一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种作为谷胱甘肽荧光探针材料使用的 萘酰亚胺-苯砜衍生物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 谷胱甘肽（Glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽分子， 是人体中含量最多的含巯基氨基酸。在生命体内，谷胱甘肽对维持细胞内的氧化还原平衡、 细胞内的信号转换及调节等起着重要的作用。细胞内谷胱甘肽浓度的异常将会导致一系列 的生理疾病，例如白细胞缺失、银肩病、肝损伤、癌症和艾滋病等（参见L.A.Herzenberg，S. C.DeRosa,J.G.Dubs等,Glutathionedeficiencyisassociatedwithimpaired survivalinHIVdisease，Proc.Natl.Acad.Sci.USA. ,1997, 94:1967-1972)。因此，定量、 实时地监测生物体内谷胱甘肽的含量一直是生物化学家和化学生物学家的研宄热点之一。
[0003] 荧光检测法因其优秀的检测灵敏度以及能实现对生物样品的实时、在线检测而受 到研宄者的广泛关注。萘酰亚胺类荧光分子具有易修饰、光稳定性好、摩尔消光系数和量子 产率高等独特优点而成为该方法最重要的荧光母体之一，在多种待测分子的荧光检测中得 到了广泛地应用。
[0004] 目前已开发的用于检测谷胱甘肽的小分子荧光探针主要基于巯基与2, 4-二硝基 苯磺酰氨基或是2, 4-二硝基苯璜酰酯基之间的特异性化学反应而设计的。当存在谷胱甘 肽的条件下，探针分子中的2, 4-二硝基苯磺酰氨基或是2, 4-二硝基苯璜酰酯基能被谷胱 甘肽中的巯基取代，原2, 4-二硝基苯磺酰氨基或是2, 4-二硝基苯璜酰酯基发生离去而导 致探针分子的荧光性质发生变化，从而实现对谷胱甘肽的特异性设别。
[0005] 然而，已报道的谷胱甘肽探针大多数受到生物体内同样含有巯基的氨基酸，如：半 胱氨酸（Cysteine，Cys)和高半胱氨酸（Homocysteine，Hey)的干扰（SMj.Bouffard，Y. Kim,T.M.Swager等，AHighlySelectiveFluorescentProbeforThiolBioimaging, Org.Lett.，2008, 10 :37_40 ;X. _D.Jiang,J.Zhang,X.Shao等，Aselectivefluorescent turn-onNIRprobeforcysteine，Org.Biomol.Chem.，2012, 10 :1966-1968)，难以实现其 在复杂的生物体内进行谷胱甘肽的特异性检测。因此亟须一种新颖的、具有良好生物稳定 性的且能实现优秀特异性响应的用于生物体内谷胱甘肽检测的荧光探针。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明旨在提供一种来自萘酰亚胺和苯砜的用 于检测谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用。
[0007] 本发明的核心在于利用1，8_萘酰亚胺构筑经典的ICT体系，并在4-位引入苯砜 部分，调控探针分子的ICT效应，由于4-位苯砜的强吸电子效应导致探针分子本身无荧光 发射。当存在谷胱甘肽时，苯砜部分能被谷胱甘肽取代，进而发生从4-位硫原子（来自谷 胱甘肽）到1，8-萘酰亚胺的分子内电子转移，而该ICT效应使得探针分子发射出强荧光。 通过上述方案，获得了高度谷胱甘肽特异性的"关-开"型的荧光响应，大大提高了检测的 选择性和灵敏度。
[0008] 首先，为了达到上述目的，本发明提供了一种如式（I)所示的萘酰亚胺-苯亚砜衍 生物。
【主权项】
1. 一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针，其特征在于：该探针为式（I)所示化合物，
式⑴中，n为O~18的原子数A1为氢，或甲基，或乙基，或异丙基，或氟；R2为甲基，
2. 根据权利要求1所述一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针，其特征在于：探针的结构 式如式（II)，
3. 权利要求1所述的一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于，该 方法包括下列步骤： 步骤一：式（III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐与氨基化合物在醇中反应得到式（IV) 所示取代的4-溴-1，8-萘酰亚胺；
式（IV)中，n为O~18的原子数，R2为甲基，或羟基，或羧基，或磺酸基，或（三苯基）
步骤二：在惰性气氛下，在碱存在下，式（IV)所示化合物与式（V)所示化合物在醇中反 应得到式（VI)所示取代的4-苯硫酚基-1，8-萘酰亚胺；
式（VI)中，n为O~18的原子数况为氢，或甲基，或乙基，或异丙基，或氟；R2为甲基，
步骤三：在惰性气氛下，式（VI)所示化合物与间氯过氧苯甲酸在有机溶剂中反应即得 式（I)所示化合物。
4. 根据权利要求3所述的一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在 于： 步骤一中所述氨基化合物具体为正丁胺；式（III)所示4-溴_1，8_萘二甲酸酐和所述 氨基化合物的摩尔比为1~50:1 ;所述醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或乙二醇单 甲醚；反应温度为50~120度，反应时间为1~20小时； 步骤二中所述醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇单甲醚或二乙二醇单甲醚；式（IV) 所示4-溴-1，8-萘酰亚胺和式（V)所示苯硫酚化合物的摩尔比为1~10:1 ;所述碱为有 机碱或无机碱；所述有机碱为三乙胺、吡啶或二异丙基乙基胺；所述无机碱为碳酸钾、碳酸 钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾；所述反应温度为〇~140度；反应时间为24 小时； 步骤⑶中所述间氯过氧苯甲酸与式（VI)所示取代的4-苯硫酚基_1，8_萘酰亚胺的 摩尔比为1. 5~5:1 ;有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙腈、DMF、DMSO或1，2-二氯乙烷；反应 温度为〇~100度；反应时间为1~24小时。
5. 根据权利要求3或4所述的一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征 在于： 步骤一中式（III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩尔比为10 :1 ; 所述醇为乙醇；反应温度为80度，反应时间为5小时； 步骤二中所述醇为乙二醇单甲醚；式（IV)所示4-溴-1，8-萘酰亚胺和式（V)所示苯 硫酚化合物的摩尔比为5 :1 ;反应温度为100度；反应时间为24小时； 步骤三中所述间氯过氧苯甲酸与式（VI)所示取代的4-苯硫酚基-1，8-萘酰亚胺的摩 尔比为2 :1 ;所述有机溶剂为二氯甲烷；反应温度为25度；反应时间为5小时。
6. -种用于检测谷胱甘肽的荧光探针的应用，其特征在于，该应用包括以下步骤： 步骤1 :向不同浓度谷胱甘肽的缓冲盐中加入相同浓度的式（I)所示化合物，配置至少 3种不同谷胱甘肽含量的含有式（I)所示化合物的标准溶液； 所示缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液或硼酸-硼酸钠 缓冲溶液； 所示标准溶液的pH值为6~11 ; 所示标准溶液中式（I)所示化合物的浓度为InM~10yM; 所示标准溶液中谷胱甘肽的含量为〇.InM~ImM; 步骤2 :分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为390nm，以谷胱甘肽浓度 为横坐标，以I483为纵坐标，建立标准曲线； I483表示所述标准溶液在波长为483nm处的荧光发射峰强度值； 步骤3 :向待测样品中加入式（I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式（I)所 示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为390nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准 曲线计算得出待测样品的谷胱甘肽含量； 上述步骤（2)或步骤（3)中荧光强度在荧光仪上进行检测。
7. 根据权利要求6所述的一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针的应用，其特征在于：步 骤1中的缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液；标准溶液的pH值为7. 2。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法与应用。本发明利用1,8-萘酰亚胺构筑经典的ICT体系，并在4-位引入苯砜部分，调控探针分子的ICT效应，由于4-位苯砜的强吸电子效应导致探针分子本身无荧光发射。当存在谷胱甘肽时，苯砜部分能被谷胱甘肽取代，进而发生从4-位硫原子（来自谷胱甘肽）到1,8-萘酰亚胺的分子内电子转移，而该ICT效应使得探针分子发射出强荧光。本发明能够实现对细胞内谷胱甘肽的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
【IPC分类】G01N21-64, C09K11-06, C07D221-14, G01N33-68
【公开号】CN104710979
【申请号】CN201510082001
【发明人】韩益丰, 杨成玉
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年2月15日