全人源抗人EGFR和Notch2/3多特异性抗体、其制备方法及用途与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种全人源抗人egfr、notch2/3多靶向抗体、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

以手术治疗、放射治疗及化学治疗为主，辅以新型的靶向治疗方案是近年来对恶性肿瘤治疗的基本策略，且已经在临床实践中取得重要的进展。但恶性肿瘤的复发、转移和治疗性耐受依然是一直困扰临床和科研工作者的难题。2006年，在美国癌症研究协会召开的肿瘤干细胞研讨会上，与会学者定义肿瘤干细胞为一种具有自我更新特性、有能力驱动形成多种异质性的肿瘤分化细胞群、具有干细胞特性的癌细胞(wosikowskietal.,1997,alteredgeneexpressionindrug-resistanthumanbreastcancercells,3:2405-2414)。肿瘤干细胞学说以其独特的理论优势和不断丰富的研究支持证据，越来越受到国内外学者的认同和接受。传统治疗方法虽然对肿瘤实体细胞有较好的治疗杀伤效果，但对只占肿瘤细胞群0.2％～10％、并与肿瘤实体细胞具有较大分子表型差异的肿瘤干细胞难有抑制作用。研究肿瘤干细胞在肿瘤产生、发展和转移的重要作用及其机理，以及开发新型的基于肿瘤干细胞学说的抗肿瘤治疗策略及制剂，对恶性肿瘤的治疗具有十分重要的意义。

肿瘤干细胞学说认为：恶性肿瘤起源于一群“干细胞样”的肿瘤细胞，这群细胞被称为肿瘤干细胞(cancerstemcells，cscsorcancer-initiatingcells，cics)。上世纪90年代末，研究人员首先从白血病细胞中分离到肿瘤干细胞并阐述了由肿瘤干细胞驱动的肿瘤异质性分层组织模型(galiziaetal.,2006,prognosticsignificanceofepidermalgrowthfactorreceptorexpressionincoloncancerpatientsundergoingcurativesurgery,13:823-835)。随后，研究人员在多种实体瘤中也证实了肿瘤干细胞的存在和类似的肿瘤异质性组织特点，包括乳腺癌，结肠癌，脑肿瘤，卵巢癌，肺癌，前列腺癌及胰腺癌(mendelsohnandbaselga,2003,statusofepidermalgrowthfactorreceptorantagonistsinthebiologyandtreatmentofcancer,21:2787-2799)。这些证据均表明在大部分血液肿瘤和实体瘤中存在具有干细胞特性的肿瘤细胞。

多项研究显示，肿瘤干细胞在恶性肿瘤发生、发展；肿瘤细胞异质性维持；肿瘤进化；和肿瘤治疗性耐受的过程中发挥重要的作用。其生物学功能具有以下特点：

1)极强的致瘤性。从恶性肿瘤患者的癌灶中直接分离的肿瘤细胞很难在体外形成克隆或移植至免疫缺陷老鼠模型中进行克隆成瘤，而只需要少量的csc就可以在免疫缺陷小鼠模型中克隆成瘤，且肿瘤移植物具有和肿瘤原发灶类似的表型异质性(baselgaandarteaga,2005,criticalupdateandemergingtrendsinepidermalgrowthfactorreceptortargetingincancer,23:2445-2459；galiziaetal.,2006,prognosticsignificanceofepidermalgrowthfactorreceptorexpressionincoloncancerpatientsundergoingcurativesurgery,13:823-835；paoetal.,2005,acquiredresistanceoflungadenocarcinomastogefitiniborerlotinibisassociatedwithasecondmutationintheegfrkinasedomain,2:e73)。

2)复杂的异质性及生物可塑性。csc的来源可能及其复杂，其可能来源于在上皮细胞向间充质细胞转化(epithelial-to-mesenchymaltransition，emt)的过程中获得了自我更新能力的已分化的肿瘤细胞(rielyetal.,2006,clinicalcourseofpatientswithnon–smallcelllungcancerandepidermalgrowthfactorreceptorexon19andexon21mutationstreatedwithgefitiniborerlotinib,12:839-844)；或者来源于由外来微环境因子诱导癌基因性突变的正常组织干细胞(cunninghametal.,2004,cetuximabmonotherapyandcetuximabplusirinotecaninirinotecan-refractorymetastaticcolorectalcancer,351:337-345)。另外，近年来的一些报道也证实csc具有非常复杂的生物可塑性，如在乳腺癌干细胞中可以主要鉴定出两种不同表型的乳腺癌干细胞群：一种上皮样的增生活跃的乳腺癌csc群，表达干细胞标志物aldh；和一种间质样的、相对不活跃但浸润能力强的乳腺癌csc群，其表面标志物表达情况为cd44+/cd24-。这两群csc都能产生各自的上皮样或间质样肿瘤实体细胞子代，同时可以释放分泌信号增强csc的自我更新能力。且在受到肿瘤微环境中细胞因子信号、趋化因子信号、转录调控介导的表观遗传学改变下，两群细胞可以相互转化(hubbard,2005,egfreceptorinhibition:attacksonmultiplefronts,7:287-288)。另外，研究也报道在肝癌中存在不同csc群，如cd133+的csc(huetal.,2013,comparisonoftheinhibitionmechanismsofadalimumabandinfliximabintreatingtumornecrosisfactorα-associateddiseasesfromamolecularview,288:27059-27067)和cd90+/cd44+的肝癌csc(lietal.,2008,structuralbasisforegfreceptorinhibitionbythetherapeuticantibodyimc-11f8,16:216-227)具有不同的干细胞特性。不同的肿瘤类型中干细胞的标志物也往往具有差异，如在胰腺癌中，csc的表面标记物被认为是cd24+(lietal.,2005,structuralbasisforinhibitionoftheepidermalgrowthfactorreceptorbycetuximab,7:301-311)，而对于乳腺csc，则为cd24-。另外，不同恶性肿瘤中csc的含量及比率往往不同，且在恶性肿瘤的不同阶段，csc的比率也会发生复杂的变化。如在结肠癌中，cd133+高表达csc比率约为1.8％～24.5％(mukoharaetal.,2005,differentialeffectsofgefitinibandcetuximabonnon–small-celllungcancersbearingepidermalgrowthfactorreceptormutations,97:1185-1194)，而在接受化疗后，结肠癌csc的比率则会提高(yenetal.,2015,targetingnotchsignalingwithanotch2/notch3antagonist(tarextumab)inhibitstumorgrowthanddecreasestumor-initiatingcellfrequency,21:2084-2095)。而在黑色素瘤中，表达cd133+细胞表面标记的csc的比率在1％～20％之间(chinnaiyanetal.,2005,mechanismsofenhancedradiationresponsefollowingepidermalgrowthfactorreceptorsignalinginhibitionbyerlotinib(tarceva),65:3328-3335)。这些研究结果均提示csc具有极其复杂的异质性及生物可塑性。

3)治疗敏感性差。近年来的一些研究表明，csc对许多目前正在临床中使用的治疗方法耐受，包括多种化疗药物和放射疗法。如有报道显示人急性髓系白血病cd34+/cd38-祖细胞对化疗杀伤作用及fas介导的凋亡作用不敏感(costelloetal.,2000,humanacutemyeloidleukemiacd34+/cd38-progenitorcellshavedecreasedsensitivitytochemotherapyandfas-inducedapoptosis,reducedimmunogenicity,andimpaireddendriticcelltransformationcapacities,60:4403-4411)；且高表达端粒酶，维持染色体的正常结构从而抑制细胞凋亡；高表达多种抗凋亡基因，如bcl-2基因、核转录因子κb(nf-κb)基因、突变型p53基因及c-myc基因等。cd44+/cd24-乳腺癌csc对放射疗法不敏感(arasadaetal.,2014,egfrblockadeenrichesforlungcancerstem–likecellsthroughnotch3-dependentsignaling,74:5572-5584)；cd133+的胶质瘤干细胞具有很强的dna损伤修复能力，对放射疗法不敏感(huetal.,2015,four-in-oneantibodieshavesuperiorcancerinhibitoryactivityagainstegfr,her2,her3,andvegfthroughdisruptionofher/metcrosstalk,75:159-170)；dylla等也报道结肠癌csc在化疗后的裸鼠异种肿瘤模型中细胞比率增高，对化疗不敏感(yenetal.,2015,targetingnotchsignalingwithanotch2/notch3antagonist(tarextumab)inhibitstumorgrowthanddecreasestumor-initiatingcellfrequency,21:2084-2095)。且肿瘤干细胞和正常干细胞都高表达atp结合盒转运蛋白(atp-bindingcassettetransporters，abc)，如abcb1蛋白和abcg2蛋白，前者编码p-糖蛋白，后者是从米托蒽醌耐药细胞中鉴定出来的。abcb1和abcg2介导的外排作用使hoechst33342和rhodamine123等染料不能染色干细胞，证实了abc蛋白是干细胞对化疗不敏感特性的关键(fergusonetal.,2003,egfactivatesitsreceptorbyremovinginteractionsthatautoinhibitectodomaindimerization,11:507-517)。csc具有和正常干细胞相似的多种生物学属性，如相对增殖不活跃、对药物和毒素不敏感、高表达多种abc蛋白、核酸修复能力强、和凋亡抵抗能力(tortoraetal.,1999,cooperativeinhibitoryeffectofnovelmixedbackboneoligonucleotidetargetingproteinkinaseaincombinationwithdocetaxelandanti-epidermalgrowthfactor-receptorantibodyonhumanbreastcancercellgrowth,5:875-881)。另外，csc与正常干细胞类似，与周围的微环境共同形成肿瘤干细胞龛，龛内相对缺氧且能向csc提供大量的维持稳态的生物信号，对外界刺激具有屏障作用。常规的细胞毒性治疗对处在细胞龛内的干细胞影响极小(pettyetal.,2011,highcyclind3expressionconferserlotinibresistanceinaerodigestivetractcancer,74:384-391)。因此，csc可以在放化疗的过程中存活下来，并且重新繁衍肿瘤，最终使得肿瘤复发和治疗性耐受。

4)促转移侵袭能力强。由于肿瘤组织的高度异质性，大部分肿瘤实体细胞并没有侵袭及转移的能力，而csc则具有非常强的侵袭及转移能力。如有报道显示，乳腺癌csc和乳腺癌转移过程中重要的emt过程高度相关，emt样的csc往往定位在于实体肿瘤浸润边缘，并且很容易进入血液循环并在远端形成微小转移灶(fuetal.,2014,insightsintoher2signalingfromstep-by-stepoptimizationofanti-her2antibodies,6:978-990)。这时，csc又可以在一些微环境因子(如id1介导的twist下调(perosaetal.,2003,beta2-microglobulin-freehlaclassiheavychainepitopemimicrybymonoclonalantibodyhc-10-specificpeptide,171:1918-1926)作用下转变为高增值活性的上皮态csc，最终完成乳腺癌转移过程。在胰腺癌中，表达cd133+/cxcr4+细胞表面标记的的csc也常常定位在肿瘤浸润边缘，容易进入血液，且其高表达趋化因子受体。在cxcr4趋化因子的作用下，该类csc很容易转移到肝脏中(garneretal.,2013,anantibodythatlocksher3intheinactiveconformationinhibitstumorgrowthdrivenbyher2orneuregulin,73:6024-6035)。上述研究均提示csc在恶性肿瘤的浸润和转移中起着非常重要的作用。

综上所述，csc具有致瘤性强、复杂的异质性及生物可塑性、转移侵袭能力强、且治疗敏感性差。肿瘤组织经过常规的细胞毒性治疗后，如放化疗和生物靶向治疗后，残存的高致瘤性csc开始增强增殖活性并开始扩张并驱动肿瘤组织生长，表现为临床肿瘤复发。在上述理论和研究的基础上，众多研究学者认为，靶向csc细胞群的治疗策略将补充现有治疗策略的不足，并能显著的提高肿瘤治疗水平(bonneretal.,2006,radiotherapypluscetuximabforsquamous-cellcarcinomaoftheheadandneck,354:567-578；keysarandjimeno,2010,morethanmarkers:biologicalsignificanceofcancerstemcell-definingmolecules,9:2450-2457)。

目前的研究已明确，csc中存在失调的信号通路，其对csc的调控至关重要，包括wnt信号通路，notch信号通路，和hedgehog信号通路等(shienetal.,2013,acquiredresistancetoegfrinhibitorsisassociatedwithamanifestationofstemcell–likepropertiesincancercells,73:3051-3061)。1916年，notch基因首次在果蝇体内被发现，该基因的突变体可使果蝇翅膀边缘产生缺口，因此得名。完整的notch信号通路包括跨膜蛋白受体、跨膜蛋白、转录因子及下游靶基因，其中人类细胞共有4种notch受体(notch1～4)及5种配体(delta-like-1，delta-like-3，delta-like-4，jagged-1和jagged-2)(baileyetal.,2007,cancermetastasisfacilitatedbydevelopmentalpathways:sonichedgehog,notch,andbonemorphogenicproteins,102:829-839)，其在进化中高度保守，具有调控细胞增殖、分化和凋亡的功能，并几乎涉及所有组织和器官。notch基因具有十分显著的致瘤性作用，这体现在多种人类肿瘤(包括淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、头颈肿瘤、胰腺癌、结肠癌、颌骨骨肉瘤和胶质母细胞瘤)的激活突变，并扩大到notch信号通路的各级成员(wengandaster,2004,multiplenichesfornotchincancer:contextiseverything,14:48-54)。在多种肿瘤中，notch信号通路被证实跟肿瘤干细胞干性的维持有关。最近，oncomed制药公司公布靶向notch通路的单克隆抗体tarextumab治疗小细胞肺癌的ⅰb期临床试验的患者存活和生物标记资料。tarextumab是完全人源化单克隆抗体，靶向notch2/3受体。临床前研究提示有2种作用机制，即下调notch通路信号，抗肿瘤干细胞作用和影响周细胞、基质细胞和肿瘤的微环境。

而在实体肿瘤细胞中，表皮生长因子受体(egfr)信号是机体的另一条重要信号转导途径，广泛存在于上皮、间质及神经组织，贯穿于整个细胞的生长和增殖过程，对细胞的分化选择起重要的调节作用。egfr家族主要包括egfr(即her1)和her2-4。egfr编码跨膜蛋白，其信号经受体酪氨酸磷酸化被激活，通过ras/raf/mek/mapk途径级联放大，最后导致mapk的磷酸化，修饰的mapk信号进入细胞核，促进目标基因的磷酸化，调节基因的表达和活性。egfr信号与肿瘤的发生发展及预后密切相关，在多种肿瘤如肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌及膀肤癌等中均有表达。高表达的信号与乳腺癌和膀胧癌的不良预后相关。egfr在乳腺癌中的表达与肿瘤增殖，疾病进展，以及不良预后相关一。的表达可降低雌激素受体的表达，增加对内分泌治疗的抵抗，。临床前研究表明，组成性活化的egfr可明显增加体内mcf-9人乳癌模型的成瘤性。作用于表皮生长因子受体(epithelialgrowthfactorreceptor，egfr)的单克隆抗体西妥昔单抗(cetuximab，c225)和帕尼单抗(panitumumab，vectibix)是研究最为广泛和最常用的抗egfr靶向药物，其疗效在多种肿瘤治疗中得到肯定。

egfr与notch信号的相互作用方式复杂，可以表现为协同作用，也可以表现为拮抗作用，依赖于组织的类型和发育的阶段。在神经胶质瘤中，notch上调egfr的表达，在高分化神经胶质瘤中，egfr的表达与notch密切相关。而在皮肤鳞状细胞癌中，egfr信号作用于notch1信号的上游，并且抑制信号的表达。与信号在乳腺原位导管细胞癌的体外培养中发挥协同促进作用。这些研究表明egfr信号与notch信号是紧密联系的两条信号传导通路，对于肿瘤的发生发展具有重要的调节作用。

综上所述，notch信号通路是参与肿瘤细胞emt的发生、肿瘤csc细胞群及干性的维持及其增殖分化、以及csc治疗耐受性调控中的关键通路。而egfr是肿瘤实体细胞中主要的一类过度激活信号通路，且在肿瘤实体瘤靶向治疗中占有重要地位。而两个信号通路间存在各个层次上的交叉激活。因此，因此，采用基因工程技术构建一个可以同时阻断两种信号的多特异性抗体，既能阻断egfr，又能阻断notch，进而同时对肿瘤干细胞及肿瘤实体细胞产生抑制作用一直是本领域的技术人员急待解决的问题。之前，本发明人前期研究成果是利用cetuximab和tarextumab作为亲本抗体构建制备双功能抗体药物，且具有非常好多抗肿瘤干细胞作用(huetal.,2017,antagonismofegfrandnotchlimitsresistancetoegfrinhibitorsandradiationbydecreasingtumor-initiatingcellfrequency,9:eaag0339)，已申请中国发明专利申请号cn201611102039.x(公布号为cn106800599a)，但西妥昔单抗为一种人鼠嵌合抗体，具有潜在的免疫源性(galizia,g.,etal."cetuximab,achimerichumanmouseanti-epidermalgrowthfactorreceptormonoclonalantibody,inthetreatmentofhumancolorectalcancer."oncogene26.25(2007):3654.)。

因此，进一步开发制备全人源的egfr和notch靶向抗体亟待解决。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可以同时阻断多个靶点的多特异性抗体，即可以阻断egfr，也能阻断notch2和notch3。本发明的第二个目的在于提供该抗体的制备方法。本发明的第三个目的在于利用该抗体，以及包含该抗体作为活性成分的用于肿瘤疾病的治疗药物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：

本发明的第一方面，提供一种抗egfr和notch2/3igg分子样交叉单克隆抗体(crossmab)p-tcrossmab，该crossmab能与egfr，notch2，及notch3结合。

优选的，所述的抗体p-tcrossmab由四条肽链组成，分别为氨基酸序列如seqidno：19所示的panitumumab重链knob突变体，氨基酸序列如seqidno：23所示的panitumumab轻链，氨基酸序列如seqidno：21所示的tarextuimab重链hole突变体，氨基酸序列如seqidno：25所示的tarextumab轻链突变体tarex-vl-ch1。

本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，其包含编码如上所述的抗体的核苷酸序列。

本发明中，任何编码egfr，notch2，和notch3的合适的dna都适合于本发明，这样的结构包括从组织或细胞mrna中分离得到的，从根据以公布数据库中序列全基因合成的，或从其他cdna文库中获得的。

优选的，所述的多核苷酸，其包含编码panitumumab重链knob突变体的如seqidno：20所示的核苷酸序列，和编码panitumumab轻链的如seqidno：24所示的核苷酸序列，和编码tarextuimab重链hole突变体的如seqidno：22所示的核苷酸序列，和编码tarextumab轻链突变体tarex-vl-ch1的如seqidno：26所示的核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供一种重组表达载体，其包含如上所述的多核苷酸。

本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pcdna3.1，pee6.4，pee12.4，pdhfr之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合dna序列。

优选的，所述的重组表达载体，可以选自pcdna3.1，pee6.4，pee12.4，pdhfr之一。在本发明的一个优选实施方式中，所述的重组表达载体为pcdna3.1。

本发明的第四方面，提供一种用如上所述的重组表达载体转化的宿主细胞，所述的宿主细胞为真核细胞。

本发明中，哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统可用于本发明的p-tcrossmab的表达，cos,cho,293,ns0，sf9及sf21等均可适用于本发明。

优选的，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。在本发明的一个优选实施方式中，所述的宿主细胞为中国仓鼠卵巢cho细胞。

本发明的第五方面，提供一种制备如上所述的抗体p-tcrossmab的方法，包括如下步骤：

a)在适合允许所述抗体p-tcrossmab表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达抗体p-tcrossmab；

b)分离或纯化所述的抗体p-tcrossmab。

本发明中公开的p-tcrossmab的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达p-tcrossmab，分离或纯化所述的p-tcrossmab。

利用上述方法，可以将双特异性抗体纯化为基本均一的物质，例如在sds-page电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的p-tcrossmab进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变ph等方法洗脱结合在亲和柱上的p-tcrossmab多肽。

在本发明的一个优选实施方式中，本发明公开的上述多特异性抗体p-tcrossmab是通过以下方法得到的：

1)全基因合成多特异性抗体的重轻链基因。全基因的序列参考了单克隆抗体的序列panitumumab(sickmieretal.,2016,thepanitumumabegfrcomplexrevealsabindingmechanismthatovercomescetuximabinducedresistance,11:e0163366)及crossmab重链轻链设计方案(konishietal.,2007,gamma-secretaseinhibitorpreventsnotch3activationandreducesproliferationinhumanlungcancers,67:8051-8057)和(guetal.,2012,notchsignalsintheendotheliumandcancer"stem-like"cells:opportunitiesforcancertherapy,4:1)。

2)将tarextuimab重链可变区与抗体轻链恒定区融合构建tarex-vh-cl融合片段；

3)将tarextuimab轻链可变区与抗体重链ch1区融合构建tarex-vl-ch1融合片段；

4)别对抗体fc区域构建knob突变体：t366w，s354c,hole突变体：t366s，l368a，y407v，和y394c。

5)分别将panitumumab重链可变区与knob突变体融合，tarex-vh-cl与hole突变体融合，panitumumab轻链以及tarex-vl-ch1，装入表达载体；

6)将上述步骤5)中的四种表达载体进行共转表达，通过分离纯化得到双靶向抗体p-tcrossmab。

本发明的第六方面，提供一种如上所述的抗体p-tcrossmab在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述的药物，以所述的抗体p-tcrossmab为活性成分。

本发明的第七方面，提供一种组合物，其含有如上所述的抗体p-tcrossmab和药学上可接受的载体或辅料。

本发明的第八方面，提供一种如上所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

优选的，如上所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。

本发明对上述的p-tcrossmab进行亲和力检测，发现p-tcrossmab同时完好地保留了panitumumab和tarextumab的亲和力，因此我们进行下一步实验,包括抑制肿瘤细胞增殖和体内抑瘤等实验，实验结果表明，本发明公开的p-tcrossmab同时具有panitumumab和tarextumab的功能。此外，该多特异性抗体p-tcrossmab可以和传统的igg分子一样，最大程度地保留了传统单克隆抗体结构，因为有fc片段的存在，可以用普通的proteina柱亲和层析法纯化，利于大规模的生产纯化。实验表明，在相等剂量下，多特异性抗体p-tcrossmab具有与联合应用panitumumab和tarextumab相似或更强的抗肿瘤治疗效果。

本发明公开上述双特异性抗体p-tcrossmab，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双特异性抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述p-tcrossmab的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer188)；triton；十二烷基硫酸钠(sds)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；pluronics；monaquat^tm等，其加入量应使双功能双特异性抗体蛋白的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含p-tcrossmab的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明所指的肿瘤，包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中枢神经系统的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌系统肿瘤、胃肠道胰腺内分泌系统肿瘤，生殖系统肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再一一列举。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。

本发明中p-tcrossmab及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1～1800mg/天。

本发明公开的p-tcrossmab及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药或联合放射治疗以用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物：(1)作用于dna化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(mmc)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(mtx)和alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5fu、ft－207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤(6－mp)和6－tg等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(hu)等；dna多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(ara-c)和健择(gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于dna模板，抑制dna依赖rna聚合酶，从而抑制rna合成的药物如：放线菌素d、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类：如抗雌激素类：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨rh-lh激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤类药物，如干扰素；白细胞介素-2；胸腺肽类；4、单克隆抗体类：如美罗华(mabthera)，赫赛汀(trastuzumab)，bevacizumab(avastin)，免疫checkpoint阻断剂，如抗pd1抗体等；5、各种放射疗法；6、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的p-tcrossmab及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

本发明公开的双靶向抗体，在保留全抗体的结构基础上，靶向egfr、notch2/3三种细胞膜表面受体，且具有比单独靶向egfr、notch2/3更好的抗肿瘤生物活性。

附图说明

图1.p-tcrossmab结构示意图；

图2.p-tcrossmab抑制hcc827细胞活性实验结果；

图3.p-tcrossmab抑制hcc827肿瘤生成曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括sambrook,j.,fritsch,e.f.andmaniais，t.(1989)molecularcloning：alaboratorymanual，2^ndedition，coldspringharborlaboratorypress。

实施例1.新型多功能抗体p-tcrossmab的构建及表达

(1)全基因合成panitumumab和tarextumab抗体重链和轻链的可变区基因，获得panitumumab的vh、vl以及tarextummab的vh、vl片段(氨基酸序列和核苷酸序列分别如seqidno：1-8所示)。全基因合成人igg轻链恒定区，重链恒定区ch1，和fc片段(氨基酸序列和核苷酸序列分别如seqidno：9-14所示)。

(2)将获得的抗体fc片段，采用overlappcr的方法引入突变点：t366w,s354c。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pgem-t载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆(氨基酸序列和核苷酸序列分别如seqidno：15-16所示)。即获得fc段knob突变体。

(3)另将抗体的fc片段再次采用overlappcr的方法引入突变点：t366s，l368a，y407v和y394c。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pgem-t载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆(氨基酸序列和核苷酸序列分别如seqidno：17-18所示)。即获得fc段hole突变体。

(4)将上述步骤(1)中获得的panitumumab重链可变区和步骤(3)获得的fc片段knob突变体为模板，利用overlappcr技术将上述两个片段融合并装入表达载体中。即构建获得panitumumab重链knob突变体(氨基酸序列和核苷酸序列分别如seqidno：19-20所示)。

(5)将步骤(1)中获得tarextumab重链可变区，轻链恒定区域及步骤(3)获得的fc段hole突变体为模板，采用overlappcr技术将上述三个片段融合并装入表达载体中。即获得tarextumabvh-cl-hing-fc_hole_mut融合片段(氨基酸序列和核苷酸序列分别如seqidno：21-22所示)。

(6)将步骤(1)中获得的panitumumab轻链可变区和轻链恒定区cl作为模板，利用overlappcr技术将上述片段融合，即获得panitumumab轻链，并对该序列进行优化，进行突变(氨基酸序列和核苷酸序列分别如seqidno：23-24所示)。

(7)将步骤(1)中获得的tarextumab轻链可变区和igg重链恒定区ch1作为模板，利用overlappcr技术将上述片段融合，即获得tarextumabvl-ch1融合片段并装入表达载体中(氨基酸序列和核苷酸序列分别如seqidno：25-26所示)。步骤(4)(5)(6)(7)即获得编码p-tcrossmab四条肽链的四种表达载体质粒。

(8)于3.5cm组织培养皿中接种3×10⁵cho-k1细胞，细胞培养至80％-85％融合时进行转染：取重链质粒各10μg，轻链质粒各4μg和30μllipofectamine2000reagent(invitrogen公司产品)分别溶于800μl无血清dmem培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使dna-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的dmem培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的dna-脂质体复合物加入到板中，co2孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的dmem完全培养基，置于co2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含500μg/mlg418和300μg/mlzeocin的选择培养基筛选抗性克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用proteina亲和柱(ge公司产品)分离纯化双特异性抗体p-tcrossmab。将p-tcrossmab用pbs进行透析，最后以紫外吸收法定量。p-tcrossmab的结构如图1所示。

实施例2.biacore分析

将多克隆抗人fc抗体(jacksonimmunoresearch公司)包被在cm5m5芯片(ge公司)上，捕获被检测抗体后，用biacoret100(gehealthcare)检测p-tcrossmab的亲和力，具体检测亲和力数值见表1。

表1.亲和力测定分析

实施例3：p-tcrossmab抑制非小细胞肺癌细胞活力实验

取生长状态良好的hcc827细胞(atcc)，调整细胞浓度为5×10³/ml，接种于96孔细胞培养板，200μl/孔，于37℃、5％c02孵箱中培养24h后，在培养液中加入终浓度为5nmol的egf和不同浓度梯度的双特异性抗体p-tcrossmab,panitumumab，tarextumab,panitumumab+tarextumab,双特异性抗体ct16(huetal.,2017,antagonismofegfrandnotchlimitsresistancetoegfrinhibitorsandradiationbydecreasingtumor-initiatingcellfrequency,9:eaag0339)，无关humanigg(rituximab购自roche公司)，3天后，细胞活力用celltiter-gloluminescentcellviabilityassay试剂盒(promega,madison,wi)检测。实验结果如图2所示。实验结果表明，p-tcrossmab可以抑制的hcc827细胞活力，比panitumumab和tarextumab有更显著的抑制效果,与panitumumab及tarextumab联合应用的双抗体组效果相似或更优，和双特异性抗体ct16效果相似(药物浓度单位为ng/μl)。

实施例4：p-tcrossmab体内抑制肿瘤生长实验

为检测p-tcrossmab体内抑瘤活性,首先用hcc827细胞,接种于到balb/c裸鼠右胁侧皮下,成瘤后尾静脉注射,5mg/kg各组下列抗体：p-tcrossmab，panitumumab，tarextumab，ct16，无关对照humanigg，panitumumab和tarextumab两种单抗各2.5mg/kg联合应用，每周注射1次，持续至小鼠肿瘤过大处死。每天测量肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。

肿瘤生长曲线如图3所示。结果表明：p-tcrossmab治疗组肿瘤生长速度显著小于panitumumab及tarextumab治疗组(35天后，p<0.01，mann-whitney检验)。且p-tcrossmab的治疗效果由于与panitumumab和tarextumab联合应用效果(35天后，p<0.01，mann-whitney检验)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

sequencelisting

<110>沣潮医药科技（上海）有限公司

<120>全人源抗人egfr和notch2/3多特异性抗体、其制备方法及用途

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