本发明涉及天然产物领域。其特征是以灰毡毛忍冬(loniceramacranthoideshand.-mazz.)的根为原料，通过天然产物化学方法提取分离，得到的一种新化合物，其骨架属于syn-海松烷型(syn-pimarane)二萜，该化合物对农业病原真菌具有较强抑制作用，可用于制备抗农业病原真菌药物。
背景技术：
我国是农业大国，农药是防治农业病害的主要工具。传统化学农药通常选择性差、毒性大、残留时间长，在使用过程中存在农药残留严重、危害人畜健康、污染环境等问题。生物农药是指那些由植物提取物、微生物活体或微生物产生的代谢产物制成的具有农药属性的产品，由于源自生物，不论其组成和结构如何复杂，归根结底是由碳水化合物等经不同途径代谢而来，因而其组成通常是碳、氧、氧、氮四种元素，偶见其它元素。生物农药通常容易降解，进入自然界的碳、氮循环，对环境没有太多污染。开发高效低毒生物农药新品种对我国农业生产具有十分重要的意义。
海松烷型二萜为三环二萜，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种生物活性。尤其是，近年来研究表明syn-海松烷型二萜是水稻抗稻瘟病植保素，对稻瘟病菌有很好的抗菌活性，是一类很重要的抗菌素(lee,c.w.,yoneyama,k.,takeuchi,y.,konnai,m.,tamogami,s.,kodama,o.,1999.momilactonesaandbinricestrawharvestedatdifferentgrowthstages.biosci.biotech.bioch.,63,1318–1320；nozaki,h.,hayashi,k.i.,nishimura,n.,kawaide,h.,matsuo,a.,takaoka,d.,2007.momilactoneaandbasallelochemicalsfrommosshypnumplumaeforme:firstoccurrenceinbryophytes.biosci.biotechnol.biochem.,71,3127-3130.)，引起了广泛关注。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种新的海松烷型二萜酯类化合物，以及其制备方法和在抗农业病原真菌药物中的用途。
本发明采用的技术方案是：一种下列结构式的新海松烷型二萜酯类化合物，命名为灰毡毛忍冬乙素(lonimacranthoidinb)，其特征在于化学名为9,10-syn-16-o-千里光酰基-2β,3β,15r-三羟基海松-7-烯，化学结构式为：
进一步，所述的二萜酯类化合物命名为灰毡毛忍冬乙素(lonimacranthoidinb)，按如下方法制备：以灰毡毛忍冬(loniceramacranthoideshand.-mazz.)的根为原料，经用5～6倍原料体积的醇、水或其混合物回流提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液，合并提取液，减压浓缩至0.5-1.5倍原料量体积，按1：1～3体积加入石油醚和乙酸乙酯依次分别萃取；石油醚萃取物萃取物经柱层析分离而得。柱层析用担体选自硅胶、凝胶、反相硅胶中的一种或几种；有机溶剂包括甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯；提取温度低于100℃。
进一步，式命名为灰毡毛忍冬乙素(lonimacranthoidinb)所示化合物对稻瘟病菌(magnaportheoryzae)有效中浓度(ec50)为10.41±2.90μgml-1，本发明为抗农业病原真菌药物筛选提供了新的先导化合物。
附图说明
图1为化合物命名为灰毡毛忍冬乙素(lonimacranthoidinb)的a环hmbc及1h-1hcosy相关信号
图2为化合物命名为灰毡毛忍冬乙素(lonimacranthoidinb)的b环1h-1hcosy相关信号
具体实施方式
实施例1：将晾干的灰毡毛忍冬根5kg切成0.2～0.3cm每段，加入6倍生药体积的95％乙醇，回流提取2次，每次2h，合并粗提液，70℃减压浓缩至0.5倍药材量体积，再按1：2体积依次加入石油醚和乙酸乙酯分别萃取3次，合并石油醚和乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，得到石油醚萃取物14g和乙酸乙酯萃取物200g。取石油醚萃取物，用硅胶柱层析分段，以石油醚、石油醚-乙酸乙酯(100:1)、石油醚-乙酸乙酯(20:1)、石油醚-乙酸乙酯(4:1)、石油醚-乙酸乙酯(1:1)溶液洗脱，合并组分相似的洗脱液，浓缩后得f1-1～f1-5共5个部分。再综合运用硅胶柱层析、凝胶lh-20柱层析、重结晶等方法,从f1-3部分分离得到化合物灰毡毛忍冬乙素(30mg)，得率为0.0006％。再综合运用各种波谱技术(ms,nmr,uv,ir)和x-射线单晶衍射技术，鉴定化合物灰毡毛忍冬乙素的结构。
化合物灰毡毛忍冬乙素的理化性质及波谱数据：化合物灰毡毛忍冬乙素的鉴定，无色透明方晶(氯仿/丙酮1:1)，tlc香草醛-浓硫酸试液加热显紫红色，liebermann-burchard反应阳性。微溶于氯仿，易溶于氯仿/甲醇和氯仿/丙酮混合溶液。紫外光谱218nm有最大吸收；ir光谱显示有羟基(3396cm-1)，不饱和羰基(1718cm-1)，非共轭双键(1648cm-1)，以上信息提示该化合物为萜类化合物，且分子内含羰基，双键及羟基。hr-esi-ms(m/z)：[m+na]+atm/z443.2807(calculated:443.2768for[c25h40o5+na]+)，结合13c-nmr和dept谱推断分子式为c25h40o5，分子量420，不饱和度为6。
分析1d、2d-nmr谱，可知灰毡毛忍冬乙素是由一个二萜片段和含5个碳的侧链通过酯键连接而成。通过2d-nmr进一步归属灰毡毛忍冬乙素二萜片段的1h、13c-nmr数据(表1)，发现该片段结构与已知化合物16-o-acetyldarutigenol(参考文献：wangf,chengx-l,liy-j,shis,liuj-k.ent-pimaranediterpenoidsfromsiegesbeckiaorientalisandstructurerevisionofarelatedcompound[j].journalofnaturalproducts.2009,72,2005-2008.)相似，其母核为海松烷型二萜。与16-o-acetyldarutigenol相比，灰毡毛忍冬乙素的差别主要在c-2位多接一个羟基及双键位置，其中羟基的位置由hmbc及1h-1hcosy(图1)确证；而双键位置是由1h-1hcosy谱中h-5(δh1.30)与h-6(δh2.06)、h-6(δh2.06)与h-7(δh5.35)相关(图2)，因此7,8位为双键(δc121.155,137.564)。至此推断灰毡毛忍冬乙素的二萜母核结构。分析灰毡毛忍冬乙素的1h、13c-nmr谱(表1)，除二萜片段还有5个碳信号，分别是2个季碳(δc168.3、158.4)，1个叔碳(δc116.8)，和2个角甲基碳(δc27.3,20.3)；根据hsqc谱可找到相对应的烯氢信号(δh5.73,s)和角甲基氢(δh2.16,s,1.91,s)。再根据其hmbc、1h-1hcosy、roesy谱，可确定该5碳片段为千里光酰基。千里光酰基的连接位置可由hmbc谱确定，由hmbc中千里光酰基的羰基碳(δc168.3)与二萜片段中h-16(δha3.93，δhb4.30)的相关信号确定千里光酰基接在灰毡毛忍冬乙素海松烷型二萜片段的c-16上。至此确定了灰毡毛忍冬乙素的平面结构为9,10-syn-16-o-千里光酰基-2β,3β,15-三羟基海松-7-烯(9,10-syn-16-o-senecioyl-2β,3β,15-trihydroxypimar-7-ene)。
化合物灰毡毛忍冬乙素相对构型的确定，roesy上(表1)显示h3-19/h3-20，h-9/h3-20，h-9/h-12β和h-15/h-12β相关，则h3-19，h3-20，h-9，h-12β，h-15位于面上β位；roesy上显示h-3/h-5，h-3/h3-18和h-3/h-2相关，以及h3-17与h-5(或者h3-20,h3-19)无相关(wang,p.,li,r.j.,liu,r.h.,jian,k.l.,yang,m.h.,yang,l.,kong,l.y.,luo,j.,2016.sarglaperoxidesaandb,sesquiterpene–normonoterpeneconjugateswithaperoxidebridgefromtheseedsofsarcandraglabra.org.lett.,18,832-835.)，则h-2，h-3，h-5，h3-18，h3-17位于面下α位。根据化合物灰毡毛忍冬乙素与该植物中灰毡毛忍冬甲素(9,10-syn-2β,3β,15r,16-tetrahydroxypimar-7-ene)具有相同生物合成来源，推定化合物灰毡毛忍冬乙素与灰毡毛忍冬甲素具有相同的绝对构型。至此化合物灰毡毛忍冬乙素(lonimacranthoidinb)的构型已确定，为9,10-syn-16-o-千里光酰基-2β,3β,15r-三羟基海松-7-烯(9,10-syn-16-o-senecioyl-2β,3β,15r-trihydroxypimar-7-ene)。
表1.化合物灰毡毛忍冬乙素(lonimacranthoidinb)的核磁共振波谱数据
a.dataweremeasuredat500mhzfor1hand125mhzfor13cinmethanol-d4,δinppm,jinhz.
b.overlappedsignal,assignmentsweredonebyhsqc,hmbc,andcosyexperiments。
uplc-hresi-ms法测定化合物灰毡毛忍冬乙素的纯度，色谱条件为：色谱柱c18(zorbaxsbc18，4.6×100mm，1.8μm)，柱温：25℃，流动相：乙腈-水(含0.1％甲酸)梯度洗脱(0～10min乙腈浓度由5％变化至10％，10～20min乙腈浓度为10％，20～40min乙腈浓度10％变化至23％，40～70min乙腈浓度由23％变化至38％，70～90min乙腈浓度由38％变化至50％，90～100min乙腈浓度为100％)，流速：0.3mlmin-1，进样量：5μl；质谱检测器为6530esiq-tofms(agilent,usa)，检测检测模式为阴离子，检测范围为m/z100–1700。化合物灰毡毛忍冬乙素的保留时间分别为71.9min，按面积归一化法计算化合物灰毡毛忍冬乙素的纯度为97.7％。
实施例2：将晾干的灰毡毛忍冬根5kg切成0.2～0.3cm每段，加入5倍生药体积的甲醇，回流提取3次，每次1.5h，合并粗提液，50℃减压浓缩至0.5倍药材量体积，再按1：1体积依次加入石油醚和乙酸乙酯分别萃取3次，合并石油醚和乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，得到石油醚萃取物16g和乙酸乙酯萃取物220g。再综合运用硅胶柱层析、凝胶lh-20柱层析、重结晶等方法，从石油醚萃取物中分离得到化合物灰毡毛忍冬乙素(40mg)，得率为0.0008％，uplc-hresi-ms检测产物的纯度为97.8％。
实施例3：将晾干的灰毡毛忍冬根10kg切成0.2～0.3cm每段，加入6倍生药体积的80％甲醇/水，回流提取2次，每次2h，合并粗提液，50℃减压浓缩至1.5倍药材量体积，再按1：2体积依次加入石油醚和乙酸乙酯分别萃取5次，合并石油醚和乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，得到石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物。再综合运用硅胶柱层析、凝胶lh-20柱层析、重结晶等方法，从石油醚萃取物中分离得到化合物灰毡毛忍冬乙素(74mg)，得率为0.00074％，uplc-hresi-ms检测产物的纯度为97.4％。
实施例4：将晾干的灰毡毛忍冬根10kg切成0.2～0.3cm每段，加入5倍生药体积的水，回流提取3次，每次2h，合并粗提液，减压浓缩至1.5倍药材量体积，再按1：2体积依次加入石油醚和乙酸乙酯分别萃取3次，合并石油醚和乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，得到石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物。再综合运用硅胶柱层析、凝胶lh-20柱层析、重结晶等方法，从石油醚萃取物中分离得到化合物灰毡毛忍冬乙素(68mg)，得率为0.00068％，uplc-hresi-ms检测产物的纯度为97.6％。
实施例5：化合物灰毡毛忍冬乙素抗稻瘟病菌活性测定。
供试稻瘟病菌(magnaportheoryzae)为田间采集分离菌株。将化合物灰毡毛忍冬乙素和对照药剂甲基硫菌灵(mildothane)溶于dmso，配制成浓度为10000μg/ml的母液，并用dmso倍半稀释成7个系列浓度梯度待用。将母液或等体积dmso加入加热融化并冷却至55℃的psa培养基(马铃薯浸出液200g、琼脂16g、蔗糖20g、蒸馏水1000ml)中，混匀后倒入培养皿中制成含药平板，冷凝静置。用直径5mm的打孔器在预培养的菌落边缘打取菌碟，并接种至含药平板中间，重复3次。25℃恒温倒置培养至对照接近长满平板，十字交叉法测定菌落直径并计算抑制率。抑制率(％)＝(对照菌落直径﹣加药处理菌落直径)/对照菌落直径×100。菌落直径＝十字交叉法测定直径平均值-5mm。根据各浓度抑制率使用dpsv7.05计算毒力回归方程，得出化合物灰毡毛忍冬乙素的抑制有效中浓度(ed50)。测定结果如下表2。
表2.化合物灰毡毛忍冬乙素(lonimacranthoidinb)抗稻瘟病菌活性(ec50,μgml-1)
a.该值为平均标准偏差(±sd)。