一种提高硒蛋白TrxR表达的方法与流程

本发明属于蛋白原核表达技术领域，提供一种提高硒蛋白TrxR表达的方法。

背景技术：

哺乳动物硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)是一类非常重要的硒蛋白。TrxR通过调控硫氧还蛋白(Trx)活性和氧化还原状态来调控细胞增殖、活性和凋亡，与肿瘤等疾病发病机制密切相关，维持着生物体的氧化还原平衡。其中分布最广的是位于细胞质和细胞核的TrxR。

对于硒蛋白的表达，Rengby等获得硒蛋白生物合成的“2.4/24/24”表达方法，在对数末期(OD600nm＝2.4)加入诱导剂IPTG，24℃诱导表达24h后收获菌体，已经成为硒蛋白表达的规范(Rengby O,Johansson L,Carlson L A,et al.Assessment of Production Conditions for Efficient Use of Escherichia coli in High-Yield Heterologous Recombinant Selenoprotein Synthesis[J].Applied &Environmental Microbiology,2004,70(9):5159-5167.)。史金铭等构建了含硒GST融合表达系统，借助大肠杆菌BL21进行表达，每升大肠杆菌发酵液中能得到0.924mg含硒GST融合蛋白(史金铭.含硒谷胱甘肽硫转移酶在大肠杆菌中的表达[D].吉林大学,2004.)。

现有硒蛋白的表达方法普遍存在表达量不高的问题，极大的影响了后续硒蛋白的分离纯化，限制了对硒蛋白的进一步研究。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高硒蛋白TrxR表达的方法。

本发明的技术方案为：

一种提高硒蛋白TrxR表达的方法，包括以下步骤：

(1)培养菌种

将可以表达TrxR的甘油菌保平板划线，置于37℃恒温培养箱里培养，挑取平板上长出的单菌落转入到少量rich型LB培养基中，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使LB培养基中四环素的终浓度为15μg/ml，卡那霉素的终浓度为50μg/ml，氯霉素的终浓度为34μg/ml。使用摇床在37℃、220rpm的条件下摇菌10-14小时。

(2)大量培养表达菌株

在玻璃摇瓶中装入适量体积的rich型LB培养基，按照2％的比例接入事先培养好的表达菌种，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使LB培养基中三种抗生素终浓度分别为15μg/ml、50μg/ml和34μg/ml，使用摇床在37℃、220rpm的条件下培养8-10小时至对数生长末期，此时表达菌液的OD 600nm约为3.6。

(3)低温诱导表达TrxR

在对数生长末期时，向LB培养基中加入二价金属离子Mn²⁺、Ca²⁺或Mg²⁺中的任一一种、异丙基硫代半乳糖苷IPTG、亚硒酸钠selenite、L-半胱氨酸L-cysteine，在24℃、220rpm条件下低温诱导表达24h；加入二价金属离子可以提高TrxR表达。

所述步骤(3)中向LB培养基加入IPTG、selenite、L-cysteine量分别为：每50ml的LB培养基对应加入50μl的0.5M IPTG，50μl的5mM selenite和50μl的100mg/ml L-cysteine。LB培养基中加入二价金属离子的量为：每50ml的LB培养基对应加入2.5-15μl的1M Mn²⁺使Mn²⁺终浓度为50-300μM，或每50ml的LB培养基对应加入5-50μl的1M Ca²⁺使Ca²⁺终浓度为100-1000μM，或每50ml的LB培养基对应加入5-25μl的1M Mg²⁺使Mg²⁺终浓度为100-500μM。

所述步骤(1)中摇菌的时间优选为12小时。

所述步骤(2)中玻璃摇瓶中的rich型LB培养基体积为20％。

所述步骤(2)中培养时间优选为9小时。

所述步骤(3)中加入二价金属离子形式优选为MnCl2、CaCl2和MgCl2。

所述步骤(3)中Mn²⁺的终浓度优选为100μM，此时促进表达效果较好，酶体积活力约提高26％；Ca²⁺的终浓度优选为400μM，此时促进表达效果较好，酶体积活力约提高44％；Mg²⁺的终浓度优选为300μM，此时促进表达效果较好，酶体积活力约提高189％。

相比现有技术，本发明可明显提高硒蛋白TrxR的表达，方法简便，且二价金属离子原料易得、成本低廉。

附图说明

图1是Mn²⁺Ca²⁺和Mg²⁺提高硒蛋白TrxR表达。

具体实施方式

结合实施例详细阐述本发明的具体实施方式如下：

实施例1

使用250ml玻璃三角摇瓶实验，加入50ml LB培养基，50μl的15mg/ml四环素，50μl的50mg/ml卡那霉素和50μl的34mg/ml氯霉素，1ml接菌量。使用摇床在37℃、220rpm条件下培养至对数生长末期，添加50μl的0.5M IPTG、50μl的5mM selenite、50μl的100mg/ml L-cysteine和2.5-15μl的1M MnCl2，然后24℃低温诱导表达24h。取出1ml菌液，离心弃上清，加入50μl TE buffer，1μl 1mg/ml溶菌酶，反复冻融3次，使细菌破碎蛋白溶出，13,000rpm高速离心10min，收集上清即为含有TrxR的粗酶液。使用DTNB法测试活力，以酶体积活力为指标，发现Mn²⁺在一定的浓度范围内可以促进TrxR的表达。当Mn²⁺的浓度为100μM时，促进表达的效果较好，酶体积活力提高26％。

实施例2

使用250ml玻璃三角摇瓶实验，加入50ml LB培养基，50μl的15mg/ml四环素，50μl的50mg/ml卡那霉素和50μl的34mg/ml氯霉素，1ml接菌量。使用摇床在37℃、220rpm条件下培养至对数生长末期，添加50μl的0.5M IPTG、50μl的5mM selenite、50μl的100mg/ml L-cysteine和5-50μl的1M CaCl2，然后24℃低温诱导表达24h。取出1ml菌液，离心弃上清，加入50μl TE buffer，1μl 1mg/ml溶菌酶，反复冻融3次，使细菌破碎蛋白溶出，13,000rpm高速离心10min，收集上清即为含有TrxR的粗酶液。使用DTNB法测试活力，以酶体积活力为指标，发现Ca²⁺在一定的浓度范围内可以促进TrxR的表达。当Ca²⁺的浓度为400μM时，促进表达的效果较好，酶体积活力约提高44％。

实施例3

使用250ml玻璃三角摇瓶实验，加入50ml LB培养基，50μl的15mg/ml四环素，50μl的50mg/ml卡那霉素和50μl的34mg/ml氯霉素，1ml接菌量。使用摇床在37℃、220rpm条件下培养至对数生长末期，添加50μl的0.5M IPTG、50μl的5mM selenite、50μl的100mg/ml L-cysteine和5-25μl的1M MgCl2，然后24℃低温诱导表达24h。取出1ml菌液，离心弃上清，加入50μl TE buffer，1μl 1mg/ml溶菌酶，反复冻融3次，使细菌破碎蛋白溶出，13,000rpm高速离心10min，收集上清即为含有TrxR的粗酶液。使用DTNB法测试活力，以酶体积活力为指标，发现Mg²⁺在一定的浓度范围内可以促进TrxR的表达。当Mg²⁺的浓度为300μM时，促进表达的效果较好，酶体积活力约提高189％。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。