本发明属于荧光检测技术领域，涉及一种荧光探针及其制备方法和在检测次氯酸盐中的应用。
背景技术：
荧光分析法因其快速响应速率、极好的选择性、高灵敏度及其操作简单，在已有的次氯酸盐检测方法中被认为是最简单和最具优势的。很多已报道的次氯酸盐识别基团多基于它的强氧化性，比如氨基硫脲类(chem.–eur.j.,2012,18(9),2700-2706；small,2014,10(17),3560-3567；talanta,2017,170,496-501)，双芳基肼类(j.mater.chem.b.,2017,5(3),525-530；chem.commun.,2014,50(63),8640-8643；j.mater.chem.b,2016,4(27),4739-4745；chem.commun.,2017,53(40),5539-5541；j.mater.chem.b,2017,5(2),289-295.),肟类(chem.–eur.j.,2009,15(10),2305-2309；chem.commun.,2011,47(43),11978-11980；sens.actuat.b:chem.,2016,236,459-465.)，硫醚与硫内酯类(j.am.chem.soc.,2013,135(36),13365-13370；inorg.chem.,2013,52(18),10325-10331；nat.protoc.,2016,11(7),1219-1228)，咪唑-2-硫酮类(anal.chem.,2016,88(12),6615-6620；angew.chem.int.ed.,2015,54(16),4890-4894.)，对甲苯酚与对氨基苯酚类(org.lett.,2014,16(13),3544-354；talanta,2016,160,470-474)，还有二芳基硫族化合物类(sens.actuat.b:chem.,2017,244,307–313；org.lett.,2013,16(2),520-523)。
大部分报道的次氯酸盐荧光探针都用于活细胞内次氯酸盐成像，只有极少数用于实际样品(自来水或商业消毒剂)中次氯酸盐含量的检测(inorg.chem.,2015,54(17),8644-8649；sens.actuat.b:chem.,2016,232,300-305；j.mater.chem.b.,2016,4(30),5101-5104.)。此外，大部分次氯酸盐荧光探针的检测环境都是在中性条件。虽然中性条件很适合生物成像，由于次氯酸的解离常数大约等于7.46(j.phys.chem.,1966,70(12),3798-3805)，大约有50％左右的次氯酸会解离成次氯酸根，而次氯酸盐和次氯酸根在这个酸度条件都很不稳定，它们都倾向于歧化成氯离子和氯酸根离子。因此，在中性条件下精确与准确检测实际样品中次氯酸盐是非常困难的。与之相反，次氯酸盐在碱性条件下却相对稳定，并且仍具有强氧化能力和反应性。这表明可以开发碱性条件下检测实际样品中的次氯酸盐的荧光探针，碱性条件下检测次氯酸盐可能更具优势。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种荧光探针及其制备方法和在检测次氯酸盐中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种荧光探针，所述荧光探针具有如下式i所示结构：
其中，r1、r2、r3、r4和r5独立地为烷基。
在本发明中，具有式i所示结构的荧光探针可以在碱性条件下检测样品中的次氯酸盐，对次氯酸盐的检测选择性高、检测灵敏，准确度高。
优选地，所述烷基为c1-c5(c1、c2、c3、c4或c5)的烷基，优选甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基中的任意一种。
在本发明中，r1、r2、r3、r4和r5可以相同也可以不同，优选r1、r2和r3为甲基，r4和r5为乙基，即优选地，所述荧光探针具有如下式ii所示结构：
另一方面，本发明提供一种如上所述的荧光探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)式iii所示香豆素衍生物与式iv所示化合物反应得到化合物cr，反应式如下：
(2)步骤(1)得到的化合物cr与对甲苯磺酰肼反应得到式i所示荧光探针，反应式如下：
在本发明中通过如上所述制备方法可以制备得到本发明所述荧光探针，在制备过程中，式iii所示香豆素衍生物中羟基邻位的烷基，可以避免二号碳原子上(即与r2连接的碳原子)的另一种成环反应，这样可减少副产物的生成。
在本发明的制备方法中关键是对前驱化合物cr及其衍生物cr-ts的设计与合成。它们需要由4个稠杂在一起的六元环组成，其中香豆素单元与氧杂蒽骨架共用同一个苯环。此外，前驱体化合物cr须在碱性条件下发射强烈荧光，且探针cr-ts须对次氯酸盐有很好的选择性，经过合成方法的设计使得合成的cr-ts具有式i所示结构，使得其对次氯酸盐的较好选择性。
优选地，步骤(1)所述式iii所示香豆素衍生物与式iv所示化合物的摩尔比为(0.8-1.3):1，例如0.8:1、0.9:1、1:1、1.05:1、1.1:1、1.15:1、1.2:1、1.25:1、或1.3:1。
优选地，步骤(1)所述反应在浓硫酸中进行。
优选地，步骤(1)所述反应的温度为85-100℃，例如85℃、88℃、90℃、93℃、95℃、98℃或100℃。
优选地，步骤(1)所述反应的时间为3-24小时，例如3小时、5小时、8小时、10小时、13小时、15小时、18小时、20小时、22小时或24小时。
优选地，步骤(2)所述化合物cr与对甲苯磺酰肼的摩尔比为1:(1.5-6)，例如1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5或1:6等。
优选地，步骤(2)所述反应在活化剂存在下进行，所述活化剂优选三氯氧磷(pocl3)或二氯亚砜(socl2)。在本发明中所述活化剂用于活化化合物cr中的羧基。
优选地，步骤(2)所述反应在缚酸剂存在下进行，所述缚酸剂优选不含活泼氢的有机碱，进一步优选三乙胺、吡啶或4-二甲氨基吡啶中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(2)所述反应为将步骤(1)得到的化合物cr在三氯氧磷中回流，而后向回流后的产物中加入三乙胺和对甲苯磺酰肼进行反应，得到式i所示荧光探针。
优选地，向回流后的产物中加入三乙胺和对甲苯磺酰肼进行反应时，反应的温度为室温。
优选地，所述向回流后的产物中加入三乙胺和对甲苯磺酰肼进行反应的时间为3-12小时，例如3小时、5小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时。
另一方面，本发明提供了如上所述的荧光探针在次氯酸盐检测中的应用。
优选地，所述荧光探针在ph6或ph10的环境下对次氯酸盐进行检测，优选在ph10的环境下对次氯酸盐进行检测。
本发明的荧光探针可以在碱性条件下对样品中次氯酸盐进行检测，具有很好的选择性和灵敏性。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的具有式i所示结构的荧光探针可以在碱性条件下检测样品中的次氯酸盐，对次氯酸盐的检测选择性高、检测灵敏，准确度高。
附图说明
图1a为在ph2-12下荧光探针cr-ts对次氯酸盐的荧光强度曲线图；
图1b为在ph2-8下荧光探针cr-ts对次氯酸盐的荧光强度曲线图；
图2a为荧光探针cr-ts在ph值6时对含有不同金属离子和其他活性氧基团或物质的荧光响应图；
图2b为荧光探针cr-ts在ph值10时对含有不同金属离子和其他活性氧基团或物质的荧光响应图；
图3a为不同ph值下(ph值6和10)荧光探针cr-ts对次氯酸盐反应的紫外吸收光谱图；
图3b为在ph值6下荧光探针cr-ts对次氯酸盐反应的荧光光谱图；
图3c为在ph值10下荧光探针cr-ts对次氯酸盐反应的荧光光谱图；
图4为荧光探针cr-ts在不同ph值下(ph值6和10)进行次氯酸盐检测时的开环反应的示意图；
图5a为ph值6下测定的荧光探针cr-ts对不同浓度的次氯酸盐溶液(次氯酸根ocl-浓度在0～40μm)的荧光光谱图，箭头方向代表ocl-的浓度逐渐增大；
图5b为以ocl-的浓度(0～40μm)为横坐标，以图5a得到的荧光光谱中570nm的荧光强度为纵坐标得到的相关性曲线图；
图5c为ocl-的浓度为0-14μm时，以ocl-的浓度为横坐标，以图5a得到的荧光光谱中570nm的荧光强度为纵坐标得到的相关性曲线图；
图5d为ph值10下测定的荧光探针cr-ts对不同浓度的次氯酸盐溶液(次氯酸根ocl-浓度在0～40μm)的荧光光谱图；
图5e为以ocl-的浓度(0～40μm)为横坐标，以图5d得到的荧光光谱中570nm的荧光强度为纵坐标得到的相关性曲线图，箭头方向代表ocl-的浓度逐渐增大；
图5f为ocl-的浓度为0-14μm时，以ocl-的浓度为横坐标，以图5d得到的荧光光谱中570nm的荧光强度为纵坐标得到的相关性曲线图；
图6为利用荧光探针cr-ts对两种商业消毒剂溶液进行次氯酸盐检测得到的测定结果与商业消毒剂标识含量的对比图；
图7a为化合物cr的晶体结构图；
图7b为荧光探针cr-ts的晶体结构图；
图8a为10μmcr在乙醇中对0～20eqhg2+的紫外吸收光谱图，其中箭头方向表示hg2+含量从低到高；
图8b为10μmcr在乙醇中对0～20eqh+的紫外吸收光谱图，其中箭头方向表示h+含量从低到高；
图8c为10μmcr在乙醇中对hg2+的荧光响应图，其中箭头方向表示hg2+含量从低到高；
图8d为10μmcr在乙醇中对h+的荧光响应图，其中箭头方向表示h+含量从低到高；
图8e为在碱性条件ph10下10μmcr在乙醇中对碳酸钠的紫外吸收光谱图，其中箭头方向表示碳酸钠含量从低到高；
图8f为在碱性条件ph10下10μmcr在乙醇中对碳酸钠的荧光发射光谱图，其中箭头方向表示碳酸钠含量从低到高；
图9a为2.5-5.5范围内的ph值对498nm波长处lg[(amax-a)/(a-amin)]变化的拟合曲线图；
图9b为6.5-13范围内的ph值对534nm波长处lg[(amax-a)/(a-amin)]变化的拟合曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，提供的具有式ii结构的化合物cr-ts，其合成流程如下所示：
其制备方法包括以下步骤：
(1)cr的合成
于香豆素衍生物c-oh(1.9g)和化合物s1(3.13g)的混合物中加入浓h2so4(20ml)，并在100℃搅拌过夜。冷却至室温后，倒入150ml冰水中。用naoh和nahco3中和，并用二氯甲烷萃取。无水硫酸钠干燥后，旋干。残留物用硅胶柱色谱分离得到1.6g产物化合物cr，产率34％。
1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ/ppm:8.09–8.00(m,1h),7.73–7.61(m,2h),7.20(d,j＝7.3hz,1h),6.83(s,1h),6.59(d,j＝8.9hz,1h),6.52(d,j＝2.5hz,1h),6.39(dd,j＝8.9,2.6hz,1h),6.14(d,j＝1.1hz,1h),3.38(q,j＝7.1hz,4h),2.59(s,3h),2.13(d,j＝1.0hz,3h),1.19(t,j＝7.1hz,6h)。13cnmr(126mhz,cdcl3)：δ/ppm:169.43,160.69,152.90,152.58,152.39,152.13,149.81,135.10,129.86,128.64,126.85,125.14,123.97,121.37,116.46,115.82,114.00,113.30,108.87,104.55,97.73,83.78,44.50,18.56,12.53,8.72.hr-ms(c29h25no5):计算值(mh+):468.1792，测试值468.1802。
(2)cr-ts的合成
将化合物cr(467mg)在pocl3(10ml)中回流6h，旋干。残留物溶于5ml二氯甲烷，转移至50ml烧瓶。然后加入1ml三乙胺和931mg对甲苯磺酰肼(溶于10ml二氯甲烷，对苯磺酰肼缩写为ts-nh2nh2)，混合物搅拌过夜，旋干。硅胶柱色谱分离得到438.6g探针cr-ts，产率69％。
1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ/ppm:8.12–7.88(m,1h),7.61–7.46(m,2h),7.21(d,j＝8.0hz,2h),7.00(dd,j＝11.0,5.9hz,3h),6.88(s,1h),6.80(s,1h),6.41(s,1h),6.36(s,2h),6.16(s,1h),3.40(dd,j＝14.1,7.0hz,4h),2.39(s,3h),2.36(s,3h),2.20(s,3h),1.23(t,j＝7.0hz,6h)。13cnmr(126mhz,cdcl3):δ/ppm:167.79,160.79,152.76,152.57,151.75,149.22,143.54,136.35,134.21,128.97,128.55,127.57,126.88,124.19,123.99,115.72,115.14,113.19,112.80,109.01,97.86,66.06,44.38,21.59,18.72,12.62,8.54。hr-ms(c32h25no5):计算值(mh+):636.2163，测试值636.2137。
实施例2
在本实施例中，对实施例1制备得到的荧光探针cr-ts在不同ph值下对次氯酸盐的荧光响应，具体实验操作为：于1cm的石英比色皿中加入20μl的1mm的探针溶液，2ml相应ph(从ph2-12)的缓冲溶液，以及200μm的次氯酸盐溶液。轻轻晃动使之混匀，静置10min，然后在荧光光度计读取570nm波长处的荧光强度。
结果如图1所示，当ph从2逐渐增大到6时，探针的荧光逐渐增强，然后在ph值6～8之间保持相对平稳。当进一步调节ph到10时，探针的荧光强度又再次显著增强。此探针的荧光响应具有两个最佳ph值。ph值6和10被选为后面光物理测试的条件。
实施例3
在本实施例中，测定实施例1制备得到的荧光探针在ph值6和10时对次氯酸盐的选择性，具体实验操作如下：于1cm的石英比色皿中加入20μl的1mm的探针溶液，2mlph值6和10的缓冲溶液，以及200μm的含有不同金属离子、以及其他活性氧和次氯酸盐的底物溶液。轻轻晃动使之混匀，静置10min，然后在荧光光度计上读取570nm波长处的荧光强度。
结果如图2a和图2b所示，其中图2a表示荧光探针cr-ts在ph值6时对含有不同金属离子和其他活性氧基团或物质的荧光响应，图2b表示荧光探针在ph值10时对含有不同金属离子和其他活性氧基团或物质的荧光响应，其中1-11分别表示cu2+、hg2+、cd2+、pb2+、ag+、ocl-、h2o2、1o2、no2-、onoo-和·oh，可以看出，在酸性和碱性条件下，当加入除次氯酸盐的其他物质后，探针发射的荧光可以忽略不计。然而，当加入次氯酸盐时，探针的荧光急剧增强，这表明探针对次氯酸盐具有很好的选择性。
实施例4
在本实施例中，测定不同ph值下(ph值6和10)探针cr-ts对次氯酸盐反应的紫外吸收光谱和荧光光谱，具体方法如下：
于1cm的石英比色皿中加入20μl的1mm的探针溶液，2ml相应酸度的缓冲溶液，以及200μm的底物溶液。轻轻晃动使之混匀，静置10min，然后在分光光度计或荧光光度计上读取相应波长处的荧光强度。
不同ph值下(ph值6和10)探针cr-ts对次氯酸盐反应的紫外吸收光谱如图3a所示，在ph值6下探针cr-ts对次氯酸盐反应的荧光光谱如图3b所示，在ph值10下探针cr-ts对次氯酸盐反应的荧光光谱如图3c所示。
由紫外吸收光谱可以看出，cr-ts的紫外可见吸收光谱在226nm，261nm和324nm处有吸收峰，且其与ph值无关。ph值为6时，次氯酸盐的加入导致498nm和534nm处出现两个新的吸收峰。ph值为10时，这两个吸收峰略微红移，它们位于500nm和540nm。此外，540nm处的吸收高于500nm处的吸收。酸碱度不同导致的吸收不同可归因于不同的开环反应。由荧光光谱可以看出，探针本身不发光，当加入次氯酸盐时，探针发射荧光。ph值为6时，发射峰位于570和625nm。在ph值为10时，只有570nm处一个发射峰，这也是由于不同的开环反应导致。
本发明所述探针开环反应的示意图如图4所示，其中cr-ts由其原子模型结构表示，其中画出了碳原子、氧原子和氮原子，省略掉了h原子。在ph值为6和ph值为10检测次氯酸时发生了不同的开环反应，均使得开环后产生荧光。
实施例5
在本实施例中，通过cr-ts对不同浓度的次氯酸盐溶液(次氯酸根ocl-浓度在0～40μm)的荧光响应建立响应性标准曲线，具体方法为：于1cm的石英比色皿中加入20μl的1mm的探针溶液，2ml相应ph值的缓冲溶液，以及相应浓度的底物溶液即次氯酸盐溶液。轻轻晃动使之混匀，静置10min，测定其荧光光谱，其激发波长为540nm，发射波长为570nm，在荧光光度计上读取相应波长处的荧光强度。
ph值6下测定的荧光探针cr-ts对不同浓度的次氯酸盐溶液的荧光光谱图如图5a所示，以图5a中ocl-的浓度(0～40μm)为横坐标，以570nm的荧光强度为纵坐标，得到的相关性曲线图如图5b所示，探针的荧光强度随着次氯酸盐的浓度增加而增强。而且，在次氯酸盐浓度低于14μm时，如图5c所示，荧光强度与次氯酸盐浓度成线性相关。同样，ph值10下测定的荧光探针cr-ts对不同浓度的次氯酸盐溶液的荧光光谱图如图5d所示，以图5d中ocl-的浓度(0～40μm)为横坐标，以570nm的荧光强度为纵坐标，得到的相关性曲线图如图5e所示，探针的荧光强度随着次氯酸盐的浓度增加而增强。而且，在次氯酸盐浓度低于14μm时，如图5f所示，荧光强度与次氯酸盐浓度成线性相关。酸性条件和碱性条件下的线性相关系数分别为0.9994和0.9967。碱性条件下的检出限为21.53nm，比酸性条件下的检出限低近4倍。碱性条件下的线性范围也比酸性条件的更广。因此，探针与次氯酸盐在碱性条件反应比在酸性条件反应具有更高的灵敏度。
探针的荧光强度随着次氯酸盐的浓度增加而增强。而且，在次氯酸盐浓度低于14μm时，荧光强度与次氯酸盐浓度成线性相关。酸性条件和碱性条件下的线性相关系数分别为0.9994和0.9967。碱性条件(ph10)下的检出限(lod)为21.53nm，比酸性条件(ph6)下的检出限低近4倍。碱性条件下的线性范围也比酸性条件的更广。因此，探针与次氯酸盐在碱性条件反应比在酸性条件反应具有更高的灵敏度。碱性条件下得到的荧光强度与次氯酸盐浓度的相关方程为y＝105928.89x+45073.145。
实施例6
由于碱性条件下，探针对次氯酸盐具有更高的灵敏度，因此更适合于实际样品检测。因此碱性滴定法被用于实际样品分析。为验证反应的可行性，检测了自来水中的次氯酸盐浓度。实验室自来水中次氯酸盐的平均浓度为4.06um(≈0.21mg/l)，此浓度在国标(gb5749-2006)规定的允许有效率含量之内。标准加入法被用于检测方法的回收率和相对标准差。如表1所示，回收率和相对标准差(rsd)分别是97.8～105.0％和2.2～5.0％，表明利用本发明的荧光探针根据如上得到的碱性条件下的如上得到的荧光强度与次氯酸盐浓度的相关方程进行检测的方法具有很好的准确率和可靠性，可用于自来水中次氯酸盐的检测。
表1自来水中的次氯酸盐检测
实施例7
在本实施例中，利用实施例1制备得到的荧光探针cr-ts对实际样品中次氯酸盐进行检测，方法为：于1cm的石英比色皿中加入20μl的1mm的探针溶液，2ml相应ph值10的缓冲溶液，以及两种商业消毒剂溶液(即永安消毒液和朗索消毒液)。轻轻晃动使之混匀，静置10min，测定其荧光光谱，其激发波长为540nm，发射波长为570nm，在荧光光度计上读取570nm波长处的荧光强度，而后代入碱性条件下荧光强度与次氯酸盐浓度的相关方程为y＝105928.89x+45073.145，得到次氯酸盐的浓度值，其测定得到的结果以及商业消毒剂标识的含量对比如图6所示。
实施例8
为了验证示意图4提出的在不同ph值下与次氯酸盐反应的机理，对中间产物cr在盐酸和氢氧化钠中计算的和测得的质谱数值进行了对比，结果如表2所示。
表2计算的和测得的分子量
由表1可以看出，cr在盐酸和氢氧化钠中计算的和测得的质谱数值是一致的，探针在酸性和碱性条件下的与次氯酸盐的反应产物的质谱与cr在酸性和碱性介质中的质谱数值也相一致。这些结果表明示意图4提出反应机理是正确的。
此外，用乙醚挥发到cr和cr-ts的二氯甲烷和甲醇溶液中，得到相应的晶体，其晶体结构数据如表3所示。
表3cr和cr-ts的晶体结构数据
cr的部分键长键角和cr-ts的键长键角分别如表4和表5所示。
表4cr的部分键长键角
表5cr-ts的键长键角
由表3的晶体数据以及表4和表5的键长键角数据表明，cr和cr-ts的基本结构都是由四个稠杂在一起的六元环组成，且香豆素单元和氧杂蒽骨架公用一个苯环。尽管四个芳香环的共平面性，它们分子间却不存在π-π堆积，原因可能是由于正交方向的螺环存在。两个化合物之间的骨架和螺环的二面角分别是86.746°和86.618°，有效阻止了分子间的π-π堆积。
如图7a为化合物cr的晶体结构图，图7b为荧光探针cr-ts的晶体结构图。图中标记了原子序号，展示了原子的空间位置，为清晰起见，氢原子(除了化合物cr-ts中的n-h之外)和溶剂都略去。
为了说明ph值6和10时cr-ts的开环具体是哪个环的打开，通过离解常数与吸收和荧光光谱可用于解释探针与次氯酸盐反应的双响应现象。如图8a为10μmcr在乙醇中对0～20eqhg2+的紫外吸收光谱，图8b为10μmcr在乙醇中对0～20eqh+的紫外吸收光谱，前驱体cr在260nm和325nm处有两个吸收带。汞离子和氢离子的加入导致410nm，502nm和531nm处出现新的吸收带，并伴随着颜色从无色到红色的变化，表明螺环被打开。10μmcr在乙醇中对hg2+和h+的荧光响应见图8c和图8d，其荧光强度随着氢离子和汞离子浓度的增加而增强。由荧光计算出来的氢离子对cr的结合常数与汞离子对cr的结合常数与由吸收计算出来的数值相一致。表明它们皆是由于生成了类似罗丹明的开环产物。在碱性条件ph10下10μmcr在乙醇中对碳酸氢钠的紫外吸收光谱和荧光发射光谱见图8e和图8f，碳酸钠的加入导致502nm，531nm处出现新的吸收峰，且只有一个位于567nm处的发射峰。这表明，碱性条件下，新发射峰和吸收峰的出现是由于类似荧光素的开环产物的形成。
图9a和图9b示出了ph值对498nm和534nm处lg[(amax-a)/(a-amin)]变化的拟合曲线，其中amax表示最大吸光度，a表示吸光度，amin表示最小吸光度。基于此，两个离解常数(intercept)分别为3.2和10.24。这两个值分别与罗丹明(3.2)和香豆素(10.17)的ph值接近(dyespigments.1994,24(1),11-35.；7-o-β-d-glucosyl-coumarin(pka＝10.17)，biomed.chromatogr.2005,19(3),250-254)。如上表明，酸性条件的开的是罗丹明的螺环，碱性条件开的是香豆素的内酯环。基于此，提出了示意图4所示的反应机理，并用质谱进一步验证它的准确性。表2展示的cr在盐酸和氢氧化钠中计算的和测得的质谱数值，可见它们是一致的。探针在酸性和碱性条件下与次氯酸盐的反应产物的质谱与cr在酸性和碱性介质中的质谱数值也相一致。这些结果表明示意图4所阐明的机理是正确的。
本发明通过上述实施例来说明本发明的荧光探针及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。