一种抗H7N9抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药和免疫学
技术领域：
，涉及一种抗h7n9抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
流感是威胁人类健康的主要因素之一，h7n9、h5n6和h10n8等禽流感病毒引起的人感染禽流感，发病严重、死亡率高，给人类健康、经济发展和社会稳定带来严重的影响。治疗流感的措施主要包括疫苗和抗病毒药物，其中，疫苗是预防流感病毒感染最有效的方式之一，但对突发的新亚型流感病毒株缺乏保护作用；抗病毒药物在耐药病毒株产生之前具有治疗作用，感染后期治疗效果不明显。目前的抗病毒药物包括m2离子通道蛋白抑制剂和神经氨酸酶(na)抑制剂，例如金刚烷胺和奥司他韦，这些药物虽然能够有效地抑制病毒复制，但容易造成耐药株的出现。流感康复者的血清中含有高滴度的抗体，能够有效救治流感临床重症者，然而上述抗体获取难度大，效价不均一，难以应对大范围的流感爆发。抗体的体外生产技术十分重要，目前常用的单克隆抗体筛选方法主要有噬菌体展示技术、酵母展示技术、b细胞永生化技术和单细胞pcr技术等。噬菌体展示技术最初由美国smith博士在1985年提出，噬菌体编码的蛋白基因通过插入外源的dna片段，使外源基因的表达蛋白与噬菌体的外壳蛋白相融合，展示在噬菌体的表面。该技术最常用的载体为溶原性的丝状噬菌体，例如m13、fi和fd，噬菌体的基因组为单链环状dna，外部被外壳蛋白g8p包裹。噬菌体抗体库主要具有以下优势：不依赖于人或动物的免疫反应，适应于大规模工业化生产，能够快速筛选出108以上的噬菌体抗体库，可以获得不同亲和力的抗体。在噬菌体抗体库的构建过程中，抗体的重链与轻链基因会发生重组，这个过程模拟了机体中抗体亲和力的成熟过程。酵母展示技术由kdwittrup实验室建立，2001年转让给abbott实验室，目前已广泛应用于蛋白质工程领域。这项技术是分离和改造抗体的有力手段，当抗体的重链可变区和轻链可变区由linker链接成单链可变区抗体(scfv单链抗体)后，与酵母表面细胞壁上的aga2p蛋白融合，并与标记荧光素的抗原结合，该项技术通过facs分选有结合活性的酵母细胞，进行抗体的体外细胞表达。b细胞永生化技术最初由eb病毒(epstein-barrvirus，ebv)介导转化，以提高细胞的增殖能力和分泌抗体的活性，目前该项技术已经被广泛应用于单克隆抗体的制备和b细胞研究中。corti等在研究t淋巴细胞、b淋巴细胞的应答过程中，运用了b淋巴细胞永生化技术和高通量细胞筛选技术，得到了具有较强增殖能力和抗体分泌活性的记忆b淋巴细胞。单细胞pcr技术是一种体外克隆和表达单个抗原特异性b细胞抗体基因的技术，该技术需要的细胞少、效率高、基因多样性好，通过重链和轻链的随机重组可以建立107-1012库容量的抗体序列，并筛选到亲和力强的抗体，适用于有丰富抗原特异性b细胞的人群，在新发突发传染病领域具有广阔的应用前景。然而，单细胞pcr技术仍然存在一些缺陷。例如在猕猴浆母细胞抗体的筛选过程中，由于中国猕猴与印度猕猴在表型和基因组上具有巨大差异，通过单细胞pcr实验得到的重链的扩增效率达65％以上，但轻链的扩增效率低于40％，总体的克隆效率不高；另外，由于中国猕猴基因组的测序质量不高，有大量gap存在，难以找出有效的v基因序列设计引物进行单细胞pcr扩增。目前有报道的扩增引物效果不理想，多套引物混合使用可以提高扩增效率，但扩增工作量大，难度大。因此，建立一种效率较高、操作简便的方法制备亲和力强的流感病毒抗体，在免疫学领域具有重要意义。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供了一种抗h7n9抗体及其制备方法和应用，所述抗体无免疫原性、特异性好、亲和力高、成分清晰、无病原体污染等潜在风险，广泛适用于各种人群，所述制备方法简单高效、适于标准化生产。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种抗原结合片段，所述抗原结合片段的重链可变区的核酸序列如seqidno.1所示；所述抗原结合片段的轻链可变区的核酸序列如seqidno.2所示；所述seqidno.1所示的核酸序列为：caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaggcccggggagtctctgaagatctcctgtaaggcttctggatacacttttaccacttactggatcggctgggtgcgccaggtgcccggaaaaggcctggagtggatgggggcgattgatcctagtgactctggagccagatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaactccattaacaccacctacctacagtggaaaagcctgaggtcctcggacaccgccacctattactgcgcaaagtctggggggtggtgggacatcgacgtctggggccctggcaccccaatcaccacctcctcag；所述seqidno.2所示的核酸序列为：gaaattgtaatgacgcagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcagagccagtcagggtattagcaactggttggcctggtatcaacagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatagggcatccaatttggaaacaggggtcccatcaaggttcagtggaagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatatcgcaacttattactgtcagcatggttatggtaccccattcactttcggccccgggaccaaactggatatcaaa.本发明中，所述抗原结合片段效价高、特异性强、无异种血清反应、不存在交叉污染、成分清晰，既避免了异源血清蛋白引起的过敏反应，又避免了人源免疫球蛋白来源限制问题和潜在病原体污染的问题。第二方面，本发明提供了一种抗h7n9抗体，所述抗体包括如第一方面所述抗原结合片段。优选地，所述抗体还包括恒定区。本发明中，所述恒定区的重链的核酸序列如seqidno.3所示，所述恒定区的轻链的核酸序列如seqidno.4所示；所述seqidno.3所示的核酸序列为：accaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaataaatctaga；所述seqidno.4所示的核酸序列为：gtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttaa.第三方面，本发明提供了一种dna片段，所述dna片段包括编码如第一方面所述抗原结合片段和/或如第二方面所述抗体的核苷酸序列。第四方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括如第三方面所述的dna片段。本发明中，所述表达载体包括pci-neo-igg1和pci-neo-k/l，由中国科学院广州生物医药与健康研究院陈凌课题组孟维旭博士构建。第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第三方面所述的dna片段和/或如第四方面所述的表达载体。优选地，所述宿主细胞包括293t细胞。第六方面，本发明提供了一种如第二方面所述抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)采集免疫个体的b细胞，pcr获得抗体可变区的dna片段；(2)将步骤(1)所述dna片段连接入表达载体，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；(3)将筛选后的表达载体转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述抗体。优选地，步骤(1)所述免疫个体包括恒河猴。恒河猴与人的遗传信息具有高度同源性，本发明采用h7n9流感病毒疫苗免疫恒河猴，刺激b细胞产生中和抗体，通过多次免疫的方法提高了抗体的亲和力。优选地，步骤(1)所述b细胞包括cd3-/cd19-/cd27-/cd80+b细胞。与人的浆母细胞相比，恒河猴的浆母细胞不表达cd19和cd27，本发明中，首先以cd3抗体区分t细胞和b细胞，随后以cd19抗体筛选表型为cd19-的b细胞，以cd27-cd80+抗体筛选高表达的浆母细胞亚群，得到的cd3-/cd19-/cd27-/cd80+b细胞极大地提高了人源抗体的分离效率。本发明中，步骤(1)所述pcr的引物根据natureprotocol，2014，9，1567-1568设计得到。优选地，步骤(3)所述宿主细胞包括293t细胞。第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述抗原结合片段、如第二方面所述抗体、如第三方面所述dna片段、如第四方面所述表达载体或如第五方面所述宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。第八方面，本发明提供了一种试剂盒，所示试剂盒包括如第一方面所述抗原结合片段、如第二方面所述抗体、如第三方面所述dna片段、如第四方面所述表达载体或如第五方面所述宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所示试剂盒还包括洗涤液。第九方面，本发明提供了一种如第一方面所述抗原结合片段、如第二方面所述抗体、如第三方面所述dna片段、如第四方面所述表达载体、如第五方面所述宿主细胞、如第七方面所述药物组合物或如第八方面所述试剂盒中的任意一种或至少两种的组合在制备流感药物和/或流感检测试剂中的应用。优选地，所述流感包括h7n9型人感染禽流感。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的抗体与h7n9-ha的亲和力在nm级别，中和活性高于已知的广谱抗体fi6；(2)本发明的抗体对h7n9-ha具有很强的结合活性和亲和力，g11抗体与h7n9-ha的亲和力为6.36e-10m，结合常数为2.44e+051/ms，解离难度大，解离常数仅1.56e-041/s；(3)本发明的抗体纯度高、无免疫原性、成分清晰，不存在病原体污染等潜在风险；(4)本发明的制备抗体的方法标准可控、成本低廉、简单高效、适于标准化生产。附图说明图1为重组载体的电泳图，其中，dl2000为dna分子量；图2(a)为2g11抗体重链和轻链的sds-page电泳图，其中，m为蛋白分子量，1-4为样品上清，5为阴性对照，图2(b)为分析筛纯化的2g11抗体图谱，其中，m为蛋白分子量；图3(a)为不同抗体与h7n9-ha蛋白结合能力比较，图3(b)为不同稀释度的2g11抗体与h7n9-ha蛋白结合能力比较；图4为westernblot检测抗原抗体结合；图5(a)为2g11抗体与h7n9-ha亲和力检测结果，图5(b)为fi6与h7n9-ha亲和力检测结果；图6(a)为不同抗体对h7n9-pr8病毒的体外微量中和活性，图6(b)为不同抗体对荧光病毒的微量中和实验结果；图7为2g11抗体的血凝抑制实物图；图8(a)为抗体抑制h7n9-ah血凝结果，图8(b)为抗体抑制h7n3-alberta血凝结果，图8(c)为抗体抑制h7n7-nl血凝结果。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1单个核细胞分离和浆细胞分选(1)分别于第0、14和28天从注射了h7n9疫苗的恒河猴的血液中采集20ml血液样本于含有肝素的抗凝管中，用ficoll分离，吸取单个核细胞(pbmc)层悬液，用pbs洗涤3次，吸弃上清；(2)用40μm滤膜过滤，细胞计数后利用bdfacsria流式细胞仪从pbmc分选出目标细胞群，挑选形态完好的单个细胞置于96孔pcr板中(每孔20μl单细胞裂解液)，使每个孔含有一个记忆性b细胞，-80℃冰箱保存备用。实施例2利用单细胞pcr从单个b细胞中分离抗体可变区基因(1)rt-pcr：向含有单个b细胞的96孔板中加入随机引物、superscriptiii反转录酶和dntps，37℃孵育1小时，按以下条件进行pcr扩增：95℃15min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃5min；获得的产物cdna于-20℃保存；(2)pcr：50μl体系中含有5μl反转录产物、hotstartaqplus酶、dntps、和0.5μm的不同亚型重链与轻链可变区的特异性引物(引物根据natureprotocol，2014，9，1567-1568设计得到)，按以下条件进行pcr扩增：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，35个循环；72℃7min；获得的pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。实施例3构建重组抗体的表达载体将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体重链可变区基因和轻链可变区基因的pcr产物利用ta克隆的方法分别连接到重链载体和轻链载体上，构建抗h7n9抗体的表达载体，然后将表达载体转化dh5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，挑取10个单菌落用特异性引物进行pcr，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，28个循环；72℃延伸5min。取5μlpcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链和轻链基因的转化子，dna长度约600bp，介于500-750bp之间。利用vectornti软件，对阳性转化子进一步进行基因序列分析。结果发现，阳性转化子的先导区(leader)、vdj和恒定区基因片段在vectornti软件比对结果均完全匹配，未发现密码子突变情况，说明成功克隆抗h7n9抗体基因。实施例42g11抗体的表达与纯化将阳性质粒转化dh5α进行大量扩增，快速提取重组质粒后，与转染试剂polyfect共转染293t细胞，转染后6-8小时换大量新鲜培养基，并在37℃8％co2培养箱中培养96小时，收集细胞上清；将获得的细胞上清离心去除细胞碎片，获得2g11抗体蛋白，利用分子筛和sds-page检测抗体基因重链和轻链的表达与纯化情况。如图2(a)所示，h7n9抗体的重链和轻链均得到表达，其中，重链分子大约55kda，轻链分子大约25kda，整个抗体大小约180kda；如图2(b)所示，纯化的蛋白条带单一，纯度较高。实施例52g11抗体的活性分析(1)2g11与h7n9-ha的结合能力利用elisa实验检测2g11抗体与h7n9-anhui病毒株表面的血凝素蛋白ha的结合能力。经过分析筛纯化的2g11抗体作为一抗，免疫过h7n9疫苗的39号猴子血清作为阳性对照，fi6为2013年文献报道的h7n9广谱中和抗体。如图3(a)所示，本发明筛选得到的抗体2g11，从原液到1000倍稀释液均与ha蛋白具有良好的结合活性，抗体亲和力高，结合能力基本与免疫后猴子血清媲美，显著优于fi6抗体；如图3(b)所示，纯化后的2g11抗体的浓度约为77ng/μl，将2g11抗体原液稀释104倍后，与ha蛋白依然具有结合能力。(2)抗原抗体结合表位分析为了进一步验证2g11抗体与抗原h7n9-ha的结合能力，将h7n9-ha作为抗原，纯化后的2g11抗体作为一抗，利用westernblot实验检测2g11抗体与抗原h7n9-ha的结合情况。结果如图4所示，2g11能够与h7n9-ha相结合；由于westernblot只能检出抗原抗体结合的线性表位，说明2g11与h7n9-ha是线性结合。(3)抗原抗体亲和力利用生物膜层干涉实验分别检测2g11抗体fi6抗体与h7n9-ha的亲和力，2g11抗体浓度梯度为160nm、80nm、40nm、20nm、10nm和5nm，fi6抗体浓度梯度为120nm、60nm、30nm、15nm、7.5nm和3.75nm。表1所示为抗原抗体亲和性，其中，ka为结合常数，kd为解离常数，kd为处于平衡状态时抗体与h7n9-ha蛋白的解离常数，kd越小说明解离越少，代表亲和力越强。可以看出，2g11抗体与h7n9-ha的亲和力为6.36e-10m，亲和力大于文献报道的抗体fi6的亲和力(4.86e-09m)。图5(a)和图5(b)分别为2g11抗体和fi6抗体与h7n9-ha的结合和解离曲线图，可以看出，2g11结合的速度很快，结合常数为2.44e+051/ms，解离难度很大，解离常数仅1.56e-041/s；与文献报道的fi6抗体相比，2g11对h7n9-ha表现出强亲和性。表1抗原抗体亲和性抗体名称ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)r22g112.44e+051.56e-046.36e-100.998429fi63.04e+051.48e-034.86e-090.987811实施例6病毒微量中和实验检测抗体中和活性利用重组的h7n9-pr8病毒测定2g11抗体的体外中和能力。如图6(a)所示，2g11抗体能显著抑制病毒的复制，进行1:320稀释后仍然能够中和90％的病毒，e11、2f12和2g8抗体尽管能够抑制病毒复制，但抑制效果低于2g11抗体；如图6(b)所示，2g11在稀释8倍后仍然能够中和病毒。实施例7hi血凝抑制检测抗体中和滴度抗流感的中和抗体主要包括针对ha蛋白头部和针对ha蛋白颈部的两种抗体。头部抗体一般识别唾液酸受体或ha蛋白唾液酸结合位点附近的氨基酸，血凝实验可简单快捷地区分头部抗体和颈部抗体。流感病毒具有凝集红血球的特性，2g11抗体识别的位点位于唾液酸或唾液酸附近的氨基酸位点，阻断了病毒凝集红细胞的能力。鸡血红细胞在正常情况下会沉降，但是感染病毒后会发生血凝而不会沉降下来。抗体的血凝抑制效价就是抗体能抑制病毒与红细胞发生凝集的最高的稀释倍数。如图7所示，2g11的血凝效价为1:8，免疫猴血清的血凝效价为1:16，由此可见，2g11抗体的血凝效价相当显著，具有很高的中和滴度。此外，2g11与ha蛋白的结合能力比fi6抗体高1000倍以上，说明头部抗体的结合能力比颈部抗体的结合能力要强，与预期的结果相符合。如图8(a)、8(b)和8(c)所示，抗体2g11是头部结合抗体，对不同流感病毒株均具有很高的血凝抑制效价，其中对h7n7-nl株抑制效果最好，低至0.4μg/ml。综上所述，本发明的抗体与h7n9-ha的亲和力在nm级别，中和活性高于已知的广谱抗体fi6，纯度高、无免疫原性、成分清晰，不存在病原体污染等潜在风险；所述抗体对h7n9-ha的亲和力为6.36e-10m，结合常数为2.44e+051/ms，解离难度很大，解离常数仅1.56e-041/s；本发明的制备单克隆抗体的方法标准可控、成本低廉、简单高效、适于标准化生产。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院<120>一种抗h7n9抗体及其制备方法和应用<130>20180612<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>355<212>dna<213>人工合成<400>1caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaggcccggggagtctctgaagatc60tcctgtaaggcttctggatacacttttaccacttactggatcggctgggtgcgccaggtg120cccggaaaaggcctggagtggatgggggcgattgatcctagtgactctggagccagatac180agcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaactccattaacaccacctac240ctacagtggaaaagcctgaggtcctcggacaccgccacctattactgcgcaaagtctggg300gggtggtgggacatcgacgtctggggccctggcaccccaatcaccacctcctcag355<210>2<211>321<212>dna<213>人工合成<400>2gaaattgtaatgacgcagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc60atcacttgcagagccagtcagggtattagcaactggttggcctggtatcaacagaaacca120gggaaagcccctaagctcctgatctatagggcatccaatttggaaacaggggtcccatca180aggttcagtggaagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct240gaagatatcgcaacttattactgtcagcatggttatggtaccccattcactttcggcccc300gggaccaaactggatatcaaa321<210>3<211>994<212>dna<213>人工合成<400>3accaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcaca60gcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaac120tcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactc180tactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatc240tgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatct300tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtca360gtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtc420acgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtcaagttcaactggtacgtg480gacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacg540taccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtac600aagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagcc660aaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgacc720aagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtg780gagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggac840tccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcag900gggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaag960agcctctccctgtctccgggtaaataaatctaga994<210>4<211>318<212>dna<213>人工合成<400>4gtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaact60gcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaag120gtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaag180gacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacac240aaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttc300aacaggggagagtgttaa318当前第1页12