本发明涉及一种药物化合物，特别是涉及一种具有神经细胞保护活性的四个异黄烷苷类化合物及其制备方法。
背景技术：
随着人口老龄化问题日益突出，神经退行性疾病已成为世界范围内危害人类健康最严重的疾病之一。神经退行性疾病是以特异性神经元渐进性损伤为主要特征的一类神经系统疾病，包括阿尔茨海默病(alzheimerdisease，ad)、帕金森病(parkinsondisease，pd)、亨廷顿病(huntingtondisease，hd)和肌萎缩侧索硬化症等。神经退行性疾病的发病机制极其复杂，迄今尚未被完全阐明，目前缺乏有效的诊断和治疗方法。大量研究表明，氧自由基损伤(氧化应激，oxidativestress)在神经退行性疾病的机理中起重要作用，超氧阴离子、羟自由基及过氧化氢等氧自由基的堆积和损伤与神经退行性疾病的不断加重有关。天然抗氧化剂作为神经保护剂，在预防和治疗神经退行性疾病中发挥着重要作用。h2o2是氧自由基的一种主要形式，易于穿过细胞膜并引起细胞氧化应激，被广泛应用于构建体外模型来研究氧化应激机制和评估新药物疗法的神经保护潜能。人的神经母细胞瘤sh-sy5y细胞由于具有类似于神经元的细胞形态、生理及生化功能，经常用于神经细胞损伤的研究。本专利应用h2o2诱导sh-sy5y细胞构建氧化应激损伤细胞模型，初步证明分离得到的化合物是否具有抗氧化损伤的神经保护潜力。
紫花苜蓿(medicagosatival.)为豆科(leguminosae)蝶形花亚科(papilionoideae)车轴草族(trib.trifolieae)苜蓿属植物，是当今世界分布最广、应用最多的栽培牧草之一，被誉为“牧草之王”。紫花苜蓿是一种药食同源的食物，除了可以当做食物进行直接食用之外，还具有一定的药用价值，对多种疾病都有治疗作用。《名医别录》将其列为菜部上品，称其“味苦，平，无毒，主安中，利人”，具有清热解毒、凉血通淋、益气健脾温肾的功效,在民间多被用于治疗胃热烦闷、不欲饮食、肺热咳嗽、膀胱结石、痔疮、黄疸等症。紫花苜蓿富含多种化学成分，包括三萜皂苷、黄酮、生物碱、香豆素以及多糖等。其中，三萜皂苷和黄酮类化学成分为主要的活性次级代谢产物，有着广泛的生物活性。经查，现有技术中未见有本发明的化合物及其具有抗神经退行性疾病价值治疗前景的活性的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有神经细胞保护活性的四个异黄烷苷类化合物及其制备方法，本发明通过对紫花苜蓿根的化学成分中分离得到四个异黄酮苷类新化合物，利用h2o2诱导sh-sy5y神经细胞损伤模型评价化合物的神经细胞保护作用，且其呈现明显的量效关系，显示该类化合物在制备抗神经退行性疾病药物中的应用前景。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种具有神经细胞保护活性的四个异黄烷苷类化合物，所述化合物从干燥的紫花苜蓿(medicagosatival.)根部分离得到，该化合物1-4具有下述结构式：
该化合物在制备神经退行性疾病药物中的应用。
一种具有神经细胞保护活性的四个异黄烷苷类化合物制备方法，所述方法包括如下制备过程：
取干燥的苜蓿属紫花苜蓿(medicagosatival.)根部，乙醇加热回流提取三次，每次2小时；提取液减压浓缩得到总浸膏，将总浸膏混悬分散在水中，用二氯甲烷萃取三次，分别减压浓缩，得到水层提取物；将水层提取物进行大孔树脂d101分离，按照甲醇：水为0:100,30:70,50:50,70:30,100:0进行梯度洗脱，减压浓缩得组分fr.a-e五个组分；将组分fr.d进行正相硅胶柱层析，按二氯甲烷：甲醇比例为50:1,30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1进行梯度洗脱，得到了8个组分(fr.d1-d8)，第1个组分fr.d3b-1经高效液相色谱等度（甲醇水50%）分离得化合物2(11.2mg)和化合物4(9.2mg)；组分fr.d5进行正相硅胶柱层析，按照二氯甲烷：甲醇比例为30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1进行梯度洗脱，得到3个组分(fr.d5a-fr.d5c)，组分fr.d5c经高效液相色谱等度（甲醇水60%）分离得到化合物3(13.5mg)。
所述的一种具有神经细胞保护活性的四个异黄烷苷类化合物制备方法，其中fr.d3进行硅胶柱层析按二氯甲烷：甲醇比例为50:1,30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1进行梯度洗脱，得到了4个组分(fr.d3a-fr.d3d)。
所述的一种具有神经细胞保护活性的四个异黄烷苷类化合物制备方法，其中第三个组分fr.d3b进行c18反相色谱分离梯度洗脱，按照甲醇：水比例为40:60,60:40,80:20,100:0进行梯度洗脱，得4个组分。
所述的一种具有神经细胞保护活性的四个异黄烷苷类化合物制备方法，其中第2个组分fr.d3b-2经高效液相色谱等度（甲醇水40%）分离得化合物1(19.5mg)。
本发明的优点与效果是：
本发明首次公开了紫花苜蓿根中四个新的异黄酮苷类化合物的结构。本发明通过对紫花苜蓿根的化学成分进行研究，从中分离得到四个异黄酮苷类新化合物。为进一步研究新化合物的生物活性，利用h2o2诱导sh-sy5y神经细胞损伤模型评价化合物的神经细胞保护作用。结果表明，结果表明四个新化合物具有显著的神经细胞保护作用，且其呈现明显的量效关系，显示该类化合物在制备抗神经退行性疾病药物中的应用前景。
附图说明
图1是化合物1的hresims图谱；
图2是化合物1的1hnmr图谱；
图3是化合物1的13cnmr图谱；
图4是化合物1的hsqc图谱；
图5是化合物1的hmbc图谱；
图6是化合物1的cd图谱；
图7是化合物1的ecd图谱；
图8是化合物2的hresims图谱；
图9是化合物2的1hnmr图谱；
图10是化合物2的13cnmr图谱；
图11是化合物2的hsqc图谱；
图12是化合物2的hmbc图谱；
图13是化合物2的cd图谱；
图14是化合物2的ecd图谱；
图15是化合物3的hresims图谱；
图16是化合物3的1hnmr图谱；
图17是化合物3的13cnmr图谱；
图18是化合物3的hsqc图谱；
图19是化合物3的hmbc图谱；
图20是化合物3的cd图谱；
图21是化合物3的ecd图谱；
图22是化合物4的hresims图谱；
图23是化合物4的1hnmr图谱；
图24是化合物4的13cnmr图谱；
图25是化合物4的hsqc图谱；
图26是化合物4的hmbc图谱；
图27是化合物4的cd图谱；
图28是化合物4的ecd图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
化合物1-4的分离纯化：
苜蓿属紫花苜蓿(medicagosatival.)的根部7kg，70%乙醇加热回流提取三次，每次2小时。提取液减压浓缩得到总浸膏。将总浸膏混悬分散在水中，用二氯甲烷萃取三次，分别减压浓缩，得到水层提取物1.5kg。将水层提取物1.5kg进行大孔树脂d101分离，按照甲醇：水为0:100,30:70,50:50,70:30,100:0进行梯度洗脱，减压浓缩得组分fr.a-e五个流分。将组分fr.d进行正相硅胶柱层析，按二氯甲烷：甲醇比例为50:1,30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1进行梯度洗脱，得到了8个馏分(fr.d1-d8)，其中d3进行硅胶柱层析按二氯甲烷：甲醇比例为50:1,30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1进行梯度洗脱，得到了4个馏分(fr.d3a-fr.d3d)。其中，第三个馏分fr.d3b进行c18反相色谱分离梯度洗脱，按甲醇：水比例为40:60,60:40,80:20,100:0进行梯度洗脱，得4个馏分，其中第2个馏分fr.d3b-2经高效液相色谱等度（甲醇水40%）分离得化合物1(19.5mg)。第1个馏分fr.d3b-1经高效液相色谱等度（甲醇水50%）分离得化合物2(11.2mg)和化合物4(9.2mg)。馏分fr.d5进行正相硅胶柱层析，按照二氯甲烷：甲醇比例为30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1进行梯度洗脱，得到3个馏分(fr.d5a-fr.d5c)，fr.d5c
经高效液相色谱等度（甲醇水60%）分离得到化合物3(13.5mg)。
化合物1-4的结构确证：
化合物1-4的结构式如下所示：
化合物1：(3r)-7,5′-dihydroxy-2′,3′,4′-trimethoxy-isoflavane-5′-o-β-d-glucoside,黄色无定形粉末，易溶于甲醇等有机溶剂，给出其分子离子峰m/z517.1667[m+na]+(calcd517.1680)。1hnmr(600mhz,dmso-d6)与13cnmr(150mhz,dmso-d6)数据见下表；
化合物2：(3r)-7-hydroxy-2′,4′,5′-trimethoxy-isoflavane-7-o-β-d-glucoside,黄色无定形粉末。hresims给出其分子离子峰m/z501.1744[m+na]+(calcd501.1731)。1hnmr(600mhz,dmso-d6)与13cnmr(150mhz,dmso-d6)数据见下表；
化合物3：(3s)-7,2′,5′-trihydroxy-8,4′-dimethoxy-isoflavane-7-o-β-d-glucoside,黄色无定形粉末。hresims给出其分子离子峰m/z503.1524[m+na]+(calcd503.1524)。1hnmr(600mhz,dmso-d6)与13cnmr(150mhz,dmso-d6)数据见下表；
化合物4：(3r,4r)-7,8-dihydroxy-4′-methoxy-pterocarpan-8-o-β-d-glucoside,黄色无定形粉末。hresims给出其分子离子峰m/z471.1264[m+na]+(calcd471.1264)。1hnmr(600mhz,dmso-d6)与13cnmr(150mhz,dmso-d6)数据见下表。
表1：化合物1-4的结构鉴定1hnmr(600mhz)数据：
表2：化合物1-4的结构鉴定13cnmr(150mhz)数据
实施例2：
本发明化合物及其与药用辅料组成的药物组合物的神经退行性疾病的药理作用。
化合物1-4的神经细胞保护活性实验。
实验原理：
mtt法是一种能够检验细胞存活及生长的方法。四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiahiazoy1)-3,5-diphenyl-tetrazoliumbromide,mtt]为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料。其作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下生成蓝紫色结晶物甲瓒formazan并沉积在细胞中，结晶的量与活细胞数是成正比，死细胞中琥珀酸脱氢酶消失不能将mtt还原为结晶物。可用dmso溶解结晶物，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。sh-sy5y细胞系是人神经母细胞瘤细胞，采用h2o2诱导其凋亡作为神经退行性疾病模型。加药后如果有神经细胞保护活性，可以检测到细胞活力显著上升。
化合物1-4样品溶液的配制：准确称取样品1mg，用dmso溶解成高浓度的母液，0.22μm微孔滤膜过滤，-20oc保存，实验时用培养液稀释至所需的浓度。
h2o2：用去离子水将h2o2配成浓度为10mmol/l·的母液，0.22μm微孔滤膜过滤，4oc避光保存，实验时用培养液稀释至100μmol/l。
实验操作步骤：
采用h2o2诱导神经母细胞瘤sh-sy5y细胞株损伤模型，以mtt法对化合物1-4进行神经保护活性测试。sh-sy5y细胞传代进行常规培养后，接种于96孔板，细胞密度为1×105个/ml在37°c、5%co2培养箱中静置培养24h至细胞贴壁。加入至每孔终浓度为25,50,100μmol/l的化合物，放置于培养箱中培养4h，再加入100μmol/l的h2o2作用4h，mtt检测细胞活性。阴性对照组：细胞在传代进行常规培养接种于96孔板后，不用药物及h2o2做任何处理，其它实验步骤与给药组相同。阳性对照组：以trolox为阳性对照药代替给药组中的药物，其它实验步骤与给药组相同。空白对照组：孔内不接种细胞，不用药物及h2o2做任何处理，其它实验步骤与给药组相同。用spss18.0统计软件进行统计，数据以均数±标准差(mean±sd)表示，并进行one-wayanova的bonferroni’smultiplecomparison检验。
存活率(%)=[a490(给药组)-a490(空白对照)]/
[a490(阴性对照)-a490(空白对照)]×100%
结果表明，化合物1-4可以作为抑制过氧化氢诱导的sh-sy5y神经细胞损伤保护作用的先导化合物进行后续衍生化开发
表3：化合物1-4对h2o2诱导的sh-sy5y细胞氧化损伤的保护作用(means±sd,n=3)
a:p<0.05,b:p<0.01和c:p<0.001,与h2o2诱导损伤组比较。