’，bamhⅰ；seqidno：3；
p4：5’-gcgtcgacacgcagcagagacaggacg-3’，salⅰ；seqidno：4；
其中，下划线部分为酶切位点；
(4)利用限制性内切酶bamhⅰ和salⅰ对纯化目的基因和pet-32a载体分别进行双酶切，构建重组表达载体pet-32a-flic；
(5)将重组表达载体转化dh5α感受态细胞，挑取单克隆进行pcr和双酶切验证，获得阳性克隆，提取质粒，测序；
(6)将重组表达载体pet-32a-flic和空载体pet-32a分别转化bl21工程菌，进行重组蛋白的原核表达，具体步骤如下：分别将5μl重组载体pet-32a-flic和5μl空载体pet-32a加入到100μlbl21工程菌中；冰浴30min，42℃热击90s，冰浴5min；加入1ml液体lb培养基，37℃复壮1h后，各取5μl涂布于氨苄终浓度为100μg/ml的固体lb平板，倒置，37℃培养过夜；
(7)利用sds-page分析重组蛋白表达情况；
(8)以his-mab为一抗、hrp-igg为二抗，对重组蛋白进行westernblot验证。
本发明的有益效果是：本发明利用原核表达方法获得大量纯化的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白flic的重组蛋白，并进一步利用动物实验评估该重组蛋白的免疫原性和对于模型动物的保护力，从而进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点，同时，迟缓爱德华菌flic蛋白还具有佐剂特性。
附图说明：
图1为本发明实施例2中flic基因的pcr扩增；
m.dl2000marker；1.flic基因扩增；
图2为本发明实施例4中sds-page分析重组蛋白在大肠杆菌中的表达；
m.蛋白marker；1，2.pet-32a-flic/bl21菌体裂解物；3.pet-32a/bl21空载对照；
图3为本发明实施例4中westernblot鉴定重组蛋白在大肠杆菌中的表达；
1.蛋白marker；2.pet-32a-flic/bl21菌体裂解物；
图4为本发明实施例5中重组蛋白的可溶性分析；
m.蛋白marker；1.pet-32a-flic/bl21菌体裂解物；2.裂解物上清；3.裂解物沉淀；
图5为本发明实施例5中纯化的目的蛋白的sds-page；
m.蛋白marker；1.未纯化重组蛋白；2.纯化重组蛋白；
图6为本发明实施例6中westernblot分析阳性血清对his-flic蛋白的识别；
1.重组蛋白；2.阴性对照(his-σc呼肠孤病毒衣壳蛋白)；
图7为本发明实施例6中his-flic蛋白对小鼠的免疫保护效果；
图8为本发明实施例7中不同佐剂免疫下bsa抗体效价监测；
图9为本发明实施例7中his-flic免疫小鼠后，抗flic抗体效价监测。
具体实施方式
以下结合附图对本发明做进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1迟缓爱德华菌flic基因序列分析
根据genbank上登录的e.tarda参考菌株et-1基因组序列(cp001135.1)flic基因设计引物，引物p1和p2为：
p1：5’-atggcacaagtaattaatacc-3’；seqidno：1；
p2：5’-acgcagcagagacaggacg-3’；seqidno：2；
利用omega基因组提取试剂盒提取et-cl基因组，并以其为模板进行pcr扩增；pcr扩增的反应体系为2×taqpcrmix10μl，引物p1(20μm)和p2(20μm)各1μl，模板1μl，ddh2o7μl，共20μl；pcr扩增的反应程序为94℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃60s，25个循环，72℃10min；回收flic基因片段，连接pmd18-t载体，连接体系如下：目的基因4.5μl，pmd18-tvector0.5μl，2×connectbuffer5μl，共10μl，16℃连接过夜。连接产物转化入dh5α感受态细胞；挑取单菌落进行pcr检测，阳性菌落送由北京生工测序。
参照genbank中e.tarda参考菌株(e.tardaet-1，e.tardaetw41，e.tardafl6-60)及其它肠杆菌科其他成员(s.marcescensstr.smunam836，klebsiellaaerogenesstr.ar_0009，s.typhimuriumstr.lt2，e.colistr.k-12，s.entericastr.sgb23，kosakoniacowaniistr.esp_z)菌株flic基因序列，分析flic基因保守性，结果发现，爱德华菌属成员间flic基因高度保守。
实施例2迟缓爱德华菌flic基因扩增
将实施例1测序结果正确的pmd18-t-flic菌株扩大培养，提取质粒，并以其为模板，p3和p4为引物，pcr扩增flic基因，反应体系共20μl，其中2×taqpcrmix10μl，引物p3(20μm)和p4(20μm)各1μl，模板1μl，ddh2o7μl；反应程序为94℃预变性5min，94℃30s，52℃30s，72℃60s，30个循环，72℃10min；获得大小为1248bp的目的片段(如图1所示)，纯化目的基因，将目的基因与原核表达载体pet-32a连接构建重组表达载体；其中引物p3和p4为：
p3：5’-cgggatccatggcacaagtaattaatacc-3’，bamhⅰ；seqidno：3；
p4：5’-gcgtcgacacgcagcagagacaggacg-3’，salⅰ；seqidno：4；
其中，下划线部分为酶切位点。
实施例3pet-32a-flic重组表达载体的构建
利用bamhⅰ和salⅰ分别对纯化目的基因和pet-32a载体进行双酶切，酶切体系：目的基因/pet-32a25μl，bamhⅰ和salⅰ各1μl，10×greenbuffer3μl。回收后按照3:1的比例22℃连接30min，将全部连接产物转入100μldh5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热浴90s，冰浴5min，加入1mllb液体培养基，37℃复壮1h，涂布于含有氨苄终浓度为100μg/ml的固体lb平板，倒置于37℃培养过夜。次日，挑取单克隆用p3、p4引物进行pcr验证。阳性克隆提取质粒进行双酶切验证和序列测定，无突变和移码即得到重组表达载体pet-32a-flic。
实施例4重组蛋白的原核表达
将重组载体pet-32a-flic和空载体分别转化入bl21工程菌中，冰浴30min，42℃热浴90s，冰浴5min；加入1mllb液体培养基，37℃复壮1h，涂布于含有氨苄终浓度为100μg/ml的平板，倒置于37℃培养过夜。挑取单菌落接种于含有100μg/l氨苄青霉素的液体lb培养基中，37℃震荡培养至对数期，加入iptg至终浓度为0.5mmol/l，诱导表达5h。离心收集菌体沉淀，pbs缓冲液洗涤3次；加入蛋白上样缓冲液，充分混匀后煮沸10min，离心，收集上清液即为蛋白样品，利用sds-page进行分析，上样后，电压调至80v，待样品通过分离胶与浓缩胶分隔线后，将电压调至120v，至电泳结束，取出胶片考马斯亮蓝染色1min，用蒸馏水多次煮沸脱色；结果如图2所示，在60kd处诱导表达出目的蛋白；以his-mab为一抗，hrp-igg为二抗，分别用5％脱脂奶粉按1:1000和1:5000稀释，用westernblot方法进一步确认目的蛋白表达，具体步骤如下：sds-pag电泳后，取出胶片，利用转膜仪将蛋白转至nc膜上，80v转膜1h；转膜结束后，取出nc膜，pbst洗涤3次，5min/次；5％脱脂奶粉室温封闭1h，pbst洗涤3次，5min/次；用5％脱脂奶粉按1:1000稀释his-mab作为一抗，室温孵育1h；pbst洗涤3次，5min/次；5％脱脂奶粉按1:5000稀释hrp-igg作为二抗，室温孵育30min；pbst洗涤3次，5min/次；加入显影液，避光5min，最后发光显影；结果如图3所示，在60kd处出现目的蛋白条带，证明his-flic重组蛋白表达成功。
实施例5目的蛋白的可溶性分析及纯化
将表达目的蛋白菌株按照上述条件进行扩大培养，离心收集菌体；利用超声破碎仪破碎菌体，离心分离沉淀、上清，将细菌裂解物、上清以及沉淀分别制备蛋白样品，进行sds-page，结果如图4所示，均在60kd处出现蛋白条带。
取诱导表达上清，利用ni2+亲和层析方法进行纯化，结果如图5所示，在60kd处纯化出his-flic，利用bca蛋白浓度检测试剂盒测定纯化蛋白浓度，结果测定蛋白浓度为0.36mg/ml。
实施例6重组flic蛋白免疫保护实验
制备e.tarda感染小鼠阳性血清，以阳性血清(1：500)为一抗，hrp-igg(1:5000)为二抗，利用westernblot验证阳性血清对重组蛋白的识别，结果如图6所示，e.tarda感染小鼠阳性血清可以特异性识别重组his-flic蛋白。
将40只健康昆明鼠随机分成两组，对照组和免疫组，每组20只。以纯化的his-flic蛋白作为免疫原，免疫组小鼠第一次免疫，肌肉注射30μg重组flic蛋白(弗氏完全佐剂乳化)，间隔2周后，第二次免疫(弗氏不完全佐剂乳化)，30d后以弗氏不完全佐剂乳化蛋白加强免疫；对照组小鼠三次免疫均注射等体积的pbs(加对应佐剂)。第48d对两组小鼠腹腔接种迟缓爱德华菌et-cl菌液，剂量为5ld50(2.0×107cfu)，感染后观察4d，统计死亡数量。结果显示，对照组小鼠全部死亡，免疫组小鼠死亡6只，其余小鼠在经历短暂精神沉郁、不食后逐渐恢复健康。结果如图7所示，表明his-flic重组蛋白免疫小鼠后具有一定保护力，保护率为70％。
实施例7迟缓爱德华菌flic蛋白作为佐剂效果评估
将40只健康昆明鼠随机分成4组，每组10只。以购买的牛血清白蛋白bsa作为评估蛋白，设置bsa免疫组、bsa+flic蛋白免疫组以及bsa+弗氏佐剂免疫组，同时设立pbs组作为对照。免疫途径为皮下注射，免疫分两次进行，第一次免疫后间隔10d进行第二次免疫，蛋白免疫剂量均为100μg/只。bsa蛋白油乳剂免疫组第一次免疫加完全弗氏佐剂，第二次免疫加不完全弗氏佐剂进行免疫，空白对照组以pbs替代。
各免疫组在免疫后第0、10、20和30天尾尖采血，并分离血清，以纯化的重组flic蛋白作为包被抗原，利用间接elisa方法检测小鼠血清中抗体的效价，以阴性血清od450平均值加3倍标准差作为阴阳性判定标准，计算出临界值为0.176，当待检血清od值大于临界值时判定为阳性；当待检血清od值小于临界值时判定为阴性。
将不同佐剂+bsa免疫小鼠4次采集的血清按1∶100进行稀释，以500ng/mlbsa蛋白包被酶标板，以羊抗鼠igg-hrp为二抗进行间接elisa检测，结果如图8所示。结果表明：单纯bsa免疫小鼠几乎不产生特异性抗体，而弗氏佐剂或flic混合免疫能够刺激机体产生较高的特异性抗体，证明了迟缓爱德华菌flic蛋白的佐剂特性。
将flic免疫小鼠4次采集的血清按1∶100进行稀释，以500ng/ml重组蛋白包被酶标板，以羊抗鼠igg-hrp为二抗进行间接elisa检测，结果如图9所示。结果表明：重组蛋白免疫小鼠能够产生较高水平特异性抗体，在加强免疫后达到最高水平。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>河北科技师范学院
<120>一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白flic
<160>4
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<213>artificial
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