本发明涉及生物检测鉴定技术领域，具体涉及一种鸭性别鉴定用pcr、鉴定方法及试剂盒。
背景技术：
性别鉴定在家禽养殖业中有重要作用，通过鉴定1日龄雏鸭的雌雄，可淘汰非目的性别，降低饲养成本，提高经济效益。随着人们生活习惯和地域的差别，对不同性别肉鸭的需求有明显的不均衡性，而且雌雄对于环境、营养条件等的反应也不同，实现雌雄分群饲养，便于科学管理、提高生产性能和屠体品质，同时性别鉴定在基础研究领域更具有重要意义。
目前，鸭子性别的鉴定方法一般分为外形鉴别法、鸣管鉴别法、摸肛鉴别法和分子水平鉴定法。其中外形鉴别法根据公母鸭的体型外貌特征区别，常有误判；鸣管鉴别法需要鸭的鸣管发育好才能区别，在出壳至青年期很难区分；摸肛鉴别法虽然准确率较高，但是存在一些垂直传播病菌交叉感染的风险，且摸肛对技术要求比较高，需要生产实践经验丰富才能保证准确率。分子鉴定法是利用性染色体w和z上特殊基因的片段大小不同而判定性别，家禽w染色体仅存在与雌性个体中，w染色体上存在很多保守序列，利用这些序列可以对家禽性别进行鉴定。位于鸭w染色体上的wpkci基因具有高度保守性，可以用于鸭性别鉴定。但是目前分子鉴定均集中于dna水平，对于已经获得的一些单一或混合样本的cdna，特别是珍贵样品，性别未知，但是性别对于后续的研究极为重要，无法通过cdna鉴定其性别。有时候一些样本已经在dna水平进行了性别鉴定，但在提取rna及反转录为cdna的过程中，可能会出现个别样本编号混淆导致性别不确定的问题，在cdna水平上无法进行性别鉴定。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种鸭性别鉴定用rt-pcr引物、鉴定方法及试剂盒，可以在rna水平进行鸭性别鉴定。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种鸭性别鉴定用rt-pcr引物，包括上游引物dwl和下游引物dwr，其序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示。
其中seqidno:1的序列为atggccgacgggattgtt
seqidno:2的序列为ctattcggcggcgatagt
一种鸭性别鉴定用试剂盒，包含所述鸭性别鉴定用pcr引物，还包括用于扩增β-actin内参基因的内参引物、taqdna聚合酶、buffer缓冲液和dntp，所述内参引物包括上游引物actl和下游引物actr，其序列分别为seqidno:3和seqidno:4，其中
seqidno:3的序列为gccatctttcttgggtat
seqidno:4的序列为cttgattttcatcgtgct
一种鸭性别鉴定方法，该方法为：提取待测样品的总rna，用所述鸭性别鉴定用rt-pcr引物、内参引物、taqdna聚合酶、buffer缓冲液和dntp进行rt-pcr,然后采用琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，当扩增产物中出现363bp和255bp的特异性扩增条带时判定为雌性鸭，当扩增产物中没出现363bp和255bp的特异性扩增条带时判定为雄性鸭。所述待测样品包括但不限于鸭胸肌、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、小肠、睾丸、卵巢、血液组织。所述rt-pcr过程中，cdna扩增的反应程序为：98℃预变性2分钟，98℃变性10秒，59℃复性30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸5分钟，所述363bp的特异性扩增条带的核苷酸序列为seqidno:5。
其中seqidno：5的序列为
atggccgacgggattgttagggcgcaggccgcctggcccggtggcggcgctgccgctgctttcggagaggtcgcctgcaagggcaaggaggtccccgccaacgttctccgtgaggatgagcggtcgtggacgaggagtgccttgcgttccgtgatagttcgcctcaggctccagtgttttttcctagtccttcctgagaaggtagttgtccggttatgtgaagcagaagattctggcggaccccttcttgggcgtttcgtggttgttggcaagaagtgtgctgctaacctggacctgaccaatggattccggatggctgtgaatgcccaccctcgggcccttcagactatcgccgccgaatag
本发明的有益效果是：通过本发明提供的鸭性别鉴定用pcr引物、试剂盒及鉴定方法，可以在rna水平上进行鸭性别鉴定，尤其是对于已经获得的一些珍贵样品cdna，可以鉴定其性别进行后续研究。
附图说明
图1为使用本发明实施例1鸭性别鉴定用引物对雌性鸭wpkci基因进行扩增的琼脂糖凝胶电泳图，其中图1a为使用cdna进行扩增的产物，图1b为使用dna进行扩增的产物；
图2为本发明实施例2使用cdna进行内参基因β-actin的扩增结果图；
图3为本发明实施例2使用本发明鸭性别鉴定用试剂盒通过鸭不同组织鉴定鸭性别的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中1-4泳道分别为雌性胸肌、心脏、肝脏、肾脏组织cdna性别鉴定pcr产物，5-10为雄性胸肌、心脏、肝脏、肾脏、肌胃、睾丸组织cdna性别鉴定pcr产物；
图4为使用本发明实施例3鸭性别鉴定用试剂盒通过不同鸭的血液组织鉴定鸭性别的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中1-5泳道分别为5个已知雄性个体血液样品cdna性别鉴定pcr产物，6-10泳道分别为5个已知雌性个体血液样品cdna性别鉴定pcr产物；
图5为鸭不同个体pcr与rt-pcr鉴定结果对比，其中图5a为样品1-12的rna水平rt-pcr检测结果，图5b为样品1-12的dna水平pcr检测结果。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1鸭性别鉴定用pcr引物设计
根据genebank中鸭wpkci基因的部分cdna序列(登录号：ab033883.1)，经过与鸭基因组比对、分析预测，设计鸭wpkci的rt-pcr引物，其中上游引物dwl和下游引物dwr的序列分别为seqidno:1和seqidno:2。
分别以实验室保存的成年雌性樱桃谷鸭肌肉组织的cdna、dna为模板，用引物dwl和dwd扩增wpkci基因。pcr反应按照takarataq(购自takara公司)说明书进行，反应程序为：98℃2min、98℃10s、59℃30s、72℃1min，共35个循环，72℃延伸5min。
pcr产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1a、1b所示，从琼脂糖凝胶中分别回收纯化363bp、3000bp-5000bp的目的条带，并送样克隆测序，分别得到序列为seqidno：5和seqidno：6的片段。琼脂糖凝胶电泳结果显示，从雌性样本得到363bp的目的条带，同时也获得255bp的非特异条带，对扩增体系中的温度、mg2+、循环次数等条件进行了逐一优化，255bp的非特异条带始终存在，是由于w染色体上存在与wpkci基因同源的其它基因，引物与其产生错配所致，但这条非特异条带并不影响性别鉴定结果。
seqidno:6的序列为
atggccgacgggattgttagggcgcaggccgcctggcccggtggcggcgctgccgctgctttcggagaggtcgcctgcaagggcaaggaggtccccgccaacgttctccgtgaggatgagcggtcgtggacgaggaggtagccgcggcgttgttgtgcgagtctttccttcctttccctcggccgctcgcaggccctctgaaacgagggcccgtcgcgggtcccgggagtgcggcagggcgggtggtggccttgctgcgggagggagggagggagggacggtcggtcggtcggtcggtcggggtctctccggctcgtggcgctctctactgcagcgcctctaaaacgccgcgcttcttcggtgcctgcccccggggtgccacggcgcgtactgggtcgccggcgcagtcggtctccttgggggttcggactgtatgcatataggcagtgagcatcgcagtagtgaccgtaatcagtcgtttctgcgctggtgatagcgttgcagagacgccccggctcggctgtgctaggctttggttatggcaccacccccaccgcgcacacgagcgcacgctctctccaaagtggcttgtgaaagggaagaattgcagcttttcctagctttcttaaacgcctagaaaccagtcaatcccgcaggctgcgagagcttcccagctctcatttccgtgctggaggtgggccgtgataagagcatgctggcaaggttcactgatgctggtgcgccgcaacgtgctaggagctaagtgagcagctgcggagagttatgaaaaagttgcagatgttatctgcaaggtgctaactttaagttagtgtccagcctaaccgttgttgctgttcttaaatttgaaatgctaaagataggacagttagggatttcctctgcttctgacggcagggtttatctgcagcgtggaaaacaggcccttagtgaaaggggctgcgttgcccgctctgcgtgctgactcgtagaatggttaggcttggaaggcacccttaaagatcatctagcccaacccgcctgccgcggtcagggacgtgtttcactagatcgggttgctcaaagcgttgacgcgttgcttggaacagcgctttcttaataggtctcggtaatgttgcagctgccgcccgtttggagtactggaagcgttcaactgctctccggaaaccgtgcttgcggtagcgccctgcctttaccaaagggcgcgtttcctgtctccttcgtgttgaaggctgcgcgagaagtctgtgtgtgtgtgtgcgcgtgcgcgcatctgttttgactcggccgtactggctgcagcaacgtatgtaacctgaacgctgtgcttgattggagaaccaggccgttaacttgagtctgatgagtgacttgagagcagacaacctactctgaccgctcttagtgcgacacgtttcctggaggacgaattagttgcagtttctcgcttggtcttaacttgaggcggggggagggggcggggggcttagaaccacttctggagcgtagttggctctagcgaatggtcttgaatttgcttagctcactgtaccgaaggcctgtttcacggttgagcgatgttatagggaggagcgtgaggaaggcttataattctcgattgtcgtgcagtgaaaggcgatggtgagtaagaagtacaaagcatctgtggaatcgagtcttatcggcggtgtttcagtcgcatctaaaacacataaaaatagcggaagtcgctaacctgaagtactcggctgtctcgctgcccccgtcaccttgcgcgctggatcctgcttctggtgccgtatgcagtttctgtctgctggtgatttggggagttccctcgcaattagttgcgagttgatggtttcctacaggtcggtggtattcgtgtttcgaaggtgatgccttggcctcggtctggaggtgtctgacgtcgggccggccgtaacgggctaatttggaacgttccttcccctgagtaggtggcgttctcgaggacggagagttaatacggcctcagccggattactccaggttctttgaagatgccttcctgcttctggccgaggcaatatttggacgtaaccgaaggacggttagccattgtttgccgcttgtgtgtcttgtgcgtagaaggtagagaactttgcctattcaaagctcgcttaagaagaatggctgttttgtcgtgcgcgtttggggcgcctgataatctgcttcggtagggcgagttcagtggggcatagtgatttgcttaagctgttgcctttctctgaagccgactacgttttaactgtttactcttcctccagtgccttgcgttccgtgatagttcgcctcaggctccagtgttttttcctagtccttcctgagaaggtagttgtccggttatgtgaagcagaagattctggcggacccgtgagtactgtgggagctttctgttcgctaggctggctgtacctgtaactggtttgtaacttcctagactctttcccgtcccctcttttcctctggatgttgcagaggggcgcacagtaggctatttggggttgtccgatgctgtagtctttcgcctctagcttgtaatggagctgagctttttgactgagagcagtgatataaagcgatgctcgtctccagctacgcgcttgcagtgcaaaaagcagcgttgttccgacgtgcggtctgatgcccgttttcacgctttccggacagcgggggtggtgccttgactatgcagaagagggcttggggtttggtcaggtcagaggcgaggaaagggaaagctggttgagcggcgcttgggtgtttgtttcgctgttagctatgcaagtcaagttccaaggctctgtgagctcacgcaagagaaaaggcaccgtgaagcttttattttccgccagagcggcttacgttgcccgaagctatgacgggggctttaagccccgagacaaattcagcttctgtgactgttttgtagtctgttactgtctagagggtaattcaaagagcagcggttgaattgtgaaggattagctaaccgtgttctgtgggtggttctctgctcgcgttcattctgtgcgtcgtggcgcagcacgttaggtgacgttatttcctttttccagcttcttgggcgtttcgtggttgttggcaagaagtgtgctgctaacctggacctgaccaatggattccggatggctgtgaatgcccaccctcgggcccttcagactatcgccgccgaatag
将seqidno：5序列与鸭wpkci基因部分cdna序列(登录号：ab033883.1)比对，相似性为99％；将seqidno：5序列与seqidno：6序列比对，有3段序列相似性均为100％；将seqidno：5序列、seqidno：6序列分别与鸭基因组比对，用dnastar、augustus等生物学软件分析预测，获知seqidno：5序列即为鸭wpkci基因的全长cds序列，其长度为363bp，seqidno：6序列即为鸭wpkci基因的全长dna序列，其长度为3257bp。seqidno：5序列的1-137为外显子1(137bp)、138-243为外显子2(106bp)、244-363为外显子3(120bp)；seqidno：6序列的1-137为外显子1(137bp)、138-2327为内含子1(2190bp)、2328-2433为外显子2(106bp)、2434-3137内含子2(704bp)、3138-3257为外显子3(120bp)
实施例2鸭不同组织性别鉴定
1、分别采集成年雌性、雄性沔阳麻鸭(武汉市农业科学院畜牧兽医研究所实验鸭场)的胸肌、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌胃、小肠、睾丸、卵巢组织，每个组织采集5个个体(性别已知)，使用trizol试剂(购自thermofisher公司)分别提取各组织总rna，以提取的rna为模板合成cdna的第一链。
2、以合成的cdna第一链为模板，以内参基因β-actin的引物actl和actr进行pcr扩增同时调整cdna的浓度，pcr反应按照takarataq(购自takara公司)说明书进行，反应程序为：98℃2min、98℃10s、59℃10s、72℃10s，共35个循环，72℃延伸5min。pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，根据pcr产物条带亮度调整相应cdna浓度，使所有cdna浓度基本一致。
3、以调整的cdna为模板，用鸭性别鉴定用引物dwl和dwr以及内参基因引物actl和actr同时扩增wpkci基因与β-actin内参基因(196bp)。pcr反应体系(总体积15μl)：10×buffer1.5μl、dntp(2.5mm)0.3μl、上游引物dwl(10μm)0.5μl、上游引物actl(10μm)0.3μl、下游引物dwr(10μm)0.5μl、下游引物actr(10μm)0.3μl、taq酶(2.5u)0.2μl、cdna1μl、灭菌去离子水10.4μl。pcr反应程序为：98℃2min、98℃10s、59℃10s、72℃10s，共35个循环，72℃延伸5min。pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果如图3所示，所有雄性的胸肌、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌胃、小肠、睾丸组织cdna样品均检测出一条带(196bp)，所有雌性的胸肌、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌胃、小肠、卵巢组织cdna样品均检测出三条带(363bp、255bp、196bp)，准确率100％。结果表明，用鸭不同组织均可使用本发明的引物、方法及试剂盒进行基于rt-pcr的鸭性别鉴定。
实施例3不同鸭血液样品的性别鉴定
分别采集成年雌性、雄性沔阳麻鸭、连城白鸭、樱桃谷鸭、江汉肉鸭a品系、江汉肉鸭b品系(武汉市农业科学院畜牧兽医研究所实验鸭场)血液样品，每个品种/品系雌性、雄性各采集5个个体(性别已知)，使用trizol试剂分别提取各血液样品总rna，接下来步骤与实施例2相同。
结果如图4所示，所有雄性的血液cdna样品均检测出一条带(196bp)，所有雌性的血液cdna样品均检测出三条带(363bp、255bp、196bp)，准确率100％。
实施例4鸭不同个体pcr与rt-pcr鉴定结果对比
采集1周龄公母混养的沔阳麻鸭(武汉市农业科学院畜牧兽医研究所实验鸭场)血液样品，共采集50个个体(性别未知)，分别使用dna提取试剂盒(购自天根公司)、trizol试剂(购自thermofisher公司)提取各血液样品的dna与rna。
以rna为模板进行鉴定的方法同实施例2和实施例3，结果如图5a所示；
根据genbank中鸡chd1-z(登录号：ac186875.2)和chd1-w(登录号：ac177807.2)基因序列，设计引物(参考文献：刘宏祥等，2014，快速鉴定主要禽类性别的一对新的通用引物)，上游引物chdf和下游引物chdr的序列分别为seqidno:7和seqidno:8,
其中seqidno:7的序列为tgcagaagcaatattacaagt3
seqidno:8的序列为aattcattatcatctggtgg
提取的dna为模板，用引物chdf和chdr扩增鸭chd1-z(467bp)和chd1-w基因(326bp)，从dna水平鉴定性别。pcr反应按照takarataq(购自takara公司)说明书进行，反应程序为：98℃2min、98℃10s、49℃20s、72℃30s，共35个循环，72℃延伸5min。pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5b所示，根据pcr产物条带的条带数目判定性别：检测出一条带(467bp)即为雄性，检测出两条带(467bp与326bp)即为雌性。
图5a和图5b结果表明，用本发明的基于rt-pcr的鸭性别鉴定用引物、鉴定方法和试剂盒与用dna进行性别鉴定的结果一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。