本发明涉及基因工程和生物制品领域，具体地说，涉及一种犬干扰素-α2重组蛋白的制备方法。
背景技术：
干扰素(ifn)是一种具有多种功能的活性蛋白质，由单核细胞和淋巴细胞产生，是目前研究最多、应用最广的细胞因子之一。是机体细胞在受到病毒、细菌内毒素以及其他诱生剂的刺激下，由受体细胞分泌的一种糖蛋白。根据干扰素产生的细胞、受体、活性等，可将其分为i型、ii型和iii型。ifn-α属于i型干扰素，有多种亚型。ifn-α具有广谱抗病毒活性,不仅可以抑制rna病毒的复制,还可抑制多种dna病毒的复制，其抗病毒活性主要表现在以下几个方面：①可通过促使病毒mrna降解来抑制感染细胞中病毒mrna的翻译。②可增强nk细胞对病毒的杀伤能力，并可作为一种可溶性细胞因子用以抑制和干扰病毒的繁殖，并刺激淋巴细胞分泌产生多种广谱抗病毒蛋白质。③通过t和b淋巴细胞或k细胞并在igg的共同作用下，使感染病毒的宿主细胞溶解死亡从而阻断病毒的繁殖。④能提高细胞表面mhci类分子的表达水平，向t细胞呈递抗原，促进病毒感染细胞发生溶解。
犬ifn-α全基因为564个碱基，187个氨基酸，其中前23个氨基酸为信号肽，后164个为成熟肽。推导氨基酸序列有2个潜在的n-糖基化位点，有10个与二硫键形成有关的半耽氨酸。目前有学者克隆了犬的8个ifn-α亚型，并且并绘制了分子进化树，其中将calfn-α分为2组：calfn-αl、2、7为一组；caifn-α3、4、5、6、8为一组。
近年来，犬作为伴侶动物越来越多的出现在人们的生活中,犬的病毒性疾病及狂犬病等人畜共患病逐渐引起了人们的重视。因此，采用一种安全无副作用的药物来预防和治疗犬病毒病就显得尤为重要。α2干扰素为国际最常用的干扰素产品，是治疗病毒性疾病的良药，在人类疾病，如复发性疱疹、病毒性角膜炎等方面具有较好治疗效果；对巨噬细胞病毒、冠状病毒等也有一定疗效。
大肠杆菌表达系统由于其遗传背景清楚、培养周期短、表达量高、遗传稳定等优点被广泛应用于外源蛋白表达。目前，尚未见利用大肠杆菌表达系统表达犬干扰素-α2重组蛋白的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种犬干扰素-α2重组蛋白的制备方法。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种按照大肠杆菌表达系统密码子偏好性，优化设计的编码犬干扰素-α2重组蛋白的核酸序列，所述核酸序列如seqidno:1所示。其编码的氨基酸序列如seqidno:2所示。
本发明的犬干扰素-α2的成熟肽的密码子优化的基因序列如seqidno:3所示。其编码的氨基酸序列如seqidno:4所示。
本发明还提供含有所述编码犬干扰素-α2重组蛋白核酸序列的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌。
本发明还提供犬干扰素-α2重组蛋白的制备方法，对犬干扰素-α2基因进行密码子优化后，克隆至pet-21a或pet-32a(优选pet-21a)中构建重组表达质粒，转化至大肠杆菌感受态细胞bl21中，制备重组菌，通过发酵、诱导表达、纯化，获得犬干扰素-α2重组蛋白。
优化后的犬干扰素-α2基因的核酸序列如seqidno:1所示。
前述方法中，重组表达质粒的构建方法如下：
以人工合成的优化后的犬干扰素-α2基因序列为模板，切除信号肽序列，只保留如seqidno:3所示编码成熟肽的基因片段caifn-α2；
用bamhi和xhoi分别双酶切pet-32a载体和caifn-α基因片段，对酶切的载体片段和目的片段进行胶回收；用连接酶连接caifn-α基因片段与pet-32a表达载体，构建成pet-32a-caifn-α2重组表达质粒；
以pet-32a-caifn-α2重组表达质粒为模板，设计引物，pcr扩增出caifn-α2基因片段，与经过ndei/bamhi双酶切的pet-21a载体连接，构建成重组表达质粒pet-21a-caifn-α2。
优选地，构建重组表达质粒pet-21a-caifn-α2时所用引物序列如seqidno:5-6所示。
25μlpcr体系：premix12.5μl，上、下游引物各1μl，dna模板1μl，双蒸水补至25μl。
pcr反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。
前述方法中，重组菌的制备、发酵及诱导表达如下：将重组表达质粒pet-32a-caifn-α2或pet-21a-caifn-α2分别转化至大肠杆菌感受态细胞bl21中，在含amp的lb固体培养基上37℃培养16-18h，挑取阳性克隆菌提取质粒，进行鉴定，将鉴定正确的重组菌pet-32a-caifn-α2/bl21或pet-21a-caifn-α2分别接种于含amp的lb液体培养基中，37℃振荡培养至od600＝0.6-0.8时，加入诱导剂iptg至终浓度为1mmol/l，37℃，200rpm，诱导6h。
诱导后的重组菌经超声破碎、变性、复性和分子筛层析进行纯化，具体如下：
诱导后的重组菌在4℃，10000rpm，离心5min，收集菌体沉淀，用pbs洗涤2次后用双蒸水重悬，冰浴超声波破碎后离心，弃上清，获得沉淀；采用包涵体洗涤液i(20mmtris-hcl，5mmedta，100mmnacl，0.5％tritonx-100，ph8.4)重悬沉淀，12000r/min，4℃离心20min，弃上清；沉淀再用包涵体洗涤液ⅱ(20mmtris-hcl，5mmedta，100mmnacl，2murea，ph8.4)洗涤、重悬，搅拌溶解1h，12000r/min，4℃离心20min，弃上清，得到的沉淀即为包涵体粗制品；将上述包涵体粗制品溶于变性液(20mmtris-hcl，5mmedta，8murea，ph8.4)中，室温搅拌溶解2h，12000r/min，4℃离心30min，取上清，经0.45μm滤器过滤后，装入处理好的透析袋中，依次在含6m、4m、2m和0m尿素的复性液(20mmtris，0.5mmedta，50mmnacl，1％甘氨酸，1mmdtt，0.1mm谷胱甘肽，盐酸调ph至8.4)中4℃低温透析，最后将目的蛋白置换到ph7.2-7.4的pbs缓冲体系中；将上述复性蛋白上样至分子筛凝胶层析(superdex20015/300gl)柱，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰样品，用sds-page检测蛋白浓度，用bca法测定目的蛋白终浓度。采用westernblot鉴定表达的目的蛋白。采用mdck-vsv系统测定犬重组干扰素-α2的抗病毒活性。
优选地，所用洗脱液为：20mmtris-hcl，50mmnacl，ph8.0。
优选地，利用akta蛋白纯化系统控制，收集洗脱峰样品。
本发明进一步提供所述编码犬干扰素-α2重组蛋白核酸序列或含有所述核酸序列的生物材料在制备广谱抗病毒制剂中的应用。
所述病毒包括但不限于犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
由于干扰素在大肠杆菌中通常以包涵体形式表达，需要经过变性、复性的过程来获得具有活性的蛋白质。因此，影响包涵体的变性、复性的因素均可能对表达产物的活性产生较大影响。本发明通过对表达基因的密码子进行优化、筛选最佳载体、对包涵体的变性、复性条件等进行优化，有利于提高表达产物的活性。
本发明以犬干扰素-α2为研究对象，通过密码子优化、比较pet-32a和pet-21a表达载体、优化变性、复性条件等，获得高活性重组犬干扰素-α2重组蛋白，纯化的pet-32a-caifn-α2蛋白浓度高达1.7mg/ml，而pet-21a-caifn-α2蛋白浓度为0.37mg/ml，纯度均达到90％以上。并研究了重组蛋白对水泡性口炎病毒(vsv)的抗病毒作用，结果纯化的pet-32a-caifn-α2重组蛋白和pet-21a-caifn-α2重组蛋白的抗病毒比活性分别为0.88×103iu/mg和3.33×107iu/mg，推测可能是pet-32a标签的存在影响了caifn-α2重组蛋白的抗病毒活性。进一步探讨了其作为广谱抗病毒制剂的药效，表达的重组蛋白caifn-α2(pet-21a-caifn-α2重组蛋白)按20万iu/kg的剂量皮下注射病犬，连续注射6天为一个疗程，结果对犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等dna病毒、rna病毒感染具有较理想的预防及治疗效果，注射犬明显出现症状减轻、食欲恢复，死亡率降低，排毒减少。本发明为实现重组犬干扰素-α2工艺化生产和进一步广谱性预防和治疗犬的病毒性疫病提供有效的技术手段。
附图说明
图1为本发明实施例2中pet-32a-caifn-α2重组质粒的酶切鉴定结果。
图2为本发明实施例2中caifn-α2基因pcr扩增产物电泳结果。
图3为本发明实施例3中caifn-α2成熟肽基因pcr扩增产物电泳结果。
图4为本发明实施例3中pet-21a-caifn-α2重组质粒的酶切鉴定结果。
图5为本发明实施例4中pet-32a-caifn-α2重组蛋白表达的可溶性分析结果。
图6为本发明实施例5中pet-21a-caifn-α2重组蛋白表达的可溶性分析结果。
图7为本发明实施例6中纯化的pet-32a-caifn-α2重组蛋白sds-page分析结果。其中，m：蛋白质分析质量标准；1：经分子筛层析柱纯化后pet-32a-caifn-α2重组蛋白。
图8为本发明实施例6中纯化的pet-21a-caifn-α2重组蛋白sds-page分析结果。其中，m：蛋白质分析质量标准；1：分子筛流穿液；2：经分子筛层析柱纯化后pet-21a-caifn-α2重组蛋白。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1基因序列及引物的设计和合成
参照genbank中的caifn-α2基因序列(m28625.1)，根据大肠杆菌表达系统密码子偏好性进行密码子优化，优化后的基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，同时在合成基因的5’和3’端加入bamhi、xhoi酶切位点，得到caifn-α2基因片段。序列见seqidno:1。以合成的caifn-α2基因序列为模板，切除信号肽，只保留成熟肽的编码基因(seqidno:2)，利用primer5软件设计一对特异性引物，其中上游引物caifn-α2-f中引入ndei限制性酶切位点，下游引物caifn-α2-r中引入bamhi限制性酶切位点。引物由上海生工生物技术有限公司合成。caifn-α2-f序列如seqidno.5所示，caifn-α2-r序列如seqidno.6所示。
实施例2pet-32a-caifn-α2重组表达质粒的构建
用bamhi和xhoi分别双酶切pet-32a载体和优化合成的caifn-α2基因片段，对酶切的表达载体片段和目的片段进行胶回收。用t4连接酶连接caifn-α基因片段与pet-32a表达载体，构建pet-32a-caifn-α2重组表达质粒，pet-32a-caifn-α2重组质粒经bamhi/xhoi双酶切，出现了约5900bp及528bp的条带，与表达载体pet-32a和caifn-α2目的基因条带大小相符，如图1所示。对挑选的质粒进行pcr鉴定，扩增出528bp的条带，与理论大小相符，见图2。表明重组质粒pet-32a-caifn-α2构建成功。阳性质粒送金唯智公司测序。
实施例3pet-21a-caifn-α2重组表达质粒的构建
以pet-32a-caifn-α2重组表达质粒为模板，以caifn-α2-f/caifn-α2-r为引物，利用聚合酶链式反应(pcr)扩增出caifn-α2成熟肽基因片段。25μlpcr体系：premix12.5μl，上、下游引物各1μl，模板1μl，双蒸水补至25μl。pcr反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。pcr结束，产物经1％琼脂糖凝胶电泳后(图3)，参照dna回收试剂盒说明进行回收与纯化。
先用ndei/bamhi双酶切pet-21a载体，参照dna回收试剂盒说明进行回收与纯化。在ep管中加入线性化pet-21a载体1μl，回收的目的片段1μl，fusionenzyme1μl，fusionbuffer2μl,双蒸水补至10μl。37℃孵育30min，产物标记为pet-21a-caifn-α2。转化bl21感受态细胞，在有amp抗性的lb固体培养基上37℃培养16-18h，挑取阳性克隆菌提取质粒，进行ndei/bamhi双酶切，出现了约5400bp及528bp的条带，与表达载体pet-21a和caifn-α2目的基因条带大小相符，如图4所示，表明重组质粒pet-21a-caifn-α2构建成功。将阳性质粒送金唯智公司测序。
实施例4pet-32a-caifn-α2/bl21重组菌的诱导表达及鉴定
将鉴定正确的pet-32a-caifn-α2/bl21重组菌接种于含氨苄青霉素(50μg/ml)的lb培养基中，37℃振荡培养至od600＝0.6-0.8时，加入诱导剂iptg至终浓度为1mmol/l，37℃，200rpm，诱导6h。然后4℃，10000rpm，高速离心5min，收集菌体沉淀，用pbs洗涤2次后用双蒸水重悬，超声波破碎后，高速离心，分别收集上清和沉淀，进行sds-page电泳，分析目的蛋白可溶性。结果显示(图5)，重组caifn-α2蛋白pet-32a载体系统中获得表达，表达产物约40kd，与预期结果相符。
实施例5重组质粒pet-21a-caifn-α2的诱导表达
将鉴定正确的pet-21a-caifn-α2/bl21重组菌接种于含氨苄青霉素(50μg/ml)的lb培养基中，37℃培养至od600＝0.6-0.8时，加入诱导剂iptg至终浓度为1mmol/l，37℃，200rpm，诱导6h。然后4℃，10000rpm，高速离心5min，收集菌体沉淀，用pbs洗涤2次后用双蒸水重悬，超声波破碎后，高速离心，分别收集上清和沉淀，进行sds-page电泳，分析目的蛋白可溶性。结果显示(图6)，重组caifn-α2蛋白在pet-21a载体系统中获得表达，表达产物约20kd，与预期结果相符。
实施例6重组蛋白caifn-α2的纯化
按上述方法进行pet-32a-caifn-α2/bl21重组菌和pet-21a-caifn-α2/bl21重组菌的诱导、表达，将离心收集的菌体沉淀用pbs洗涤2次后用双蒸水重悬，冰浴超声波破碎后高速离心，弃上清，获得沉淀。采用包涵体洗涤液i(20mmtris-hcl，5mmedta，100mmnacl，0.5％tritonx-100，ph8.4)重悬沉淀，12000r/min，4℃离心20min，弃上清；沉淀再用包涵体洗涤液ⅱ(20mmtris-hcl，5mmedta，100mmnacl，2murea，ph8.4)洗涤、重悬，搅拌溶解1h，同上离心，弃上清，得到包涵体粗制品。将上述包涵体粗制品溶于变性液(20mmtris-hcl，5mmedta，8murea，ph8.4)中，室温搅拌溶解2h，12000r/min，4℃离心30min，取上清，经0.45μm滤器过滤后，装入处理好的透析袋中，依次在含6m、4m、2m和0m尿素的复性液(20mmtris，0.5mmedta，50mmnacl，1％甘氨酸，1mmdtt，0.1mm谷胱甘肽，盐酸调ph至8.4)中4℃低温透析，最后将目的蛋白置换到pbs(ph7.2-7.4)缓冲体系中。将上述复性蛋白上样至分子筛凝胶层析(superdex20015/300gl)柱,洗脱液为20mmtris-hcl，50mmnacl，ph8.0，利用akta蛋白纯化系统控制，收集洗脱峰样品，用sds-page检测蛋白浓度，用bca法测定目的蛋白终浓度。结果表明，经过变性复性、透析、分子筛层析纯化后pet-32a-caifn-α2蛋白(图7)和pet-21a-caifn-α2蛋白(图8)纯度较高，均达到90％以上。经bca法测定，纯化的pet-32a-caifn-α2蛋白浓度高达1.7mg/ml，而pet-21a-caifn-α2蛋白浓度为0.37mg/ml。
实施例7重组蛋白caifn-α2的抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法，在mdck-vsv系统上测定pet-32a-caifn-α重组蛋白和pet-21a-caifn-α重组蛋白的抗病毒活性。将mdck细胞以2×104cells/孔的密度铺于96孔细胞培养板中，37℃、5％co2条件下培养4-6h，待细胞贴壁后，分别加入用测定培养液(含7％fbs的dmem)倍比稀释后的犬重组干扰素-α2和空载体表达蛋白做阴性对照，空白对照，平行三个重复，37℃、5％co2条件下培养18-24h后，弃掉上清，pbs洗涤三次，用攻毒培养液(含2％fbs的dmem)稀释vsv，将vsv以100tcid50的攻毒剂量感染mdck细胞，每孔100μl，同时设置阳性对照(只加vsv)、蛋白对照(只加犬重组干扰素-α2后换成完全培养液，37℃、5％co2条件下培养24h，观察细胞半数病变数量，以出现50％细胞病变的最高稀释度为一个干扰素单位(iu)。按照reed-muench法计算纯化后的pet-32a-caifn-α2重组蛋白抗病毒活性为1.5×103iu/ml，纯化的pet-21a-caifn-α2重组蛋白的抗病毒活性为1.0×107iu/ml。计算纯化的pet-32a-caifn-α2重组蛋白和pet-21a-caifn-α2重组蛋白的抗病毒比活性分别为0.88×103iu/mg和3.33×107iu/mg。
综上，本发明的犬α2干扰素在pet-32a及pet-21a载体系统中均能成功表达，且具有抗病毒活性，但在pet-21a载体系统表达产物的活性更高，达3.33×107iu/mg，为进一步开发和利用犬干扰素制剂奠定了基础。
实施例8重组蛋白caifn-α2预防及治疗效果评价
采用表达的重组蛋白caifn-α2(pet-21a-caifn-α2重组蛋白)按照20万iu/kg剂量皮下注射病犬，连续注射6天为一个疗程，通过症状观察、临床检测等评价其用于预防及治疗犬的犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等疫病的效果，结果显示重组蛋白caifn-α2可以有效预防及治疗犬的犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等疫病，注射犬明显出现症状减轻、食欲恢复，死亡率降低，排毒减少。
针对犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等疫病临床病例，分别采用犬重组干扰素-α2(pet-21a-caifn-α2)按照20万iu/kg剂量皮下注射病犬，连续注射6天进行治疗后，观察病犬的症状、食欲，排毒情况，死亡率。结果见表1。
表1犬重组干扰素-α2治疗效果评价表
分别用犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒人工感染60-70日龄实验犬，在感染前24h开始，采用犬重组干扰素-α2(pet-21a-caifn-α2)按照20万iu/kg剂量皮下注射病犬，连续注射6天进行预防后，观察攻毒犬的症状、食欲，排毒情况，死亡率。结果见表2。
表2犬重组干扰素-α2预防效果评价表
犬瘟热症状打分：体温升高/起伏不定，双相热，精神沉郁，食欲差，眼结膜发红、眼睑肿胀，分泌出水样分泌物，鼻头发干，流出水样分泌物。少数病例可见足掌皮肤角化过渡性病变。出现咳嗽，肠胃型感染的出现呕吐、腹泻，约有10～30％病犬出现神经症状(痉挛、癫痫、抽搐等)。根据症状从重到轻依次打分为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0。
肠炎型犬细小病毒病症状打分：肠炎病犬初期精神沉郁，厌食，偶见发热，软便或轻微呕吐，随后发展成为频繁呕吐和剧烈腹泻。起初粪便呈灰色，黄色或乳白色，带果冻状粘液，其后排出恶臭的酱油样或番茄汁样血便。病犬迅速脱水，消瘦，眼窝深陷，被毛凌乱，皮肤无弹性，耳鼻，四肢发凉，精神高度沉郁，休克，死亡。根据症状从重到轻依次打分为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0。
犬副流感病毒病症状打分：发热、咳嗽、流涕，病犬疲软无力，体温升高至40℃以上，病犬后肢可支撑躯体，但不能行走。根据症状从重到轻依次打分为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0。
犬传染性肝炎症状打分：病犬精神沉郁，流水样或脓性鼻液，结膜发炎，羞明流泪。口腔及齿龈出血或见出血点，体温升高，呼吸加快，心跳快，节律不齐。咳嗽。有的病犬呕吐或排稀便。根据症状从重到轻依次打分为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0。
食欲打分标准：食欲正常5分，食欲稍差4分，食欲较差3，食欲较少2，基本无食欲1分，食欲废绝0分。
综合以上犬重组干扰素-α2对犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等疫病临床预防/治疗情况，犬重组干扰素-α2注射犬明显出现症状减轻、食欲恢复，死亡率降低，排毒减少。表明犬重组干扰素-α2对犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等疫病具有较好的预防/治疗作用，可行临床使用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120>犬干扰素-α2重组蛋白的制备方法
<130>khp171119237.2
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>576
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ggatccatggcgctgccgtgcagcttcagcgtggcgctggttctgctgagctgccacagc60
ctgtgctgcctggcgtgccacctgccggacacccacggtctgcgtaactggcgtgtgctg120
accctgctgggtcaaatgcgtcgtctgagcgcgggcagctgcgaccactacaccaacgat180
ttcgcgtttccgaaggagctgtttgacggccagcgtctgcaagaagcgcaggcgctgagc240
gtggttcacgtgatgacccagaaagttttccacctgttttgcccggataccagcagcgcg300
ccgtggaacatgaccctgctggaggaactgtgcagcggtctgagcgagcaactggacgat360
ctggaagcgtgcccgctgcaggaagcgggtctggcggaaaccccgctgatgcacgaggac420
agcaccctgcgtacctacttccaacgtatcagcctgtatctgcaggatcgtaaccacagc480
ccgtgcgcgtgggagatggttcgtgcggaaattggtcgtagcttctttagcagcaccatc540
ctgcaagaacgtatccgtcgtcgtaagtaactcgag576
<210>2
<211>187
<212>prt
<213>犬(canislupusfamiliaris)
<400>2
metalaleuprocysserpheservalalaleuvalleuleusercys
151015
hisserleucyscysleualacyshisleuproaspthrhisglyleu
202530
argasntrpargvalleuthrleuleuglyglnmetargargleuser
354045
alaglysercysasphistyrthrasnaspphealapheprolysglu
505560
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<213>人工序列(artificialsequence)
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