本发明涉及罗湖病毒检测试剂技术领域，尤其涉及一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒。
背景技术：
罗非鱼(tilapine)是世界范围内养殖鱼类的第二重要群组，年产量531万吨(联合国粮食及农业组织(foodandagricultureorganization)2014),并且它们作为发展中国家的主要蛋白质来源。罗非鱼是全球重要淡水养殖经济鱼种之一，可进行高密度养殖，是动物性蛋白质的重要来源。但是从2009年夏天开始，遍布以色列的养鱼场均记录到罗非鱼的大规模损失事件。鱼发病和死亡保持局限于罗非鱼及其杂种。发现与罗非鱼一个群落饲养的数个物种完全无症状，甚至在长期的共栖后也是如此。
2014年，marinaeyngo等研究发现，导致以色列罗非鱼大量死亡的病原体是一种新型rna病毒。2016年，eranbacharach等采用无偏倚高通量测序、northern杂交、质谱分析、原位杂交、感染性研究等方法，发现导致以色列罗非鱼大量死亡的罗湖病毒是正粘病毒样病毒，为rna单股负链病毒，由10个独特的基因片段组成，每个片段大小分别为1.641kb、1.471kb、1.371kb、1.250kb、1.099kb、1.044kb、0.777kb、0.657kb、0.548kb和0.465kb。最大的第1片段包含一个开放阅读框，与c型流感病毒pb1有弱同源性。其他9个片段在genbank中未发现与任何核酸、蛋白同源序列。10个片段中，在5’和3’末端均发现有长度为13个核苷酸的保守序列，与流感病毒、isa病毒、瑟高特病毒等正粘病毒的基因结果特征一致，其中有10个核苷酸100％保守，另外3个核苷酸在5、9片段上完全一致，而且5’和3’末端的序列呈现互补的特点。高通量测序和序列分析显示，罗湖病毒pcr阳性样品与以色列样品中获得核酸序列有97％～99％相同，相应编码区对应的氨基酸序列有98.7％～100％相同。地理上分散的2个地方均出现有tilv导致的大规模死于事件，说明该病毒已经对罗非鱼养殖造成了全球性威胁。鉴于此，如何提供一种快速、准确、灵敏、操作简单的检测是否感染tilv病毒的引物组和试剂盒是本领域技术人员需要解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中罗湖病毒无法准确、及时、灵敏的进行甄别的技术问题，而提出一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：设计一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组，所述的环介导等温扩增引物组由第一引物组、第二引物组和第三引物组按照1:1:1的比例混合而成。
优选的，所述的第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，所述的第一上游引物的dna序列为5’-gaataataaagtgagcttaag-3’，所述的第一下游引物的dna序列为5’-cagggaaagtactgcatagcg-3’，所述的第一引物组中的第一上游引物和第一下游引体积比为1:1。
优选的，所述的第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物，所述的第二上游引物的dna序列为5’-agcctagcaactgtacaatcg-3’，所述的第二下游引物的dna序列为5’-gacgctacgatcagtacacga-3’，所述的第二引物组中的第二上游引物和第二下游引体积比为1:1。
优选的，所述的第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物，所述的第三上游引物的dna序列为5’-ccgattagtcgatgagatgca-3’，所述的第三下游引物的dna序列为5’-gcaatgcatacggatcgacga-3’，所述的第三引物组中的第三上游引物和第三下游引体积比为1:1。
设计一种含有环介导等温扩增引物组的试剂盒，所述的试剂盒包括：40nmol的第一引物组、5nmol的第二引物组、20nmol的第三引物组、15μl的反应浓缩液、20μl的阳性对照液、20μl的阴性对照液和1μl的逆转录酶。
优选的，所述的反应浓缩液包括聚合酶、buffer、dntp、mgso4、betaine、荧光染料evagreen。
优选的，所述的阳性对照液为含有罗湖病毒目的基因的大肠杆菌质粒dna。
优选的，所述的阴性对照液为不含有罗湖病毒目的基因的大肠杆菌质粒dna。
优选的，所述的试剂盒中第一引物组、第二引物组、第三引物组、反应浓缩液、阳性对照液、阴性对照液和逆转录酶在使用前分别包装在不同的包装中。
优选的，所述的试剂盒与等温扩增荧光检测仪、定量pcr仪或恒温金属浴配合使用。
本发明提出的一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒，有益效果在于：
(1)本发明的引物组提供有6条高特异性的引物：6条引物对应目标序列6个特异区域的识别保证了检测反应的高度特异性；
(2)本发明提出的试剂盒，其检测快速、准确、灵敏且操作简单，可对罗非鱼是否感染罗湖病毒进行快速定性检测；
(3)本发明提出的试剂盒，简化了检测过程，降低了对操作人员的专业要求，使得非专业人员可以顺利完成检测工作；
(4)本发明试剂盒可用于多个检测平台上，不仅可以用在等温扩增荧光检测仪和定量pcr仪，也可以用在其他可以提供恒定温度的设备上如金属浴等。
附图说明
图1为本发明实施例二的扩增曲线
图2为本发明实施例二的溶解曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
本发明的一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组，所述的环介导等温扩增引物组由第一引物组、第二引物组和第三引物组按照1:1:1的比例混合而成。
优选的，所述的第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，所述的第一上游引物的dna序列为5’-gaataataaagtgagcttaag-3’，所述的第一下游引物的dna序列为5’-cagggaaagtactgcatagcg-3’，所述的第一引物组中的第一上游引物和第一下游引体积比为1:1。
优选的，所述的第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物，所述的第二上游引物的dna序列为5’-agcctagcaactgtacaatcg-3’，所述的第二下游引物的dna序列为5’-gacgctacgatcagtacacga-3’，所述的第二引物组中的第二上游引物和第二下游引体积比为1:1。
优选的，所述的第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物，所述的第三上游引物的dna序列为5’-ccgattagtcgatgagatgca-3’，所述的第三下游引物的dna序列为5’-gcaatgcatacggatcgacga-3’，所述的第三引物组中的第三上游引物和第三下游引体积比为1:1。
本发明的一种含有环介导等温扩增引物组的试剂盒，所述的试剂盒包括：40nmol的第一引物组、5nmol的第二引物组、20nmol的第三引物组、15μl的反应浓缩液、20μl的阳性对照液、20μl的阴性对照液和1μl的逆转录酶。
优选的，所述的反应浓缩液包括聚合酶、buffer、dntp、mgso4、betaine、荧光染料evagreen。
优选的，所述的阳性对照液为含有罗湖病毒目的基因的大肠杆菌质粒dna。
优选的，所述的阴性对照液为不含有罗湖病毒目的基因的大肠杆菌质粒dna。
优选的，所述的试剂盒中第一引物组、第二引物组、第三引物组、反应浓缩液、阳性对照液、阴性对照液和逆转录酶在使用前分别包装在不同的包装中。
优选的，所述的试剂盒与等温扩增荧光检测仪、定量pcr仪或恒温金属浴配合使用。
实施例二
选取实施例一含有罗湖病毒目标序列的重组质粒的大肠杆菌作为实验用材料，使用质粒提取试剂盒提取小剂量重组质粒dna，利用环介导等温扩增检测技术扩增总体系25ul，包括反应浓缩液15ul、环介导等温扩增引物混合液6ul、逆转录酶1ul、反应样本3ul。混匀后放入定量pcr仪。同时使用pcr方法检测，设置65℃、30s/循环，60个循环，多次试验后最终获得的扩增曲线、溶解曲线，参阅附图1-附图2所示。扩增曲线中只用罗湖病毒样品有扩增，其他病毒核酸样品并无扩增，同时扩增产生的溶解曲线峰型单一且尖锐，说明罗湖病毒检测引物组特异性好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。