本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及一种慢病毒cmv-cbh双启动子改造载体构建及应用。
背景技术：
：双向启动子：位于两个相邻且转录方向相反的基因之间的一段dna序列。双向启动子在真核生物基因组中广泛分布，大多数的双向启动子缺少tata盒，而具有较高的gc含量和丰富的cpg岛.双向启动子双向起始转录，且会对其双向转录的基因在共表达和稳定性表达调控中发挥一定的作用。在对生物进行转基因改良的过程中，可能需要将不止一个的外源基因转入到特定的生物体内，这些外源基因需要在各自相应的启动子序列的调控下进行表达.由于用于遗传改良的启动子数量有限，所以在将多个基因转入生物体内时经常重复地使用一个特定的启动子或序列相近的启动子.这样虽然可以实现同时转入多个基因的愿望，但这种载体的构建费时费力.另一方面，因为引入的启动子序列同源，即使两个启动子之间只有90bp的序列同源，导入生物体内就会引起基因表达“共抑制”现象，导致基因转录的沉默，这是在转基因技术中所要面临的困难和挑战.由于双向启动子能够在两个方向上指导mrna的生成，这样在利用双向启动子进行转基因时，可以在其两端融合某生理或生化过程的两个基因或多个基因及其组合.这不仅避免了不同基因引入时的繁琐步骤，减少了引入受体生物中的启动子数目，更不必担心引入生物体内的启动子之间序列同源而导致的转基因沉默现例子并不多，并且子进行转基因研究的重点仍然放在双向启动子子进行转基因研究的重点仍然放在双向启动子的应用为解决转基因技术难题提供了可能，在基因工程的应用为解决转基因技术难题提供了可能，在基因工程研究和应用领域具有不可估量的作用，正成为转基因技术研究的新领域。技术实现要素：下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：1.本发明的内容是构建共用增强子反向双启动子慢病毒表达载体2.本发明采用的技术方案是：一种慢病毒cmv-cbh双启动子改造载体构建及应用。所述慢病毒载体plenti-cmv-3flag-egfp-tcbh-mcherry-t2a-puro由pcr扩增得到tcbh片段替换plenti-cmv-3flag-egfp-pgk-mcherry-t2a-puro载体中pgk得到。3.本发明还涉及构建所述的慢病毒载体的方法，所述方法包括：(1)片段tcbh的扩增：以质粒px330a-1x2为模板，设计特异性引物扩增获得。所述扩增片段tcbh的引物序列如下：tcbh-f:5'-acgagctgtacaagtctagataatcgaggtgagccccacgt-3'tcbh-r:5'-tgctcaccatggtaagcttgggctgcaggtccaacctgaaaaaaagtgatttc-3'(2)慢病毒载体plenti-cmv-3flag-egfp-tcbh-mcherry-t2a-puro的构建：用xbai和bspmi酶切plenti-cmv-3flag-egfp-pgk-mcherry-t2a-puro载体回收大片段和tcbh片段进行无缝克隆得到。4.本发明的有益效果主要体现在：本发明构建的慢病毒载体具有双启动子—cmv和cbh，以绿色荧光蛋白egfp和mcherry作为报告基因，可以用现有的荧光显微镜装置检测，为进一步研究慢病毒载体感染细胞的感染效率提供了实验基础。附图说明附图1:慢病毒载体plenti-cmv-3flag-egfp-tcbh-mcherry-t2a-puro质粒图谱；附图2:addgene采购的multiplexcrispr/cas9assemblysystemkitprotocol中的px330a-1x2质粒图谱；附图3:慢病毒载体plenti-cmv-3flag-egfp-pgk-mcherry-t2a-puro质粒图谱；附图4:片段tcbh扩增结果图；m:dnamarker：dl2000，lane1:pcramplificationgoftcbh；附图5:质粒plenti-cmv-3flag-egfp-pgk-mcherry-t2a-puroxbai/bspmi双酶切凝胶回收结果；m:dnamarker1kb,lane1:digestionofplasmidplenti-cmv-3flag-egfp-pgk-mcherry-t2a-puro。具体实施方式以下涉及的化学试剂和生物制品，如未特别说明都为商业化产品。另外，其他未注明的实验操作按照常规分子生物学操作方法进行。下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1.构建plenti-egfp-2a-puro-cmv-tcbh慢病毒表达质粒1.1tcbh片段扩增：以载体px330a-1x2为模板，以tcbh-f和tcbh-r引物(seqidno.1～2)对进行pcr获得565bp的tcbh片段，切胶回收；pcr体系如下：质粒模板(100ng/μl)2μlprimerstarpolymerase(3.5u/μl)0.5μldntps(10mm；2.5mmeach)4μl2xgcbuffer25μltcbh-f(10pmol/μl)1μltcbh-r(10pmol/μl)1μlddh2o16.5μlpcr反应条件：1.2使用xbai和bspmi酶切plenti-cmv-3flag-egfp-pgk-mcherry-t2a-puro质粒，2h，37℃：酶切体系如下：2μg(2μl)plenti-cmv-3flag-egfp-pgk-mcherry-t2a-puro1μlxbai(neb)1μlbspmi(neb)5μlnebuffer3.141μlddh2o50μl合计酶切后得到525bp和9244bp的片段，使用胶回收试剂盒纯化酶切后的9244bp的质粒大片段；1.3扩增得到的片段tcbh与酶切后的载体大片段无缝克隆成目的载体plenti-cmv-3flag-egfp-tcbh-mcherry-t2a-puro。体系如下：11.3ng插入片段(tcbh)92.4ng线性化载体(plenti-cmv-3flag-egfp-pgk-mcherry-t2a-puro)1μl无缝克隆酶4μl5x反应bufferupto20μlddh2o混匀后在37℃孵育30分种，然后转移到冰上放置5分钟。将连接后的质粒转化至感受态细胞dh5α中，均匀涂至lb固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。1.4挑取几个单菌落扩大培养并质粒小提。1.5鉴定质粒构建成功。测序正确的质粒即为所构建的目的质粒，命名为plenti-cmv-3flag-egfp-tcbh-mcherry-t2a-puro。2.转染效率验证用含10％胎牛血清的高糖dmem培养基于5％co2，37℃恒温培养293t细胞(购于美国atcc细胞库)。取对数期细胞以1×105/孔接种到24孔板培养。待细胞融合度达到70％～80％时更换成opti-mem培养基，1小时后将plenti-cmv-3flag-egfp-tcbh-mcherry-t2a-puro质粒0.8μg经lipo2000试剂，转染到293t细胞中，转染48小时候，荧光显微镜下观察转染效果。序列表<110>和元生物技术(上海)股份有限公司<120>一种慢病毒cmv-cbh双启动子改造载体构建及应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>41<212>dna<213>人工序列(artificalsynthesis)<400>1<210>2<211>53<212>dna<213>人工序列(artificalsynthesis)<400>2<210>3<211>512<212>dna<213>人工序列(artificalsynthesis)<400>3<210>4<211>9769<212>dna<213>人工序列(artificalsynthesis)<400>4<210>5<211>9774<212>dna<213>人工序列(artificalsynthesis)<400>5当前第1页12