本发明属于医学诊断领域，涉及血液中rnf182基因在制备慢性阻塞性肺疾病诊断工具中的应用。
背景技术：
慢性阻塞性肺疾病是呼吸科的常见病、多发病，也是国际上公认的严重威胁人们健康的慢性肺部疾病，其发病率及死亡率高，严重增加人们及社会的经济负担。据世界卫生组织统计，2000年copd占全球死亡原因的第四位，预计到2020年，copd将上升为第三位致死原因，且成为全球经济负担的第五位。在中国，copd已居疾病负担序列的第一位。其持续慢性进展严重危害患者劳动能力和生活质量。
慢性阻塞性肺疾病是一种肺部慢性疾病，它是由于慢性支气管炎和肺气肿导致气流受限的一类肺部疾病，同时也可引起肺外器官受到损害。气流受限不完全可逆，呈进行性发展，可伴有气道高反应性。目前认为慢性阻塞性肺疾病的发生发展与诸多因素有关，如感染、过敏因素、吸烟，、职业性粉尘、大气污染、有毒物质等的长期吸入，以及机体的内在因素、营养状态、自主神经功能紊乱等，它们均可导致支气管慢性炎症，使支气管粘膜上皮细胞发生变性、坏死，出现纤毛倒伏、变短、粘连，甚至部分脱落，以至于粘膜上皮出现麟状上皮化生及肉芽组织、纤维组织增生导致气管及支气管管腔狭窄，气道壁结构重塑及症痕形成，从而致使气道高反应性，引起气流受限。copd的发病机制目前尚未完全阐明，是医学界研究的热点问题之一。近年来，copd的发病机制学说主要分为以下几种：氧化/抗氧化失衡、慢性炎症、细胞凋亡、蛋白酶抗蛋白酶失衡等，其中炎症介质、细胞因子等介导的气道慢性炎症反应是copd发病的主要环节。当机体遇到过敏因素或者吸入粉尘、有害气体和颗粒时，肺组织内巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞开始增生，并释放炎症介质、趋化因子及细胞因子等，触发一系列级联反应，作用于效应细胞，导致肺泡结构的破坏，气道粘液腺体增生肥大及粘液过度地分泌，从而引起气道重建。
gold以及我国的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》均以fev1/fvc＜0.70作为copd的诊断标准，随着这种诊断模式的广泛宣传，近年其被越来越多的国内外呼吸科医生及肺功能检查技术人员所接受。但是，越来越多的证据发现，以fev1/fvc＜0.70作为copd的诊断标准可导致大量临床误诊，当前这一诊断标准正受到前所未有的挑战。因此开发一种可用于准确诊断copd的方法是亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明实验研究发现rnf182基因在慢性阻塞性肺疾病患者的血液中的含量比正常人低很多，据此可以认为rnf182基因可以作为慢性阻塞性肺疾病的诊断标志物，可以开发诊断慢性阻塞性肺疾病的工具。
根据本发明的一个方面，本发明提供了检测rnf182基因表达的产品在制备诊断慢性阻塞性肺疾病的工具中的应用。
进一步，上面所提到的检测产品包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测rnf182基因的表达水平以诊断慢性阻塞性肺疾病的产品。
进一步，所述用rt-pcr诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增rnf182基因的引物；所述用实时定量pcr诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增rnf182基因的引物；所述用免疫检测诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：与rnf182蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：与rnf182基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断慢性阻塞性肺疾病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与rnf182蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与rnf182基因的核酸序列杂交的探针。
在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量pcr诊断慢性阻塞性肺疾病的产品至少包括一对特异扩增rnf182基因的引物的序列如seqidno.3和seqidno.4所示。
优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测rnf182基因表达的产品可以应用于该平台实现对rnf182基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知rnf182基因的异常与慢性阻塞性肺疾病相关也属于rnf182基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种诊断慢性阻塞性肺疾病的工具，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测rnf182基因转录水平的针对rnf182基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的rnf182蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括rnf182基因在内的多个基因(例如，与慢性阻塞性肺疾病相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括rnf182蛋白在内的多个蛋白质(例如与慢性阻塞性肺疾病相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与慢性阻塞性肺疾病的标志物同时检测，可大大提高慢性阻塞性肺疾病诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测rnf182基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括rnf182蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测rnf182基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对rnf182基因的引物和/或探针。根据rnf182基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测rnf182基因表达水平的引物和探针。
所述高通量测序平台包括检测rnf182基因表达水平的试剂。
所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测rnf182基因的转录水平。
与rnf182基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述rnf182蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述rnf182蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与rnf182蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述针对rnf182基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.3所示，反向引物如seqidno.4所示。
用于诊断慢性阻塞性肺疾病的rnf182基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等体液，或组织。在本发明的具体实施方案中，用于诊断慢性阻塞性肺疾病的rnf182基因及其表达产物的来源是血液。在发明的具体实施方案中，血液是取自慢性阻塞性肺疾病患者和正常人的外周血液。
本发明的rnf182基因(nc_000006.12(13924446..13980009))的具体序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。
本发明的rnf182基因的编码序列包括以下任一一种dna分子：
(1)序列表中seqidno.1所示的dna序列；
(2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码相同功能蛋白质的dna序列；
(3)与(1)或(2)限定的dna序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子。
在本发明的具体实施方案中，所述rnf182基因的编码序列是seqidno.1所示的dna序列。
在本发明的上下文中，rnf182基因表达产物包括rnf182蛋白以及rnf182蛋白的部分肽。所述rnf182蛋白的部分肽含有与慢性阻塞性肺疾病相关的功能域。
“rnf182蛋白”包括rnf182蛋白以及rnf182蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括rnf182蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与rnf182的dna杂交的dna所编码的蛋白质。
优选地，rnf182蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与seqidno.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与seqidno.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述rnf182蛋白是具有seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是rnf182蛋白的融合蛋白。对于与rnf182蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留rnf182蛋白的生物学活性即可。
本发明的rnf182蛋白也包括对seqidno.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留rnf182蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断慢性阻塞性肺疾病”既包括待检测者是否已经患有慢性阻塞性肺疾病、也包括判断待检测者是否存在患有慢性阻塞性肺疾病的风险，还包括预测慢性阻塞性肺疾病患者的预后。
附图说明
图1显示利用qpcr检测慢性阻塞性肺疾病和正常人相比rnf182基因的差异表达。
具体的实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中差异表达的基因
1、临床研究对象：
选取慢性阻塞性肺疾病患者6例，其中男性3例，女性3例，年龄范围52-76岁，诊断标准均符合我国2007年修订的《慢性阻塞性肺疾病诊疗规范》。
诊断标准：任何患有呼吸困难、慢性咳嗽或多痰的患者，并且有暴露于危险因素的病史，行肺功能检查显示，在吸入支气管舒张剂后，表明存在气流受限，可以诊断为copd。
排除标准：①合并其它肺部疾病者，如支气管哮喘、肺间质纤维化、肺癌等；②有其它部位感染者；③伴有严重心脑血管疾病、糖尿病、血液系统疾病、恶性肿瘤、脏器功能衰竭、肝炎者；④患免疫系统疾病或者近期使用过免疫抑制剂者。
正常对照：选取体检的健康人6人，其中男性3人，女性3人，年龄范围52-76。
入选标准：无慢性咳嗽、咳痰、端息等病史；近期无上呼吸道感染、肺部感染史；无全身其他部位感染者；无其他肺部疾病者；近期未使用免疫抑制剂或者无全身免疫系统疾病者；无器官功能衰竭或者严重心脑血管疾病、肿瘤者；无过敏性疾病者。入选对象行肺功能检查均排除并与慢性阻塞性肺疾病组对比，在性别、年龄上差异均无统计学意义具有可比性。
所有研究对象均签署了知情同意书。
2、样本采集
所有研究对象于清晨空腹状态下，抽取外周静脉血10ml，edta抗凝。
3、血液样本总rna提取
使用百泰克血液rna提取试剂盒进行血液总rna的提取：
(1)取全血250μl(或0.25g)至rnase-free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集下液，加入0.75ml裂解液rls。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)可选步骤：4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无rna酶的离心管中。
(4)每1mlrls加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
(5)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，rna存在于水相中。水相层的容量大约为所加rls体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱ra中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液re，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液rw，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入500μl漂洗液rw，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱ra放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱ra，放入一个无rna酶的离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无rna酶的水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。
4、rna样品的质量分析
利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。
5、片段化rna
illumina平台是针对短序列片段进行测序，mrna平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将rna随机断裂成200bp左右的小片段。
6、反转合成cdna
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mrna为模板反转合成一链cdna，进行二链合成时，dntps试剂中用dutp代替dttp，使cdna第二链中碱基包含a/u/c/g。
7、连接adaptor
双链的cdna结构为粘性末端，加入endrepairmix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个a碱基，用于连接y字形的接头。
8、ung酶消化cdna二链
在pcr扩增前，用ung酶将cdna第二链消化，从而使文库中仅包含cdna第一链。
9、illuminax-ten上机测序
illuminax-ten测序平台，进行2*150bp测序。
10、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads；
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为grch38.p7，fasta和gff文件下载自ncbi；
(3)cuffquant定量mrna的表达量并标准化输出；
(4)在r环境下用degseq包比较对照组跟疾病组mrna的表达差异。显著差异mrna筛选条件：p-value<0.05。
11、结果
rna-seq结果显示，以正常人血液中rnf182基因的mrna相对表达水平为1，慢性阻塞性肺疾病患者血液中rnf182基因的mrna表达水平是0.32±0.11。上述结果表明，与正常人相比，慢性阻塞性肺疾病患者血液中rnf182基因的mrna水平显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例2验证慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象：
按照实施例1的方法选择慢性阻塞性肺疾病患者35例，正常人30例。
2、血液总rna提取
使用百泰克血液rna提取试剂盒进行血液总rna的提取：
(1)取全血250μl(或0.25g)至rnase-free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集下液，加入0.75ml裂解液rls。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)可选步骤：4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无rna酶的离心管中。
(4)每1mlrls加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
(5)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，rna存在于水相中。水相层的容量大约为所加rls体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱ra中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液re，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液rw，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入500μl漂洗液rw，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱ra放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱ra，放入一个无rna酶的离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无rna酶的水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。
3、测量总rna浓度及纯度
用nanovueplus仪器测量样本rna的浓度及纯度。
4、逆转录合成mrnacdna
用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
5、qpcr
(1)引物设计
根据genbank中rnf182基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
rnf182基因：
正向引物为5’-cttaggaatctacttactg-3’(seqidno.3)；
反向引物为5’-tacaccataagaataacg-3’(seqidno.4),
gapdh基因：
正向引物为5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.5)；
反向引物为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.6)。
(2)扩增
反应体系：25μl反应体系，每个样本设置3个平行管。配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm)1μl，反向引物(5μm)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl；各项操作均于冰上进行。
扩增程序：95℃5min，(95℃5s，60℃60s)*45个循环。以sybr
green作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。
6、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，不同组之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。
7、结果
结果如图1显示，与正常人相比，慢性阻塞性肺疾病患者血液中rnf182基因的mrna水平显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05)，结果同rna-seq实验。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110>中日友好医院
<120>rnf182基因作为慢性阻塞性肺疾病的诊断标志物
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>744
<212>dna
<213>homosapiens
<400>1
atggccagtcaacctcctgaagacactgcggagtctcaggcctctgatgagctggagtgc60
aaaatctgttacaatcgatacaatctgaaacagaggaaacccaaagtgctggagtgttgt120
catagggtttgtgccaaatgcctctacaagatcatagactttggggactccccacaaggt180
gtcattgtctgtcctttctgcaggtttgagacgtgcctgccagatgatgaagttagtagc240
ctgcccgatgacaacaacatccttgtaaacttgacttgtggaggcaaagggaagaagtgc300
ctgccagagaaccctactgagctgctgctcacccccaagaggctggcctctctggtcagt360
ccttctcacacgtcctccaactgcctggtcataaccatcatggaggtgcagagagagagc420
tccccgtccctgagctccactcctgtggtagaattttataggcctgcgagtttcgactct480
gtcaccactgtgtcacacaactggactgtgtggaactgcacgtccctgctgtttcagaca540
tccatccgggtgttagtgtggttgctaggtttgctctacttcagctccttacccttagga600
atctacttactggtgtctaagaaagtcacccttggggtcgtctttgtcagcctggtccct660
tcgagcctcgttattcttatggtgtatggtttttgccagtgtgtttgtcatgaatttcta720
gactgtatggcacctccttcttaa744
<210>2
<211>247
<212>prt
<213>人源(homosapiens)
<400>2
metalaserglnproprogluaspthralagluserglnalaserasp
151015
gluleuglucyslysilecystyrasnargtyrasnleulysglnarg
202530
lysprolysvalleuglucyscyshisargvalcysalalyscysleu
354045
tyrlysileileasppheglyaspserproglnglyvalilevalcys
505560
prophecysargphegluthrcysleuproaspaspgluvalserser
65707580
leuproaspaspasnasnileleuvalasnleuthrcysglyglylys
859095
glylyslyscysleuprogluasnprothrgluleuleuleuthrpro
100105110
lysargleualaserleuvalserproserhisthrserserasncys
115120125
leuvalilethrilemetgluvalglnarggluserserproserleu
130135140
serserthrprovalvalgluphetyrargproalaserpheaspser
145150155160
valthrthrvalserhisasntrpthrvaltrpasncysthrserleu
165170175
leupheglnthrserileargvalleuvaltrpleuleuglyleuleu
180185190
tyrpheserserleuproleuglyiletyrleuleuvalserlyslys
195200205
valthrleuglyvalvalphevalserleuvalproserserleuval
210215220
ileleumetvaltyrglyphecysglncysvalcyshisglupheleu
225230235240
aspcysmetalaproproser
245
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cttaggaatctacttactg19
<210>4
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tacaccataagaataacg18
<210>5
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tttaactctggtaaagtggatat23
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
ggtggaatcatattggaaca20