本发明涉及一种分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术：
赛庚啶(cyproheptadine，chp)是一种抗组胺药物，也是一种h1受体拮抗药，同时具有抗5-羟色胺的作用，可抑制下丘脑的饱觉中枢而刺激食欲、增加体重、促进生长，因此，许多不良厂家在动物饲料和动物饮水中非法添加这种药物以迅速增加动物体重，获得非法暴利。
然而，这种非法行为会造成动物体内药物残留，赛庚啶大量堆积于动物体内，人食用这些动物后，这些残留的药物转而堆积在人的体内，由于赛庚啶会导致嗜睡、头昏、乏力、恶心以及多食、体重增加，甚至是过敏性休克、溶血性贫血、精神错乱、共济失调、支气管分泌稠厚、心动过速、尿潴留等不良反应，严重危害人体的健康。因此，我们急需找到一种特异性强、灵敏度高的检测食品中赛庚啶残留的方法。
目前，检测赛庚啶的方法主要是液相色谱法(hplc)，液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)，酶联免疫吸附法、免疫亲和色谱柱以及电化学传感器等，但是这些方法均存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测。因此建立一种快速简便的检测方法具有重要意义。
酶联免疫法(elisa)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测赛庚啶的前提是得到对赛庚啶具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对赛庚啶具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。
发明人尝试通过杂交瘤细胞制备赛庚啶单克隆抗体，但在制备能分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备赛庚啶半抗原和赛庚啶完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；制备出的杂交瘤细胞株是否能分泌出赛庚啶单克隆抗体，还需要进一步验证；分泌出的赛庚啶单克隆抗体特异性、灵敏度如何，也需要进一步验证。
技术实现要素：
本发明的目的是获得一种能分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株及此细胞株的制备方法，采用本发明获得的能分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌的赛庚啶单克隆抗体对赛庚啶具有较好的特异性和检测灵敏度(ic50值为0.370ng/ml)可以用于建立赛庚啶的免疫学检测方法，检测食品中赛庚啶的残留。
本发明提供了一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2017年9月5号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.14697。
本发明提供了一种分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤一：制备赛庚啶半抗原，通过赛庚啶半抗原合成赛庚啶完全抗原，将赛庚啶完全抗原与等量油剂混合，再加入乳化剂，乳化后得到不完全弗氏佐剂，在不完全弗氏佐剂中加入分枝杆菌得到完全弗氏佐剂；所述油剂为石蜡油或植物油；所述乳化剂为羊毛脂或叶吐温80；所述分枝杆菌包含死卡苗；
步骤二：将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入balb/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
步骤三：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接elisa检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中赛庚啶抗体含量高的获得免疫的小鼠；
步骤四：将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用不含弗氏佐剂的赛庚啶完全抗原进行；
步骤五：通过聚乙二醇(peg1500)法将进行冲击免疫后的balb/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过hat培养基培养，利用间接elisa检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选出获得能分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
步骤六：将获得的能分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株通过elisa法测定其分泌的抗体的灵敏度和特异性。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤一中赛庚啶半抗原的分子式如下：
在本发明的一种实施方式中，所述步骤二、步骤四中，首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲击免疫之间间隔18天。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤二、步骤四中的免疫过程，包含1次首次免疫、3次加强免疫和1次冲击免疫；
在本发明的一种实施方式中，所述步骤三中，采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤五中，细胞融合是在冲击免疫结束3天后进行。
本发明提供了一种分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备赛庚啶单克隆抗体方面的应用。
本发明提供了一种赛庚啶半抗原，其特征在于，所述赛庚啶半抗原的分子式如下：
本发明提供了一种赛庚啶半抗原的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤一：向化合物1的甲苯溶液中滴加氯甲酸乙酯并搅拌，得到混合物；
步骤二：将步骤一中所得的混合物冷却，加入hcl，并用乙酸乙酯萃取，将萃取出的有机层干燥，浓缩，得到化合物2；
步骤三：向化合物2的乙醇混合物中逐滴加入氢氧化钾水溶液并搅拌，得到混合物；
步骤四：将步骤三中所得的混合物浓缩，然后用乙酸乙酯萃取，将萃取出的有机层干燥，浓缩，得到化合物3；
步骤五：向溶于含有3-氯丙酸的四氢呋喃thf溶液中的化合物3滴加三乙胺并在n2下搅拌，得到混合物；
步骤六：将步骤五所得的混合物浓缩，然后用用乙酸乙酯萃取，将萃取出的有机层干燥，浓缩，得到赛庚啶半抗原粗产物；
步骤七：将粗产物纯化，得到赛庚啶半抗原；
所述化合物1的分子式如下：
所述化合物2的分子式如下：
所述化合物3的分子式如下：
所述赛庚啶半抗原的分子式如下：
在本发明的一种实施方式中，所述步骤一为向5g浓度为17.4mmol的化合物1中加入50ml的甲苯溶液，然后在滴加3g浓度为34.8mmol的甲酸乙酯，并在120℃下搅拌过夜。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤二为将混合物冷却至室温，加hcl并用50ml乙酸乙酯萃取3次，有机层用无水na2so4干燥，真空浓缩，得到4g化合物2。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤三为向4g浓度为11.6mmol的化合物2加64ml乙醇，混合物中逐滴加入15当量氢氧化钾水溶液，氢氧化钾水溶液是由10.3g氢氧化钾溶于16mlh2o配成浓度为174mmol的溶液，并在30℃下搅拌过夜。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤四为将混合物真空浓缩，然后用50ml乙酸乙酯萃取3次，有机层用无水na2so4干燥，真空浓缩，得到2.5g化合物3。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤五为2.5g浓度为9.2mmol化合物3溶于含有1g浓度为9.2mmol的3-氯丙酸的30ml四氢呋喃thf溶液中的，再滴加1g浓度为9.2mmol的三乙胺，并在n2下于60℃搅拌过夜，得到混合物。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤六为将混合物真空浓缩，然后用30ml乙酸乙酯萃取3次，有机层用无水na2so4干燥，真空浓缩，得到粗产物。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤七为通过硅胶色谱(dcm/meoh＝20:1)纯化，得到400mg半抗原。
本发明提供了一种赛庚啶半抗原在制备赛庚啶完全抗原、制备赛庚啶抗体以及制备分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株方面的应用。
本发明提供了一种一种赛庚啶完全抗原的制备方法，其特征在于，取赛庚啶半抗原于棕色小瓶中，加入mes缓冲溶液溶解，将edc和nhs加入到半抗原反应瓶中，搅拌，得到活化液，称取钥孔血蓝蛋白klh溶解于cb溶液中，将活化液加入到蛋白质溶液中，调节ph，进行反应，分离完全抗原和未偶联的小分子，鉴定后获得赛庚啶完全抗原；
所述赛庚啶半抗原的分子式如下：
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法具体为：称取5mg赛庚啶半抗原于棕色小瓶中，加入1mlph4.7，0.1m的mes缓冲溶液溶解，将10mgedc和6mgnhs固体加入到半抗原反应瓶中，搅拌6-8h，得到活化液，称取钥孔血蓝蛋白klh溶解于cb溶液中，将活化液加入到蛋白质溶液中，用1mnaoh调节ph至9.0，室温反应过夜，整个过程避光进行，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子，并通过紫外方法鉴定，获得赛庚啶完全抗原；
所述赛庚啶半抗原的分子式如下：
本发明提供了一种赛庚啶完全抗原的应用，其特征在于，所述赛庚啶完全抗原可用于制备赛庚啶单克隆抗体。
本发明提供了一种赛庚啶单克隆抗体，其特征在于，所述抗体是从保藏编号为cgmccno.14697的杂交瘤细胞株获得的。
本发明提供了一种赛庚啶单克隆抗体的制备方法，此方法具体为，取balb/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存。
在本发明的一种实施方式中，赛庚啶单克隆抗体的制备方法具体为，取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml，7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
本发明提供了一种赛庚啶单克隆抗体的应用，其特征在于，所述赛庚啶单克隆抗体用于特异性识别赛庚啶。
本发明提供了应用上述分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备得到的检测试剂盒。
本发明提供了应用上述赛庚啶半抗原制备得到的检测试剂盒。
本发明提供了应用上述赛庚啶单克隆抗体制备得到的检测试剂盒。
有益效果：
(1)本发明获得的赛庚啶单克隆抗体，对赛庚啶有较好的检测灵敏度和特异性(ic50值为0.370ng/ml)。
(2)本发明提供了一种全新的赛庚啶完全抗原合成思路。
(3)本发明获得的赛庚啶单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测。
生物材料保藏
一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为：单克隆细胞株，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.14697，保藏日期为：2017年9月5日。
附图说明
图1为本发明赛庚啶半抗原的合成过程。
图2为本发明赛庚啶完全抗原的紫外表征图。
图3为本发明单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：赛庚啶半抗原的合成
向5g浓度为17.4mmol的化合物1中加入50ml的甲苯溶液，然后在滴加3g浓度为34.8mmol的甲酸乙酯，并在120℃下搅拌过夜。将混合物冷却至室温，加hcl并用50ml乙酸乙酯萃取3次，有机层用无水na2so4干燥，真空浓缩，得到4g化合物2。向4g浓度为11.6mmol的化合物2加64ml乙醇，混合物中逐滴加入15当量氢氧化钾水溶液，氢氧化钾水溶液是由10.3g氢氧化钾溶于16mlh2o配成浓度为174mmol的溶液，并在30℃下搅拌过夜。将混合物真空浓缩，然后用50ml乙酸乙酯萃取3次，有机层用无水na2so4干燥，真空浓缩，得到2.5g化合物3。2.5g浓度为9.2mmol化合物3溶于含有1g浓度为9.2mmol的3-氯丙酸的30ml四氢呋喃thf溶液中的，再滴加1g浓度为9.2mmol的三乙胺，并在n2下于60℃搅拌过夜，得到混合物。将混合物真空浓缩，然后用30ml乙酸乙酯萃取3次，有机层用无水na2so4干燥，真空浓缩，得到粗产物。通过硅胶色谱(dcm/meoh＝20:1)纯化，得到400mg半抗原(本发明赛庚啶半抗原的合成过程如图1)。
实施例2：赛庚啶完全抗原的合成
称取5mg赛庚啶半抗原于棕色小瓶中，加入1mlph4.7，0.1m的mes缓冲溶液溶解，将10mgedc和6mgnhs固体加入到半抗原反应瓶中，搅拌6-8h，得到活化液，称取钥孔血蓝蛋白klh溶解于cb溶液中，将活化液加入到蛋白质溶液中，用1mnaoh调节ph至9.0，室温反应过夜，整个过程避光进行，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子，并通过紫外方法鉴定，获得赛庚啶完全抗原(本发明赛庚啶完全抗原的紫外表征效果如图2)。
实施例3：分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1.动物免疫的获得
选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫，将获得的赛庚啶完全抗原与等量油剂混合，再加入乳化剂，乳化后得到不完全弗氏佐剂，在不完全弗氏佐剂中加入分枝杆菌得到完全弗氏佐剂；将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射多次免疫balb/c小鼠，先用完全弗氏佐剂进行首次免疫，再用不完全弗氏佐剂进行2次加强免疫；3次免疫过程结束后第7天，将小鼠进行采血，通过间接elisa检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中赛庚啶抗体含量高的获得免疫的小鼠；将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂进行第4次加强免疫，然后用不含佐剂的赛庚啶完全抗原进行冲击免疫，冲击免疫不使用佐剂，采用腹腔注射(加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲击免疫之间间隔18天)。
2.细胞融合
在冲击免疫三天后，按peg(聚乙二醇，分子量为1500)方法进行细胞融合，步骤如下：
(1)无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
(2)收集sp2/0细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
(3)将脾细胞和sp2/0细胞按照1：10的比例混合，离心后用50％peg融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入rpmi-1640基础培养液，离心后悬浮于含20％胎牛血清，2％的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃，5％co2的培养箱中培养。
3.细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用间接elisa筛选出阳性细胞孔；第二步选用赛庚啶为标准品，用间接竞争elisa对阳性细胞进行抑制效果测定，选择对赛庚啶标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测，重复三次，获得细胞株。
4.细胞株冻存
将该细胞株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，培养物名称为：单克隆细胞株，保藏编号为：cgmccno.14697，保藏日期为：2017年9月5日。
实施例4：赛庚啶单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
使用间接竞争elisa，测定单克隆抗体赛庚啶的ic50为：0.370ng/ml，说明对赛庚啶有很好的灵敏度，可用于赛庚啶免疫分析检测(本发明单克隆抗体的抑制标准曲线如图3)。
实施例5：赛庚啶单克隆抗体的应用
将从分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞获得的单抗应用于赛庚啶的elisa添加回收试验，具体步骤如下：
(1)溶液的配置：
碳酸盐缓冲液(cbs)：称取na2co31.59g，nahco32.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液(pbs)：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
pbst：含0.05％吐温20的pbs；
tmb显色液：a液：na2hpo4·12h2o18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中，a、b液按1：5混合即为tmb显色液，现用现混；
(2)包被：将包被原的cla-cmo-ova用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液从1μg/ml开始倍比稀释，100ul/孔，37℃反应2h；
(3)洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
(4)封闭：拍干后，加入200ul/孔封闭液，37℃反应2h，洗涤后烘干备用；
(5)加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100ul/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100ul/孔，37℃反应1min；
(6)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100ul的tmb显色液，37摄氏度避光反应15min；
(7)终止和测定：每孔加入50ul终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值；
(8)结果判读：以od450值大于或等于阴性对照孔的2.1倍(即p/n≥2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的elisa效价。
用ic-elisa测定赛庚啶单克隆抗体的ic50值为0.370ng/ml，说明对赛庚啶有很好的灵敏度，可用于赛庚啶免疫分析检测。
三次加免后小鼠血清检测结果：
对比例1：分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
将上述实施例中的包倍原替换为bsa，发现赛庚啶偶联ova作为包被抗原效果更好。
对比例2：分泌赛庚啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
将上述实施例中的加免次数改为二次加免后小鼠血清检测结果：
与三次加免相比，二次加免后，检测的小鼠血清的效价和抑制都没有三次加免后的检测结果好。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。