本发明属于天然高分子化学领域，特别涉及一种再生细菌纤维素微球及其制备方法。
背景技术：
细菌纤维素(bacterialcellulose,bc)是微生物细胞外分泌的可再生天然高分子聚合物，它是由β-d-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键合成的直链。尽管其基本结构与植物纤维素相同，但仍具备许多植物纤维素无法比拟的的特性，如高结晶度、高持水性、良好的生物相容性、高抗张强度及弹性模量等(shahn,ul-islamm,khattakwa,etal.2013,98(2):1585-1598.)。近年来，高分子微球因其特殊的尺寸和结构使其在多种领域具有广阔的应用前景，相关的研究报道也越来越多。纤维素微球作为生物高分子微球中的一种，与化学合成高分子微球相比具有原料丰富且再生、多孔性、无毒、优良的生物相容性等优势，这种微球在药物缓释载体、酶载体、生物活性物质的包埋等领域得到广泛应用，还可以用于吸附剂、色谱柱填料等。常用的制备纤维素微球使用的原料是植物纤维素(如棉花、亚麻、竹纤维素、木屑纤维素等)，采用张俐娜等人的绿色纤维素溶剂溶解纤维素(cn101250267)，然后采用反向悬浮和程序降温法、喷雾干燥法、微流控技术、高压静电喷射技术、层层组装技术等来制备纤维素微球来满足更苛刻和尖端的应用需求。然而，这些方法制备的微球易生物降解，机械强度、化学稳定性难以通过改变制备参数进行调节，影响了其应用领域的拓展。胡阳等人通过旋转发酵培养的方式制备了细菌纤维素微球(cn103695499)，但是其机械强度较弱且多数情况下制备的微球不规则，限制了其应用范围。
技术实现要素：
本发明解决了现有技术中的纤维素微球易降解、机械强度不高、化学稳定性不好，且难以通过改变制备参数进行调节的技术问题。
按照本发明的第一方面，提供了一种再生细菌纤维素微球该细菌纤维素微球为实心微球；所述细菌纤维素微球通过交联剂形成细菌纤维素分子内和分子间的化学交联；构成所述细菌纤维素微球的再生细菌纤维素为无规则的膜形态，该细菌纤维素的结晶形态为ⅱ型纤维素。
优选地，所述细菌纤维素微球分散均匀，直径为50μm～800μm。
按照本发明的另一方面，提供了一种再生细菌纤维素微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)细菌纤维素溶液的制备：将细菌纤维素溶于-20℃～-10℃的碱与尿素的混合水溶液或碱与硫脲的混合水溶液中，得到细菌纤维素均相溶液；
(2)再生细菌纤维素微球的制备：将步骤(1)得到的细菌纤维素均相溶液分散于-10℃～0℃的含有2～4wt％乳化剂的有机溶剂中，300rpm～800rpm搅拌0.5h～2h完成乳化，然后加入交联剂进行交联，清洗后即得再生细菌纤维素微球。
优选地，步骤(1)所述的细菌纤维素均相溶液中细菌纤维素的浓度为2～6wt％；步骤(1)所述的碱/尿素水溶液中碱的质量分数为5～10wt％，尿素的质量分数为8～16wt％；步骤(1)所述的碱/硫脲水溶液中碱的质量分数为5～10wt％，硫脲的质量分数为8～16wt％。
优选地，步骤(2)所述的有机溶剂为正庚烷、正己烷、石油醚或液体石蜡；步骤(2)所述细菌纤维素均相溶液与有机溶剂的体积比为1:(4～8)。
优选地，步骤(2)所述交联剂为环氧氯丙烷、戊二醛、甲醛或1,4-丁二醇二缩水甘油醚；步骤(2)所述交联的过程为：将体积分数为3％～6％的交联剂加入至乳化后的细菌纤维素均相溶液中，升温至40℃～65℃交联3h～8h。
优选地，步骤(2)所述的清洗过程为：将交联后的产物静置分层，取下层再生细菌纤维素微球，分别用有机溶剂和去离子水离心洗涤。
按照本发明的另一方面，提供了如权利要求1-2任一项所述的再生细菌纤维素微球在电子器件、色谱分离以及生物医用领域的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明以碱/尿素或碱/硫脲水溶液为溶剂，在低温条件下溶解后，采用改进的反向悬浮交联法制备再生细菌纤维素微球。该发明制备的细菌纤维素微球保留了细菌纤维素原有的高分子量和高持水性、良好的生物相容性、高力学强度等，制备出的微球成球形良好且分散均匀，可以通过细菌纤维素浓度、油水相比例、乳化剂浓度及搅拌转速和交联剂浓度，实现球形尺寸的可调控性，而且可以通过改变交联剂含量和交联时间控制微球的机械强度及降解性能。
(2)制备的细菌纤维素微球形貌规整，分散均匀，机械强度高。通过化学交联增加了微球的化学稳定性，延长了细菌纤维素微球的生物降解时间。通过化学交联后，交联剂与构成纤维素的基本结构单元的葡萄糖上的羟基形成分子内和分子间的交联，使糖苷键通过化学键进行连接，因此，在酶或其它化学试剂存在的情况下，糖苷键不易降解，使得本发明所述细菌纤维素微球不易降解。
(3)本发明在制备微球过程中，交联后采用有机溶剂和去离子水洗涤，使得细菌纤维素再生，操作简单且成本较低。而现有技术中使用酸液如硫酸、hcl实现再生，不但试剂昂贵且后续还得清洗除去酸液，过程复杂。
(4)在制备细菌纤维素微球过程中添加石墨烯、碳纳米管等功能材料，或者成球后进行表面化学修饰，赋予纤维素微球的多功能性，使其可负载药物，或者与功能分子共价连接，拓宽其应用领域。
附图说明
图1(a)是实施例1所制备的细菌纤维素膜；图1(b)是再生细菌纤维素扫描电镜(sem)照片。
图2(a)和图2(b)是实施例1制备的未交联细菌纤维素微球光镜图。
图3(a)是实施例1所制备的经过交联的细菌纤维素微球光镜图；图3(b)是实施例1所制备的经过交联的细菌纤维素微球的直径分布图。
图4是实施例1所制备的经过交联的细菌纤维素微球sem照片。
图5是实施例1所制备的细菌纤维素膜及再生细菌纤维素的x射线衍射(xrd)图谱。
图6(a)是实施例2所制备的经过交联的细菌纤维素微球光镜图；图6(b)是实施例2所制备的经过交联的细菌纤维素微球直径分布图。
图7是实施例2所制备的经过交联的细菌纤维素微球sem照片。
图8是实施例2所制备的细菌纤维素膜及交联的细菌纤维素微球的傅里叶变换红外光谱(ftir)。
图9是是实施例2所制备的细菌纤维素膜及再生细菌纤维素的热重分析(tga)曲线。
图10是细菌纤维素通过交联剂环氧氯丙烷交联的示意图。
图11是细菌纤维素通过交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
本实施例一种再生细菌纤维素微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)细菌纤维素膜的制备：将葡糖木醋杆菌(atcc53582)接种于发酵培养液中(1l培养液中含有葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母粉5g、磷酸二氢钠2.7g、柠檬酸1.5g)，30℃静态培养5～7天后，将获得的细菌纤维素膜分别用碱液和去离子水清洗直至细菌纤维素膜呈透明状，ph呈中性，吸干水分，冷冻干燥至恒重。
(2)细菌纤维素溶液的制备：将0.45g剪碎的细菌纤维素膜加入到15ml预冷至-12℃的naoh/尿素水溶液中(naoh：8wt％，尿素：14wt％，水：78wt％)，低速搅拌3h，然后放入冰箱中预冷至-15℃，适当转速搅拌溶解，得到澄清透明的3wt％细菌纤维素溶液。
(3)细菌纤维素微球的制备：在250ml三口烧瓶中加入72ml的液体石蜡溶液和2.16gspan-80，预冷至-8℃且搅拌预乳化40min，然后缓慢滴加9ml细菌纤维素溶液(细菌纤维素溶液与液体石蜡体积比为1：8)，以550rpm搅拌乳化60min后形成反向悬浮体系。加入3.24ml的环氧氯丙烷，缓慢升温至60℃交联4h。获得的下层微球先用石油醚洗涤，然后用乙醇洗涤，最后用去离子水反复清洗。细菌纤维素微球交联示意图如10所示。
sem观察结果显示，细菌纤维素膜未溶解前以纳米级的网络状纤维形态存在(附图1(a))；溶解再生后，细菌纤维素失去其纤维形态，变成了不规则的膜形态(附图1(b))，说明实施例所述法方法能够溶解细菌纤维素，破坏了纤维之前的氢键，证实了溶解的有效性。图2(a)和图2(b)是本实施例制备的未交联细菌纤维素微球光镜图，可知，水凝胶微球为透明状，球形状规则，圆整性好，微球中混有大量气泡。当交联后，微球中大量水分被挤出进入外部介质，结构更加致密，球形貌更好且不透明，表明其强度增大(见附图3(a))。使用imagej软件对光镜中的100个微球直径大小进行了统计并计算，微球的平均直径为280μm(见附图3(b))。
从附图4再生细菌纤维素微球的sem图可看出，微球结构密实，成球形良好，表面光滑平整，且微球表明没有纳米纤维素结构，说明实施例溶剂体系能有效溶解纤维素。
附图5为细菌纤维素膜及再生细菌纤维素的xrd测试结果，结果显示，细菌纤维素膜在2θ＝14.54，16.83和22.72出现了比较明显的特征峰，为纤维素ⅰ型的特征峰；再生细菌纤维素经过溶解再生后，在2θ＝22.17出现了纤维素ⅱ型的特征峰，其余的衍射峰可能是由于细菌纤维素溶解后带入的无机盐类特征峰。说明了细菌纤维素溶解再生后从纤维素ⅰ型转换为ⅱ型，是分子间和分子内氢键的断裂和重新形成的结果。
实施例2
本实施例一种再生细菌纤维素微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)细菌纤维素膜的制备：将葡糖木醋杆菌(atcc53582)接种于发酵培养液中(1l培养液中含有葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母粉5g、磷酸二氢钠2.7g、柠檬酸1.5g)，30℃静态培养5～7天后，将获得的细菌纤维素膜分别用碱液和去离子水清洗直至细菌纤维素膜呈透明状，ph呈中性，吸干水分，冷冻干燥至恒重。
(2)细菌纤维素溶液的制备：将0.2g剪碎的细菌纤维素膜加入到10ml预冷至-20℃的naoh/尿素水溶液中(naoh：7wt％，尿素：12wt％，水：81wt％)，低速搅拌5h，然后放入冰箱中预冷至-12℃，适当转速搅拌溶解，得到澄清透明的2wt％细菌纤维素溶液。
(3)细菌纤维素微球的制备：在250ml三口烧瓶中加入42ml的正庚烷溶液和1.26gspan-80，预冷至-10℃且搅拌预乳化30min，然后缓慢滴加6ml细菌纤维素溶液(细菌纤维素溶液与正庚烷体积比为1：7)，以480rpm搅拌乳化45min后形成反向悬浮体系。加入2ml的环氧氯丙烷，缓慢升温至65℃交联3h。获得的下层微球先用石油醚洗涤，然后用乙醇洗涤，最后用去离子水反复清洗。所得再生细菌纤维素微球见图6，其平均直径为317.4μm。从附图7再生细菌纤维素微球的sem图可看出，微球结构密实，成球形良好，表面光滑平整，且微球表明没有纳米纤维素结构，说明实施例溶剂体系能有效溶解纤维素。通过ftir图谱可知，细菌纤维素交联后，原来在细菌纤维素膜中3344cm-1所代表的较宽的羟基伸缩振动吸收峰转移到更低波数(3324cm-1)，并且吸收峰强度明显减弱，说明细菌纤维素中的羟基与环氧氯丙烷反应后削弱了羟基吸收峰，同时细菌纤维素中的氢键作用力减弱。此外，交联细菌纤维素微球中在1018cm-1出现了新的ch2-o-ch2醚键吸收峰，进一步说明纤维素分子之间通过环氧氯丙烷发生了化学交联(见附图8)。由附图9的tga曲线可知，细菌纤维素和再生细菌纤维素受热行为具有相似的趋势，但是仍有很大的不同，细菌纤维素膜受热分解的初始温度为300℃左右，比再生细菌纤维素初始热分解温度250℃高出50℃，这是由于纤维素溶解再生的过程中，纤维素晶型由ⅰ型转变为ⅱ型，晶型的改变导致其热分解温度降低。此外，溶解再生的细菌纤维素在600℃下残余的物质的量明显增多，残渣量达到25％左右，而细菌纤维素膜残渣量基本为0％。出现此结果的原因是再生细菌纤维素晶型发生改变，这种晶型的纤维素在高温下更容易发生碳化反应生成难以分解的碳化焦质物。
实施例3
本实施例一种再生细菌纤维素微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)细菌纤维素膜的制备：将葡糖木醋杆菌(atcc53582)接种于发酵培养液中(1l培养液中含有葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母粉5g、磷酸二氢钠2.7g、柠檬酸1.5g)，30℃静态培养5～7天后，将获得的细菌纤维素膜分别用碱液和去离子水清洗直至细菌纤维素膜呈透明状，ph呈中性，吸干水分，冷冻干燥至恒重。
(2)细菌纤维素溶液的制备：将0.4g剪碎的细菌纤维素膜加入到20ml预冷至-9℃的naoh/硫脲水溶液中(naoh：8wt％，尿素：12wt％，水：80wt％)，低速搅拌3.5h，然后放入冰箱中预冷至-9℃，适当转速搅拌溶解，得到澄清透明的2wt％细菌纤维素溶液。
(3)细菌纤维素微球的制备：在250ml三口烧瓶中加入90ml的正己烷溶液和1.5gspan-80和0.5gtween80，预冷至-15℃且搅拌预乳化30min，然后缓慢滴加15ml细菌纤维素溶液(细菌纤维素溶液与正己烷体积比为1：6)，以500rpm搅拌乳化60min后形成反向悬浮体系。加入4.2ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚，缓慢升温至55℃交联4h。获得的下层微球先用石油醚洗涤，然后用乙醇洗涤，最后用去离子水反复清洗。所得再生细菌纤维素微球平均直径为240μm。细菌纤维素微球交联示意图11所示。
实施例4
本实施例一种再生细菌纤维素微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)细菌纤维素膜的制备：将葡糖木醋杆菌(atcc53582)接种于发酵培养液中(1l培养液中含有葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母粉5g、磷酸二氢钠2.7g、柠檬酸1.5g)，30℃静态培养5～7天后，将获得的细菌纤维素膜分别用碱液和去离子水清洗直至细菌纤维素膜呈透明状，ph呈中性，吸干水分，冷冻干燥至恒重。
(2)细菌纤维素溶液的制备：将0.9g剪碎的细菌纤维素膜加入到30ml预冷至-14℃的lioh/硫脲水溶液中(lioh：7wt％，硫脲：14wt％，水：79wt％)，低速搅拌4h，然后放入冰箱中预冷至-14℃，适当转速搅拌溶解，得到澄清透明的3wt％细菌纤维素溶液。
(3)细菌纤维素微球的制备：在250ml三口烧瓶中加入120ml的石油醚溶液和2.4gspan-80，预冷至-8℃且搅拌预乳化50min，然后缓慢滴加15ml细菌纤维素溶液(细菌纤维素溶液与石油醚体积比为1：8)，以450rpm搅拌乳化45min后形成反向悬浮体系。加入5.4ml的环氧氯丙烷，缓慢升温至60℃交联3h。获得的下层微球先用石油醚洗涤，然后用乙醇洗涤，最后用去离子水反复清洗。所得再生细菌纤维素微球平均直径为255μm。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。