本发明属于医药技术领域，涉及基于肠道mct1载体蛋白设计的前药，具体涉及以mct1为靶点的载体前药及其制备和应用。
背景技术：
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静脉化疗是癌症治疗的主要手段之一，却引起了感染、血栓和组织坏死等问题。与之相比，口服化疗安全方便，又能与药物动力学特点相适应而增进疗效，同时还可提高病人的生活质量，如已经成功上市的口服化疗药卡培他滨(j.gastrointest.oncol.,2017,8(6):945-952)和拓扑替康(oncotargetsther.,2017,8(14):23851-23861)。但是，口服生物利用度低且个体差异大往往制约了大多数口服抗肿瘤药物的开发。药物口服生物利用度受多种因素影响，如膜渗透性、水溶性、胃肠道毒性和外排转运等，正是这些限定因素导致口服化疗药的开发面临着巨大的挑战。
在口服抗肿瘤药物的研究中结合前药原理，对已上市的抗肿瘤药物进行结构修饰，改善药物的水溶性、膜渗透性以及副作用，是近年来口服化疗药物研究的热点。对于低膜渗透性的抗肿瘤药物，经典策略是在其结构上引入脂溶性基团，但是，亲脂化前药可能忽视了前药变差的水溶性，进而不利于药物的口服吸收。另外，p-糖蛋白(p-glycoprotein,p-gp)识别高脂溶性的药物(neurotherapeutics,2005,2(1):86-98)，而亲脂化前药策略在一定程度上可能增加抗肿瘤药物的外排，降低药物的口服吸收。除了简单的被动转运，药物还可以通过肠道上皮细胞的转运体来实现跨膜转运。目前研究已揭示肠上皮细胞黏膜上表达着丰富的药物转运体，如寡肽转运体1(oligopeptidetransporter1,pept1)、新型有机阳离子转运体(novelorganiccationtransporter2,octn2)和单羧酸转运体1(monocarboxylatetransporter1,mct-1)等(口服药物吸收与转运，人民卫生出版社，2006)，按照其底物结构要求在母药结构上连接特定基团，使之在体内转运时被转运体所识别，以提高其膜渗透性，如我们以肠pept1为靶点设计了阿糖胞苷缬氨酸酯前药用于治疗白血病，目前已经进入一期临床研究阶段。另外，我们在研究肠道octn2转运体为靶点的吉西他滨小分子载体前药时，发现母药与转运体识别基团之间的亲脂性连接桥能调节前药与转运体之间的亲和性，进而提高口服生物利用度。然而，以酰胺键为连接桥的小分子前药释药缓慢，一定程度上限制了吉西他滨的口服生物利用度和药效。大多数酰胺前药是经代谢酶激活而释放母药的，但激活效率较低。而且，种属和个体差异等因素也会影响酶的活性和表达，导致前药释药行为在不同动物间不一致，影响药物的生物利用度、吸收速度、分布、排泄和代谢等行为。而化学激活只与物理化学因素(生理ph值、温度以及取代基的空间位阻等)有关，不受种属、年龄及个体差异等因素影响，因此基于化学激活设计的前药更有优势。目前，基于化学激活的释药行为在前药设计中的报道应用逐渐增多，如karinfredholt教授将二元脂肪酸连接桥应用到了对乙酰氨基酚前药中，结果表明，在生理条件下(ph7.4和37℃)，前药分子通过化学激活能快速释放母药(int.j.pharm.1995,123,209-216)。然而，关于连接桥结构优化和释药速度的关系缺少进一步的报道。因此，如果将化学激活连接桥应用到酰胺前药中，通过优化连接桥的结构来调整前药的释药速度，显得非常有意义。
mct1为单羧酸转运体，主要负责短链脂肪酸消化道内的吸收，生理条件下mct1对丙酮酸(km＝0.7mm)和乳酸(km＝0.5mm)亲和性较高，而且在小肠全肠段及大肠大量表达。mct1转运体基于其广泛的底物专属性，在许多药物的吸收中扮演重要角色(j.pharmacol.exp.ther.,1999,290(3):958-64)，是提高弱吸收单羧酸药物生物利用度的理想靶点，然而以mct1为靶点设计小分子载体前药来提高药物口服生物利用度的研究还未见报道，这为提高口服吸收差的抗肿瘤药物的开发带来了新的希望。为了验证基于肠道mct1的口服载体前药的可行性以及拓宽mct1载体前药的应用范围，本发明首次合成以肠道mct1转运蛋白为靶点，以不同链长二元脂肪酸或羟基取代脂肪酸为靶头，对bcsiii类抗肿瘤进行化学修饰，合成载体前药。本发明为解决部分bcsiii类抗肿瘤药物通透性差、母药释放不完全以及口服生物利用度低等问题提供了一种解决方案。
技术实现要素：
本发明的目的是基于高表达于肠道上皮细胞的吸收型转运体-单羧酸转运体1(mct1)，该转运体能够提高靶向配体为靶头的前药的口服生物利用度，靶向配体为乙酸、乳酸和丙酮酸类似物，设计一种以mct1为靶点的载体前药及该前药在提高膜透性的同时，提高药物的释放，进而显著提高药物的口服吸收和药效。
为了实现这一目的，本发明提供通式(i)所示的化合物，几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物：
其中：x为nh、o；drug为含氨基或羟基的抗肿瘤药残基；n＝0-10。优选为n＝4-6。
本发明所述通式(i)所示结构的化合物中：含有氨基或羟基的抗肿瘤药选自吉西他滨、地西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、克拉屈滨、氟达拉滨、阿扎胞苷，及其它们的衍生物。
通式(i)所示的化合物优选的结构为：
本发明所述通式(i)化合物的制备方法如下：
(1)将不同链长二元脂肪酸溶于二氧六环中，加入氯化亚砜和三乙胺，制备二元脂肪酸单酰氯；
(2)不同抗肿瘤药在三乙胺存在的条件下与二元脂肪酸单酰氯发生酯化或酰胺化，生成目标产物。
步骤(1)中二元脂肪酸选自乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸。
反应条件：(i)氯化亚砜，二氧六环，60℃；(ii)三乙胺，室温。
本发明通式(i)所示的化合物，几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物用于提高膜渗透性和口服生物利用度。
本发明所述通式(i)用酰胺键或酯键连接母药和二元脂肪酸，利用二元脂肪酸单酯在胃肠道环境(ph2-6.8)不发生电离，而在循环系统(ph7.4)中发生电离的特点，进而通过化学激活促进药物的释放。
为了实现本发明的目的，本发明还提供通式(ii)所示的化合物，几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药：
其中：y为nh、o；drug为含氨基或羟基的抗肿瘤药残基；n＝0-10。
本发明所述通式(ii)所示的化合物：其中，drug为含有氨基或羟基的抗肿瘤药物残基。其中，含有氨基或羟基的抗肿瘤药选自吉西他滨、地西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、克拉屈滨、氟达拉滨、阿扎胞苷，及其它们的衍生物。
本发明所述通式(ii)化合物的制备方法如下：
(1)在无水条件下，利用三甲基氯硅烷(tmscl)保护二元脂肪酸的羟基；
(2)将不同链长羟基保护的二元脂肪酸溶于二氧六环中，加入氯化亚砜和三乙胺，制备单酰氯；
(3)不同抗肿瘤药在三乙胺存在的条件下与单酰氯发生酯化或酰胺化，经四烷基氟化铵脱掉保护，生成目标产物。
步骤(1)所述的二元脂肪酸为羟基保护的取代二元脂肪酸选自羟基丙二酸、羟基丁二酸、羟基戊二酸、羟基己二酸、羟基更二酸、羟基辛二酸、羟基壬二酸、羟基癸二酸。
反应条件：(i)氯化亚砜，二氧六环，60℃；(ii)三乙胺，室温；(iii)四烷基氟化铵。
本发明通式(ii)所示的化合物，几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物用于提高膜渗透性和口服生物利用度。
本发明所述通式(ii)用酰胺键或酯键连接母药和羟基取代二元脂肪酸，利用羟基取代二元脂肪酸单酯在胃肠道环境(ph2-6.8)不发生电离，而在循环系统(ph7.4)中发生电离的特点，进而通过化学激活促进药物的释放。
本发明还提供了所述通式(i)或(ii)所示的化合物，几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物在制备抗肿瘤药中的用途。
本发明的通式(i)或(ii)所示的化合物，几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物可以作为活性成分与药学上可接受的载体制备成药物组合物，并用于制备抗肿瘤药物。
为了拓宽mct1载体前药的应用范围，本发明以肠道mct1转运体为靶点，对bcsiii类抗肿瘤药物进行结构修饰，设计其与不同链长的二元脂肪酸或羟基取代二元脂肪酸通过酰胺连接臂相连，分别合成bcsiii类口服抗肿瘤药物的靶向前药。利用caco-2细胞实验、在体肠灌流实验和大鼠药动学实验对其膜通透性和亲和性进行比较，以寻求具有较好连接臂的前药对母药药动学行为的改善；同时利用体外稳定性实验考察不同连接桥结构与释药速的关系，以寻求具有良好释药行为的前药，进而显著改善药效。
本发明的优势在于：
1.本发明发现了肠道mct1转运体可以提高药物的口服吸收。
2.本发明基于肠道mct1转运体在小肠全肠段表达和h+驱动的特征，设计以mct1为靶点的口服载体前药，以提高渗透性差的抗肿瘤药的口服吸收。
3.用酰胺键或酯键连接母药和二元脂肪酸，利用二元脂肪酸单酯在胃肠道环境(ph2-6.8)不发生电离，而在循环系统(ph7.4)中发生电离的特点，进而通过化学激活促进药物的释放。
4.拓宽了以mct1为靶点的口服载体前药的应用范围，包括bcsiii类抗肿瘤药物，通过提高膜透性和调整释药速度，进而提高口服生物利用度和药效。
5.本发明使只能以注射方式给药的抗肿瘤药物口服成为可能，降低了风险，增加了患者顺应性。
附图说明
图1.吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药1-5在ph7.4磷酸盐缓冲液中的稳定性。
图2.(a)前药1和前药5在不同ph条件下caco-2细胞摄取；(b)前药1-5在不同温度下的caco-2细胞摄取。
图3.(a)丁酸对前药1-5caco-2细胞摄取的抑制作用；(b)生物素对前药1-5caco-2细胞摄取的抑制作用；(c)前药1-5对槲皮素caco-2细胞摄取的抑制作用。
图4.a、c、e、g、i：前药1-5浓度依赖性caco-2细胞摄取；b、d、f、h、j：前药1-5饱和摄取的eadie-hofstee曲线(v，最大转运速度；s，底物的浓度)。
图5.(a)：前药1-5和吉西他滨a-b方向caco-2细胞转运；(b)：前药1-5和吉西他滨b-a方向caco-2细胞转运；(c)：丁酸对前药1-5和吉西他滨a-b方向caco-2细胞转运的影响；(d)：生物素对前药1-5和吉西他滨a-b方向caco-2细胞转运的影响。
图6.吉西他滨和前药1-5血药浓度-时间曲线。
图7.丁酸对前药1口服吸收的抑制的血药浓度-时间曲线。
图8.阿糖胞苷-丁二酸单酯前药在ph7.4磷酸盐缓冲液中的稳定性。
图9.(a)阿糖胞苷-丁酸单酯前药在不同ph条件下caco-2细胞摄取；(b)阿糖胞苷和阿糖胞苷-丁酸单酯前药在不同温度下的caco-2细胞摄取。
图10.(a)丁酸对阿糖胞苷-丁酸单酯前药caco-2细胞摄取的抑制作用；(b)生物素对阿糖胞苷-丁酸单酯前药caco-2细胞摄取的抑制作用；(c)阿糖胞苷-丁酸单酯前药对槲皮素caco-2细胞摄取的抑制作用。
图11.(a)：阿糖胞苷和阿糖胞苷-丁酸单酯a-b方向caco-2细胞转运；(b)：阿糖胞苷和阿糖胞苷-丁酸单酯b-a方向caco-2细胞转运；(c)：丁酸对阿糖胞苷和阿糖胞苷-丁酸单酯a-b方向caco-2细胞转运的影响；(d)：生物素对阿糖胞苷和阿糖胞苷-丁酸单酯a-b方向caco-2细胞转运的影响。
图12.前药1-6结构式。
具体实施方式
本发明通过以下实施例对本发明作进一步阐述，但并不受限于此。如下前药
实例1吉西他滨-丁二酸单酯前药制备(前药1)
将丁二酸0.35g(3mmol)溶于15ml无水二氧六环中，加入0.25g(2.5mmol)三乙胺后，滴加二氯亚砜0.28g(2.4mmol)，滴毕抽真空氮气保护，110℃回流4h，减压浓缩反应液得到淡黄色的油状物，用10mldmf复溶。加入吉西他滨0.78g(3.2mmol)，另在室温条件下滴加三乙胺0.19g(1.5mmol)，滴毕抽真空氮气保护，反应过夜，tlc监测反应完全。减压浓缩反应液得到红棕色的油状物。柱层析得到白色固体，收率75％。ms(esi)：m/z＝364[m+h+]。thepuritydeterminedbyhplcwas97.5％.1hnmr(400mhz,d2o)δ7.73(d,j＝7.8hz,1h),6.22(t,j＝7.8hz,1h),6.17(d,j＝7.8hz,1h),4.57(d,j＝12.7hz,1h),4.52-4.34(m,2h),4.28(m,1h),2.73(dd,j＝7.1,4.7hz,2h),2.68(dd,j＝6.9,4.3hz,2h)。
实例2吉西他滨-己二酸单酯前药制备(前药2)
将己二酸0.44g(3mmol)溶于15ml无水二氧六环中，加入0.25g(2.5mmol)三乙胺后，滴加二氯亚砜0.28g(2.4mmol)，滴毕抽真空氮气保护，110℃回流4h，减压浓缩反应液得到淡黄色的油状物，用10mldmf复溶。加入吉西他滨0.78g(3.2mmol)，另在室温条件下滴加三乙胺0.19g(1.5mmol)，滴毕抽真空氮气保护，反应过夜，tlc监测反应完全。减压浓缩反应液得到红棕色的油状物。柱层析得到白色固体，收率61％。ms(esi)：m/z＝392[m+h+].thepuritydeterminedbyhplcwas97.2％.1hnmr(400mhz,dmso)δ11.00(s,1h),8.25(d,j＝7.6hz,1h),7.28(d,j＝7.6hz,1h),6.62–6.24(m,1h),6.17(t,j＝7.5hz,1h),5.32(s,1h),4.20(dd,j＝21.4,12.8hz,1h),4.03(q,j＝7.1hz,1h),3.93–3.85(m,1h),3.81(d,j＝12.6hz,1h),3.66(dd,j＝12.7,3.3hz,1h),2.96(q,j＝7.2hz,2h),2.42(t,j＝6.9hz,2h),2.22(t,j＝6.7hz,2h),1.99(s,1h),1.91(s,1h),1.65–1.41(m,5h),1.16(dd,j＝12.5,5.3hz,5h)。
实例3吉西他滨-辛二酸单酯前药制备(前药3)
将辛二酸0.52g(3mmol)溶于15ml无水二氧六环中，加入0.25g(2.5mmol)三乙胺后，滴加二氯亚砜0.28g(2.4mmol)，滴毕抽真空氮气保护，110℃回流4h，减压浓缩反应液得到淡黄色的油状物，用10mldmf复溶。加入吉西他滨0.78g(3.2mmol)，另在室温条件下滴加三乙胺0.19g(1.5mmol)，滴毕抽真空氮气保护，反应过夜，tlc监测反应完全。减压浓缩反应液得到红棕色的油状物。柱层析得到白色固体，收率69.1％。ms(esi)：m/z＝420[m+h+].thepuritydeterminedbyhplcwas96.2％.1hnmr(400mhz,dmso)δ11.81(s,1h),10.98(s,1h),8.24(d,j＝7.6hz,1h),7.29(d,j＝7.6hz,1h),6.32(s,1h),6.17(t,j＝7.5hz,1h),5.31(s,1h),4.27–4.12(m,1h),3.96–3.85(m,1h),3.81(d,j＝12.2hz,1h),3.66(d,j＝12.2hz,1h),3.03(q,j＝7.3hz,1h),2.40(t,j＝7.3hz,2h),2.19(t,j＝7.3hz,2h),1.59–1.44(m,4h),1.27(s,4h),1.17(t,j＝7.3hz,1h)。
实例4吉西他滨-辛二酸单酯前药制备(前药4)
将癸二酸0.61g(3mmol)溶于15ml无水二氧六环中，加入0.25g(2.5mmol)三乙胺后，滴加二氯亚砜0.28g(2.4mmol)，滴毕抽真空氮气保护，110℃回流4h，减压浓缩反应液得到淡黄色的油状物，用10mldmf复溶。加入吉西他滨0.78g(3.2mmol)，另在室温条件下滴加三乙胺0.19g(1.5mmol)，滴毕抽真空氮气保护，反应过夜，tlc监测反应完全。减压浓缩反应液得到红棕色的油状物。柱层析得到白色固体，收率53％。ms(esi)：m/z＝448[m+h+].thepuritydeterminedbyhplcwas97.6％.1hnmr(400mhz,dmso)δ11.81(s,1h),10.98(s,1h),8.24(d,j＝7.6hz,1h),7.29(d,j＝7.6hz,1h),6.32(s,1h),6.17(t,j＝7.5hz,1h),5.31(s,1h),4.27–4.12(m,1h),3.96–3.85(m,1h),3.81(d,j＝12.2hz,1h),3.66(d,j＝12.2hz,1h),3.03(q,j＝7.3hz,1h),2.40(t,j＝7.3hz,2h),2.19(t,j＝7.3hz,2h),1.59–1.44(m,4h),1.27(s,4h),1.17(t,j＝7.3hz,1h)。
实例5吉西他滨-丁二酸双酯前药制备(前药5)
将丁二酸0.35g(3mmol)溶于15ml无水二氧六环中，加入0.25g(2.5mmol)三乙胺后，滴加二氯亚砜0.28g(2.4mmol)，滴毕抽真空氮气保护，110℃回流4h，减压浓缩反应液得到淡黄色的油状物，用10mldmf复溶。加入吉西他滨0.39g(1.6mmol)，另在室温条件下滴加三乙胺0.09g(0.9mmol)，滴毕抽真空氮气保护，反应过夜，tlc监测反应完全。减压浓缩反应液得到红棕色的油状物。柱层析得到白色固体，收率55％。ms(esi)：m/z＝464[m+h+]。thepuritydeterminedbyhplcwas98.3％.1hnmr(400mhz,meod)δ8.01(s,1h),7.55(d,j＝7.6hz,1h),6.21(t,j＝8.9hz,1h),5.87(d,j＝7.6hz,1h),5.29(m,1h),4.44-4.24(m,3h),2.72-2.49(m,8h)。
实例6阿糖胞苷-丁二酸单酯前药制备(前药6)
将己二酸0.44g(3mmol)溶于15ml无水二氧六环中，加入0.25g(2.5mmol)三乙胺后，滴加二氯亚砜0.28g(2.4mmol)，滴毕抽真空氮气保护，110℃回流4h，减压浓缩反应液得到淡黄色的油状物，用10mldmf复溶。加入阿糖胞苷0.73g(3mmol)，另在室温条件下滴加三乙胺0.19g(1.8mmol)，滴毕抽真空氮气保护，反应过夜，tlc监测反应完全。减压浓缩反应液得到红棕色的油状物。柱层析得到白色固体，收率35％。ms(esi)：m/z＝372.1[m+h+]。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ7.47(d,j＝7.3hz,1h),7.33–6.89(m,3h),6.08(d,j＝3.9hz,1h),5.67(dd,j＝11.6,7.4hz,1h),4.36–4.13(m,2h),4.08–3.77(m,4h),3.59(d,j＝6.1hz,1h),3.17(s,2h),2.53(t,j＝6.4hz,2h),2.50(s,2h)。
实例7吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药的稳定性和体外释放
按照一级动力学求算在不同ph磷酸缓冲液条件下和组织匀浆中前药降解的半衰期(t1/2)，结果见表1。
表1.前药1-5在不同ph磷酸盐缓冲液和组织匀浆中的稳定性。
由上表可知吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药在不同ph值磷酸盐缓冲液(1.2和6.8)中具有良好的稳定性，预示着前药能够对抗胃肠道环境，不会发生降解。可能是由于酰胺键良好的化学稳定性的缘故。在肠匀浆中，所有前药的半衰期都超过了3h，表明前药能够以完整的分子结构跨过肠道上皮进入血液中。与缓冲液稳定性相比，前药在肝匀浆和血浆中的半衰期略有下降，表明肝脏和血液可能是前药的活化部位。值得注意的是，在肝匀浆、血浆中和ph7.4磷酸盐缓冲液中前药的半衰期相近，基本在2-4h以内。而我们之前的研究表明，吉西他滨-丁酸前药的半衰期超过了30h，说明酰胺键对于酶很稳定。因此，我们可以推断吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药的活化机制为化学激活。
为了考察不同链长脂肪酸连接桥触发释药的能力，在考察前药1-5的稳定性的过程中，我们同时测定了前药和吉西他滨的量，结果如图1所示，随着时间的延长，吉西他滨的量逐渐增加，而前药1-5在ph6.8磷酸盐缓冲液中非常稳定，几乎不发生降解。结果表明前药经化学激活活化释放吉西他滨，而且释放吉西他滨的速度随着脂肪酸链的延长而减慢，说明脂肪链的长短能够调整前药在体内的释药速度，这对于口服前药设计来说意义深远。
实例8吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药的细胞摄取
为了构建高表达mct1的细胞模型，我们将培养7天的caco-2细胞加入2mm的丁酸继续培养7天。
我们以丁酸培养的caco-2细胞为模型，考察有改变ph条件下细胞对前药的摄取。由图2a所示，与有ph7.4相比，在ph6.8条件下，吉西他滨-丁二酸单酯前药和吉西他滨-丁二酸双酯前药的摄取量升高了1.6倍，说明吉西他滨-二元脂肪酸酯前药的caco-2细胞摄取是h+依赖的。同时我们考察了不同温度下前药的细胞摄取，如图2b所示，与37℃条件下细胞摄取相比，前药1-5在4℃时的摄取明显降低，而吉西他滨略有降低，但与37℃相比没有统计学差异，说明前药1-5的caco-2细胞摄取是温度依赖的。综上所述吉西他滨-二元脂肪酸酯前药的caco-2细胞摄取是主动转运过程。
为了考察前药是否经mct1转运体摄取进入细胞，我们以丁酸作为竞争性底物，将前药1-5和丁酸共同孵育于caco-2细胞，考察丁酸对前药摄取的影响，丁酸的浓度为1mm(基于丁酸的km选择)。由图3a可知，当丁酸加入后，前药1-5的caco-2细胞摄取量被明显抑制，与未加入丁酸组相比降低了1.3-3倍，而吉西他滨的细胞摄取没有变化。同时将多维生素转运体(smvt)的特异性底物生物素与前药溶液共同孵育细胞，考察smvt对前药摄取的贡献，结果表明大浓度的生物素不能减少前药的细胞摄取，说明smvt转运体对前药的摄取没有贡献(图3b)。其次，我们以槲皮素(mct1的典型底物)为已知底物，将前药1-5与之共孵育(50μm)，考察不同前药对槲皮素的摄取影响。结果如图3c所示，随着前药的加入，槲皮素的摄取呈不同程度的减低(43-61％)。结果说明前药能够和槲皮素竞争性与mct1结合，降低槲皮素的细胞摄取。
以上结果提示我们，前药1-5的细胞摄取机制为h+依赖，温度依赖，mct1转运体介导的主动转运。
实例9吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药对mct1转运体亲和性
如图4所示，随着前药1-5前药浓度的逐渐升高，caco-2细胞对前药的摄取也相应增加，当前药的浓度接近1mm时接近饱和，呈现出典型的主动转运特征，但不同的前药的细胞摄取量存在明显差别，如前药2(连接桥为6个碳)的摄取量较其它前药(前药1、3、4和5，连接桥分别为4、8、10个碳以及双酯前药)高出1.3-2.5倍。为了进一步探究前药2高细胞摄取的原因，我们利用eadie-hofstee曲线计算各前药摄取的km以及vmax值。结果表明，五个前药的最大转运速度vmax彼此接近(20.25-37.82μmol/mgprotein/min)，但km相差较大，其中前药2的km(0.61mm)较其它前药低了1.5-3.0倍。米氏方程所描述的动力学规律是酶促反应(转运体介导转运)的一项基本规律，不同的转运体，不同的底物，其反应动力学过程中具有不同的km值，其值越小，它表征转运体的转运能力越强，其与底物的亲和性越好。而最大转运速度vmax主要取决于转运体的表达水平，表达水平越高，其转运速度越大，随体内外评价模型和培养条件不同有很大的差异性。前药2的亲和性在所有前药中最高，而细胞摄取量也是最高，提示我们高亲和性提高了细胞摄取量。
从结构分析，四个前药的差别仅在脂肪酸连接桥的长度，随着连接桥的延长，亲和性及细胞摄取都呈现了先增加后减低的特点，而拥有六碳连接桥的前药2与转运体的亲和性最高，细胞摄取量也最多。以上结果提示我们药物和载体之间的脂肪酸连接桥对于提高前药与转运体的亲和性以及细胞摄取起到至关重要的作用。以上结果表明，药物和载体间的脂肪酸连接桥有助于调整前药与蛋白的相互作用，进而提高亲和性和转运体的转运。
实例10吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药的细胞转运
选取培养21天后合格的caco-2细胞进行转运实验，将前药1-5和吉西他滨加入到caco-2细胞膜供给侧，测定ap-bl(图5a)和bl-ap侧的渗透率(图5b)。结果表明，在ap-bl转运过程中，吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药的膜渗透率明显高于吉西他滨(高出30-54倍)，结果说明吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药可有效提高吉西他滨的膜渗透性。在bl-ap转运过程中，吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药与吉西他滨的膜透性差别不大，说明吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药经主动转运跨膜。另将含有或不含有丁酸或生物素的前药加入到caco-2细胞膜供给侧，测定ap-bl膜渗透率，考察mct1特异性底物丁酸对前药跨膜转运的影响。实验结果显示(图5c)，丁酸明显抑制细胞对吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药的跨膜转运(降低1.2-4.0倍)，而生物素并未影响吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药跨膜转运(图5d)。由此可得出结论吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药是mct1的底物，经mct1转运跨膜。另外，在吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药中，膜渗透性随着脂肪酸连接桥的延长呈现先增加后减低的趋势，说明脂肪酸连接桥可以影响前药的膜渗透性。拥有6碳连接桥的前药2的膜渗透性最高，是其它前药的1.1-2倍，分析原因可能是6碳的脂肪酸链使药物与转运体的结合最强，从而提高mct1转运体对吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药的转运，这与细胞摄取实验结果一致。
实例11吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药的药动学
以sd大鼠为模型，口服吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药(1-5)及吉西他滨，同时测定血浆中前药和母药的浓度，根据测定的浓度分别进行了药-时曲线的绘制及相应药动学参数的计算(表2)。为了方便比较不同前药间的药动学差异，我们将血浆中前药及母药的单位统一成μm。结果如图6所示，灌胃后吉西他滨及其前药达峰时间均小于30min，说明前药和吉西他滨快速由肠道吸收入血。相对于吉西他滨，吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药的药-时曲线下面积(auc0-24)明显高于吉西他滨。由静脉吉西他滨的数据计算前药的口服生物利用度，前药1-5相比吉西他滨(3.2％)的口服生物利用度均显著提高(提高1.5-8.8倍)，表明吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药显著提高吉西他滨的口服吸收。另外，吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药的血浆半衰期(t1/2)和吉西他滨相比提高了3倍。表明吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药能提高吉西他滨的稳定性。结果提示我们好的胃肠道稳定性和膜渗透性能显著提高吉西他滨的生物利用度。相比之下，由于差的膜渗透性和胞嘧啶脱氨酶的作用使吉西他滨的口服生物利用度很低。
表2.吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药主要药动学参数。
另外为了考察mct1转运体是否介导前药的转运，将丁酸与前药1同时口服进行药动学研究，考察丁酸对前药大鼠口服吸收的影响。结果如图7所示，相对于前药1，丁酸能显著降低前药2的auc0-24，降低了1.6倍。说明吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药经mct1转运体介导转运进入循环系统，此研究结果与细胞实验结果一致。值得注意的是，随着前药脂肪酸连接桥的延长，吉西他滨-二元脂肪酸单酯前药的口服生物利用度呈现先升后降的特点，拥有6个碳的前药2口服生物利用度最高，提示我们前药结构中的脂肪酸连接桥通过调节前药与转运体的亲和性来增加摄取和转运，这个规律和细胞摄取和转运的结果相一致。而且前药的半衰期也随着脂肪酸链的延长而增加，进一步表明脂肪酸连接桥能够调整前药的释放速度，这与体外稳定性结果一致。
实例12阿糖胞苷-丁二酸单酯前药(前药6)的稳定性和体外释放
按照一级动力学求算在不同ph磷酸缓冲液条件下和组织匀浆中前药降解的半衰期(t1/2)，结果见表3。
表3.前药在不同ph磷酸盐缓冲液和组织匀浆中的稳定性。
由上表可知阿糖胞苷-丁二酸单酯前药在不同ph值磷酸盐缓冲液(1.2和6.8)中具有良好的稳定性，预示着前药能够对抗胃肠道酸、碱环境，不会发生降解。可能是由于酰胺键良好的化学稳定性的缘故。在肠匀浆中，前药的半衰期都超过了3h，表明前药能够以完整的分子结构跨过肠道上皮进入血液中。与缓冲液相比，前药在肝匀浆和血浆中的半衰期略有下降，表明肝脏和血液可能是前药的活化部位。值得注意的是，在肝匀浆、血浆中和ph7.4磷酸盐缓冲液中前药的半衰期相近，基本在2.9-3.5h以内。结合我们的前期研究，可以推断阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的活化机制为化学激活。与吉西他滨-二元脂肪酸单酯的结果相似。
在考察前药的稳定性的过程中，同时测定了前药和阿糖胞苷的量，结果如图8所示，随着时间的延长，阿糖胞苷的量逐渐增加，而前药在ph6.8和1.2磷酸盐缓冲液中非常稳定，几乎不降解。结果表明前药经化学激活活化释放阿糖胞苷。说明丁二酸能够快速触发阿糖胞苷释放，这对于口服前药设计来说意义深远。
实例13阿糖胞苷-丁二酸单酯前药(前药6)的细胞摄取
为了构建高表达mct1的细胞模型，我们将培养7天的caco-2细胞加入2mm的丁酸继续培养7天。
我们以丁酸培养的caco-2细胞为模型，考察有改变ph条件下细胞对前药的摄取。由图9a所示，与有ph7.4相比，在ph6.8条件下，阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的摄取量升高了1.3倍，说明阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的caco-2细胞摄取是h+依赖的。同时我们考察了不同温度下前药的细胞摄取，如图9b所示，与37℃条件下细胞摄取相比，阿糖胞苷-丁二酸单酯前药在4℃时的摄取明显降低，而阿糖胞苷与37℃相比没有统计学差异，说明阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的caco-2细胞摄取是温度依赖的。综上所述阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的caco-2细胞摄取是主动转运过程。
为了考察前药是否经mct1转运体摄取进入细胞，我们以丁酸作为竞争性底物，将阿糖胞苷-丁二酸单酯前药和丁酸共同孵育于caco-2细胞，考察丁酸对前药摄取的影响，丁酸的浓度为1mm(基于丁酸的km选择)。由图10a可知，当丁酸加入后，阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的caco-2细胞摄取量被明显抑制，与未加入丁酸组相比降低了1.5倍，而阿糖胞苷的细胞摄取没有变化。同时将smvt转运体的特异性底物生物素与前药溶液共同孵育细胞，考察smvt转运体对前药摄取的贡献，结果表明大浓度的生物素不能减少前药的细胞摄取，说明smvt转运体对前药的摄取没有贡献(图10b)。其次，我们以槲皮素(mct1的典型底物)为已知底物，将的阿糖胞苷-丁二酸单酯前药与之共孵育(50μm)，考察前药对槲皮素的摄取影响。结果如图10c所示，随着前药的加入，槲皮素的摄取被抑制(减低35％)。结果说明前药能够和槲皮素竞争性与mct1结合，降低槲皮素的细胞摄取。
以上结果提示我们，阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的细胞摄取机制为h+依赖，温度依赖，mct1转运体介导的主动转运。
实例14阿糖胞苷-丁二酸单酯前药(前药6)的细胞转运
选取培养21天后合格的caco-2细胞进行转运实验，将阿糖胞苷-丁二酸单酯前药和阿糖胞苷加入到caco-2细胞膜供给侧，测定ap-bl(图11a)和bl-ap侧的渗透率(图11b)。结果表明，在ap-bl转运过程中，阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的膜渗透率明显高于阿糖胞苷(高出7倍)，结果说明阿糖胞苷-丁二酸单酯前药可有效提高阿糖胞苷的膜渗透性。在bl-ap转运过程中，阿糖胞苷-丁二酸单酯前药与阿糖胞苷的膜透性差别不大，说明阿糖胞苷-丁二酸单酯前药经主动转运跨膜。另将含有或不含有丁酸或生物素的前药加入到caco-2细胞膜供给侧，测定ap-bl膜渗透率，考察mct1特异性底物丁酸对前药跨膜转运的影响。实验结果显示(图11c)，丁酸明显抑制细胞对阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的跨膜转运(降低1.2倍)，而生物素并未影响阿糖胞苷-丁二酸单酯前药跨膜转运(图11d)。由此可得出结论阿糖胞苷-丁二酸单酯前药是mct1的底物，经mct1转运跨膜。这与细胞摄取实验结果一致。
实例15阿糖胞苷-丁二酸单酯(前药6)前药的药动学
以sd大鼠为模型，口服阿糖胞苷-丁二酸单酯前药及阿糖胞苷，同时测定血浆中前药和母药的浓度，根据测定的浓度分别进行了药-时曲线的绘制及相应药动学参数的计算(表4)。结果表明，灌胃后阿糖胞苷及其前药达峰时间均小于1.5h，说明前药和阿糖胞苷快速由肠道吸收入血。相对于阿糖胞苷，阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的药-时曲线下面积(auc0-24)明显高于阿糖胞苷。由静脉阿糖胞苷的数据计算前药的口服生物利用度，阿糖胞苷-丁二酸单酯前药相比阿糖胞苷的口服生物利用度均显著提高(提高2倍)，表明阿糖胞苷-丁二酸单酯前药显著提高阿糖胞苷的口服吸收。另外，阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的血浆半衰期(t1/2)和阿糖胞苷相比提高了1.7倍，表明阿糖胞苷-丁二酸单酯前药能提高阿糖胞苷的稳定性。结果提示我们好的胃肠道稳定性和膜渗透性能显著提高阿糖胞苷的生物利用度。相比之下，由于差的膜渗透性和胞嘧啶脱氨酶的作用使阿糖胞苷的口服生物利用度很低。
表4.阿糖胞苷-丁二酸单酯前药主要药动学参数。
另外为了考察mct1转运体是否介导前药的转运，将丁酸与阿糖胞苷-丁二酸单酯前药同时口服进行药动学研究，考察丁酸对前药大鼠口服吸收的影响。结果表明相对于阿糖胞苷-丁二酸单酯前药，丁酸能显著降低阿糖胞苷-丁二酸单酯前药的auc0-24，降低了1.2倍。说明阿糖胞苷-丁二酸单酯前药经mct1转运体介导转运进入循环系统，此研究结果和之前研究的结果一致。