本发明涉及一种利用三相体系分离真菌胞外多糖的方法，特指叔丁醇和无机盐硫酸铵组成的体系用于真菌胞外多糖的选择性分离，属于生物活性物质分离纯化技术领域。
背景技术：
目前，国内外从真菌液体发酵液中获得胞外多糖的方法主要是乙醇沉淀法。然而，醇沉过程需要大量的乙醇，这对乙醇造成了极大的浪费，且粗多糖需要除蛋白、脱色等分离过程，操作过程繁琐。常用的除蛋白方法-sevag法需要用到三氯甲烷，其遇光照会与空气中的氧作用，逐渐分解而生成剧毒的光气和氯化氢，严重影响操作者的健康，对环境也造成了极大的污染，不符合“绿色”化学的要求。因此，一种绿色、高效、快速分离真菌胞外多糖的方法显得尤为重要。
近年来，三相分离法(three-phasepartitioning,tpp)作为一种新发展的分离生物活性物质的方法已用于蛋白质、酶、氨基酸及植物油等的分离、浓缩和纯化。该法设备简单、操作简便快速，试剂可重复使用，叔丁醇沸点高于甲醇、乙醇和己烷，安全性高。在三相分离中，叔丁醇不仅可以作为有机溶剂溶解非极性物质，而且还能够与蛋白质结合，促使形成三相。同时，游离蛋白质以固体的形式富集于中间相，能够代替传统sevag法用于多糖中游离蛋白的去除。因此，利用三相分离法直接从液体发酵液中分离真菌胞外多糖具有潜在的工业化应用效果和可行性。
经检索，目前还未见利用叔丁醇和无机盐硫酸铵组成的体系用于真菌胞外多糖选择性分离的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用三相体系分离真菌胞外多糖的方法，以实现“绿色”、高效、快速、选择性分离真菌胞外多糖。
为了解决以上技术问题，本发明利用三相体系用于真菌胞外多糖的选择性分离，以下层无机盐相中多糖提取率和蛋白质残留率为指标，优化分离条件。具体技术方案如下：
一种利用三相体系分离真菌胞外多糖的方法，按照下述步骤进行：
步骤一，超声波预处理：取真菌发酵液离心管中，置于超声波洗槽中，以15w/cm3超声波处理10min；
步骤二，利用三相体系分离真菌胞外多糖：将步骤一中超声波预处理后的发酵液加入硫酸铵，振荡溶解后，加入叔丁醇，拧紧离心管盖，在35℃的恒温水浴中振荡30min，4500rpm离心分离10min，取出下层无机盐相；
步骤三，制备真菌胞外多糖：将步骤二中所述的含有真菌胞外多糖的下层无机盐相蒸馏水透析48h，浓缩，喷雾干燥，得到真菌胞外多糖固体粉末；
步骤四，回收叔丁醇：将步骤二中所得的上层含有色素等杂质的叔丁醇有机相，≤30℃旋转蒸发，回收叔丁醇。
步骤一所述真菌发酵液为桑黄、灵芝、冬虫夏草、香菇、猴头菇、金针菇发酵液中的任一种。
步骤二所述的三相体系由叔丁醇、硫酸铵和真菌发酵液组成，形成三相后中间固体相为蛋白质层；所述硫酸铵、叔丁醇、发酵液质量比例为：(0.1～0.3):(0.8～1.6):1.0；
步骤三所述透析方法为使用透析袋；所述透析袋的分子截留量为6000～8000da。
本发明具有有益效果。本发明通过将由叔丁醇和无机盐硫酸铵组成的体系用于真菌胞外多糖的选择性分离，以下层无机盐相中多糖提取率和蛋白质残留率为指标，优化分离条件，达到“绿色”、高效、快速、选择性分离真菌胞外多糖的目的，且所分离的胞外多糖具有较高的生物活性。本发明的三相体系适合于大规模工业化生产真菌胞外多糖，叔丁醇可循环使用，安全性高，降低生产成本，且能普遍应用于真菌发酵液如桑黄、灵芝、冬虫夏草、香菇、灰树花、猴头菇、金针菇发酵液中胞外多糖的选择性分离。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本发明以下层无机盐相中多糖提取率和蛋白质残留率来综合评价由叔丁醇和无机盐硫酸铵组成的体系选择性分离真菌胞外多糖的效果。多糖提取率定义为下层无机盐相多糖质量与发酵液中多糖质量的比值，多糖含量测定采用苯酚-硫酸比色法。蛋白质残留率定义为下层无机盐相蛋白质质量与发酵液中蛋白质质量的比值，蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝染色法。
实施例一：以桑黄菌发酵液为研究对象
步骤一，超声波预处理：取真菌发酵液10ml于50ml离心管中，置于超声波洗槽中，以15w/cm3超声波处理10min；
步骤二，利用三相体系分离真菌胞外多糖：将步骤一中超声波预处理的发酵液加入硫酸铵1.0g，振荡溶解后，加入叔丁醇8.0g，硫酸铵、叔丁醇和发酵液三者的质量比为0.1:0.8:1.0。混合液于35℃恒温中水浴振荡30min，4500rpm离心10min。测得下层无机盐相中多糖提取率为56.84％，蛋白质残留率为4.54％。
步骤三，取出步骤二中所得的下层无机盐相，蒸馏水透析48h，喷雾干燥，得桑黄胞外多糖固体粉末。
步骤四，回收叔丁醇：将步骤二中所得的上层含有色素等杂质的叔丁醇有机相，≤30℃旋转蒸发，回收叔丁醇。
实施例二：以冬虫夏草发酵液为研究对象
试验处理过程同实施例一，其不同之处在于其中硫酸铵3.0g，叔丁醇16.0g硫酸铵、叔丁醇和发酵液三者的质量比为0.3:1.6:1.0。测得下层无机盐相中多糖提取率为48.19％，蛋白质残留率为3.92％。
实施例三：以灵芝发酵液为研究对象
试验处理过程同实施例一，其不同之处在于其中硫酸铵2.0g，叔丁醇12.0g硫酸铵、叔丁醇和发酵液三者的质量比为0.2:1.2:1.0。测得下层无机盐相中多糖提取率为52.94％，蛋白质残留率为3.42％。
通过以上实施例可以看出，由叔丁醇和无机盐硫酸铵组成的体系能够用于桑黄、灵芝、冬虫夏草胞外多糖的选择性分离，具有绿色、快速和高效的效果，且发酵液中的游离蛋白主要富集于中间相。