本发明属于生物技术领域，特别是干细胞工程领域。具体涉及一种人诱导多能干细胞的制备方法。
背景技术：
干细胞不但可以产生或分泌大量的生物活性因子，而且干细胞内也含有丰富的生物活性物质，这些干细胞生物活性因子或物质可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞等。例如干细胞可以产生干细胞生长因子(scf)、神经生长因子(ngf)、基质细胞源性生长因子(sdf)、血管内皮细胞生长因子(vegf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、胰岛素样生长因子(igf)、表皮生长因子(egf)、白介素-6与白介素-7(il-6与il-7)、巨核细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素(ifn)等因子，这些细胞因子具有促进细胞增殖、分化、抗凋亡等功能；干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如igg、iga、igm、igd、ige等，可以抵御或修复自身和外界因素对机体细胞造成的损伤。因此，利用干细胞分泌产生的生物活性因子或干细胞内的生物活性物质激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。
2006年，日本京都大学yamanaka(山中伸弥)教授所率领的研究小组筛选出了4个在胚胎干细胞或肿瘤细胞中高表达的基因转录因子(oct4/sox2/klf4/c-myc)，并利用逆转录病毒载体将这些因子转染到小鼠成纤维细胞中。通过这些因子在受体细胞内过量表达，诱导成纤维细胞去分化，使成体细胞重编程为多能干细胞，并将其定义为诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，ips)。诱导多能干细胞功能几乎和胚胎干细胞一样，表达胚胎干细胞的各种表面标记，可以分化为各种组织细胞，不受免疫排斥和伦理学等限制，在组织工程及修复方面显示出了独一无二的优势。
人类牙齿拥有两套系统，掉了乳牙才替换为恒牙，人体别的器官都从一而终，脱落的乳牙中包含着丰富的细胞资源。即使医学和生物学高度发达的今天，脱落的乳牙并没有充分利用，造成了极大的浪费。近几年，有报道尝试从脱落的乳牙中分离干细胞(如牙髓干细胞(dpsc)、牙周韧带干细胞(pdlsc)和根尖乳头干细胞(scap))，为后续进一步诱导分化产生牙齿提供了可行性。
端粒酶能以自身rna为模板，合成端粒重复序列加至新合成的rna链末端，从而防止染色体末端丢失及解决末端复制难题。在端粒酶的3个亚基中，tert是端粒酶活性的催化亚基。由于正常体细胞中几乎无tert表达，因而这些细胞无端粒酶活性，细胞随有丝分裂不断缩短，最后衰老死亡。虽然端粒酶适量表达可延长细胞寿命，但过量表达又是肿瘤细胞无限增殖的重要原因之一。
技术实现要素：
针对现有技术中的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种能够充分利用人类脱落的乳齿制备诱导多能干细胞的方法。本发明所述方法，尽可能提取了乳齿中全部细胞成分，对其进行充分利用。另外，本发明通过转入端粒酶rna的方式瞬时表达端粒酶，延长细胞寿命。
具体而言，本发明提供了1、一种人乳齿细胞诱导重编程的方法，包括：
(1)分离乳齿细胞；
(2)培养乳齿细胞
(3)向乳齿细胞中转入编码oct4、sox2、c-myc和klf4四种因子的载体；
(4)转入端粒酶rna，瞬时表达端粒酶；
(5)多能性鉴定。
本发明所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述步骤(1)包括分离牙髓细胞和牙本质细胞。
本发明所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于分离牙髓细胞包括，在牙釉质骨质分界处划出深达牙髓腔的凹槽，分裂牙齿，用小镊子取出牙髓组织至于hanks液中，同时用hanks液冲洗牙髓腔合并至含牙髓组织的hanks液中，酶眼科剪剪碎，加入终浓度2mg/ml的中性蛋白酶ii和0.5mg/ml的i型胶原酶处理15min，反复吹打，加入含5％bsa的hanks液终止反应，过金属网筛得牙髓细胞。
本发明所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于将除掉牙髓的乳齿组织破碎至平均粒径50-200目，加入终浓度3mg/ml的中性蛋白酶i和0.25mg/ml的胰蛋白酶处理30min，反复吹打，加入含5％bsa的hanks液终止反应，取上清离心后重悬得牙本质细胞。
本发明所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述步骤(2)包括将分离的牙髓细胞和牙本质细胞混合在含有10％胎牛血清的1640培养液中进行原代培养，每24h换液，72h后消化继代。
本发明所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述步骤(3)包括将携带oct4、sox2、c-myc和klf4四种因子的逆转录病毒载体及病毒包装质粒共转染至原代或继代培养的乳齿细胞。
本发明所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述步骤(4)包括：将体外合成的端粒酶催化亚基mrna分子转入步骤(3)制备的细胞，使其瞬时表达端粒酶，接种于鼠胚胎成纤维细胞上，加入人胚胎干细胞培养基进行培养。
本发明所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述端粒酶mrna分子的序列根据已知的端粒酶催化亚基cdna分子确定，包括编码区5’端的cap结构以及3’端的poly(a)结构。
本发明所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述多能性鉴定包括碱性磷酸酶染色试验和畸胎瘤形成试验。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
首先，由于脱落的乳齿来自人类童年阶段，因此乳齿源细胞具有较高的重编程能力。以脱落乳齿源细胞代替成体成纤维细胞、间充质干细胞等作为出发细胞制备诱导多能干细胞，不仅无创伤而且逆分化效果好。
其次，本发明充分利用了乳齿源细胞，不仅利用了乳齿牙髓细胞还利用了牙本质中的细胞，这些天然状态下共存的细胞由于存在相互作用，因此体外培养过程中，共存时也更有利于生长的增殖。
最后，正常的细胞端粒长度不足，而传统的过表达方式又容易导致癌变，本发明直接转入mrna合成端粒酶，既实现了端粒的延长又避免了端粒酶过表达带来的风险。
附图说明
图1mef饲养层细胞
贴壁的mef饲养层细胞呈纺锤形。
图2乳齿细胞制备的ips
诱导后三周形成胚胎干细胞样克隆球，细胞克隆中大量近圆形的细胞聚集，形态明显不同于克隆球外贴壁的mef饲养层细胞。
图3畸胎瘤切片
a类神经管组织；b类软骨组织；c类腺体组织。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例一人乳齿细胞的制备
取自然脱落或拔出的人类乳齿，分离牙髓细胞。具体操作如下在牙釉质骨质分界处划出深达牙髓腔的凹槽，分裂牙齿，用小镊子取出牙髓组织至于hanks液中，同时用hanks液冲洗牙髓腔合并至含牙髓组织的hanks液中，酶眼科剪剪碎，加入终浓度2mg/ml的中性蛋白酶ii和0.5mg/ml的i型胶原酶处理15min，反复吹打，加入含5％bsa的hanks液终止反应，过金属网筛得牙髓细胞。
将除掉牙髓的乳齿组织破碎至平均粒径50-200目，加入终浓度3mg/ml的中性蛋白酶i和0.25mg/ml的胰蛋白酶处理30min，反复吹打，加入含5％bsa的hanks液终止反应，取上清离心后重悬得牙本质细胞。
将分离的牙髓细胞和牙本质细胞混合在含有10％胎牛血清的1640培养液中进行原代培养，每24h换液，72h后消化继代；连续继代培养1-3代扩增细胞。
实施例二人乳齿细胞的诱导重编程
将购买的鼠胚胎成纤维细胞以1×104cfu/cm2的浓度接种于细胞培养瓶中，加入含10％胎牛血清的1640完全培养基，放置于37℃、5％co2培养箱中进行培养，隔夜换液，倒置显微镜观察，直至细胞融合度约为70-75％时备用(图1)。
根据山中伸弥的方法，在逆转录病毒载体中插入oct4、sox2、c-myc和klf4四种因子的表达盒，将重组病毒在于与病毒包装载体共转染293t细胞，包装产生慢病毒，收集病毒液进行滴度测定。将病毒液按1:40的moi接种继代培养1-3代的人乳齿细胞，37℃、5％co2孵育30min后，加入含10％胎牛血清的1640完全培养基，继续培养过夜，将细胞用胰酶消化，重悬后加入到新鲜制备的、融合至70-75％的mef细胞中，加入人胚胎干细胞培养基继续培养。隔日换液，倒置显微镜观察，逐渐形成类似人胚胎干细胞样的细胞克隆团(图2)。
实施例三人乳齿源ips的验证
将人乳齿ips传代分瓶，取一瓶传代培养的人类诱导多能干细胞，吸弃之前的人类胚胎干细胞完全培养基，用hanks液洗涤2遍，加入4％的多聚甲醛(pfa)固定2分钟，清洗后加入碱性磷酸酶染色液，孵育15min后，hanks液洗涤2遍，倒置显微镜下镜检观察，细胞克隆团呈现蓝紫色深染，而细胞团周边纤维状的饲养层细胞未着色，表明细胞克隆团中的细胞处于未分化状态。
取1×105cfu的ips细胞注射到nod/scid鼠股内侧，四周后可见有肿块生长，8周后摘取肿块，组织切片he染色，显微镜下观察，结果如图3所示。图3组织切片结果表明本发明制备的ips细胞同时具有形成内、中、外三个胚层组织的能力。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。