本发明涉及生物催化领域，特别涉及一种肌红蛋白突变体及其在生物制备染料靛蓝中的应用。
背景技术：
：靛蓝，又名食品蓝1号、食用青色2号、食用蓝、酸性靛蓝、硬化靛蓝，为水溶性非偶氮类着色剂。化学名称3,3′-二氧-2,2′-联吲哚基-5,5′-二磺酸二钠盐，分子式c16h8n2na2o8s2，相对分子质量466.36。靛蓝类色素是人类所知最古老的色素之一，广泛用于食品、医药和印染工业。靛蓝作为织物染料的应用至少可追溯到公元前2500年。古埃及木乃伊穿着的一些服装和我国马王堆出土的蓝色麻织物等都是由靛蓝所染成的,我国瑶族的一支因其生产和使用靛蓝染布的技术独特而得名"蓝靛瑶"。在食品工业中,靛蓝以其磺酸钠盐或其铝化的形式等用作食用色素,我国称之为"亮蓝"和亮蓝铝淀，在美国等以其磺酸钠盐形式为主，被称之为"靛蓝素"。靛蓝是一种古老的染料，最初是从植物中提取，后来发展为化学合成制备。植物提取的方法为：将靛叶堆积，经常浇水，使其发酵2～3个月，成为黑色土块状。用臼捣实后称为球靛，含靛蓝色素2％～10％。球靛中拌入木灰、石灰及麸皮，再加水拌和，加热至30～40℃，暴露在空气中，成为蓝色不溶性靛蓝，收率低。化学合成制备靛蓝的方法污染环境且有潜在的致癌风险，20世纪末开始，靛蓝的研究开始生物合成制备。细胞色素p450是一种血红素蛋白酶，广泛存在于动植物以及微生物体内。它可以催化多种化学反应，被认为是最为全面的生物催化剂。近年来，研究发现细胞色素p450对吲哚及其衍生物的代谢产物之一为靛蓝。但是，p450酶的产量较低。经过繁杂的分离、提纯过程，酶的活性损失较多，而且p450酶系是一类nadph依赖酶，而此辅酶价格昂贵。因此，提供一种靛蓝的制备方法具有重要的现实意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种基于肌红蛋白突变体的简易高效的染料靛蓝的生物制备方法。本发明提供的f43ymb具有单加氧酶活性，能在过氧化氢存在的条件下，不需要其他辅基，在37℃水浴环境下催化吲哚合成靛蓝，产率高达54％。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了肌红蛋白突变体，其具有(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：(ⅰ)、将肌红蛋白的血红素活性中心第43位的苯丙氨酸用酪氨酸取代后的序列；(ⅱ)、与如(ⅰ)所述的氨基酸序列具有至少80％同源性的序列；(ⅲ)、如(ⅰ)所述的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；(iv)、由编码如(ⅰ)所述的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如(ⅰ)所述的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；(v)、与(ⅰ)～(iv)任一项所述序列具有相同功能性片段或功能性变体的氨基酸序列。肌红蛋白(mb)常作为血红素蛋白质分子设计骨架，它具有分子量小、稳定性高等特点，易获得高纯度蛋白和晶体结构等。以mb为模板，通过设计调控血红素活性中心微环境，可设计获得各种人工蛋白酶。基于基因工程和蛋白质工程技术的发展，运用定点突变技术可以研究特定氨基酸残基在蛋白质结构、功能和性质中的作用。利用上述原理，本发明利用突变体蛋白f43ymb做催化剂，催化吲哚与过氧化氢的反应。实验结果表明，f43ymb具有单加氧酶活性，能在过氧化氢存在的条件下，不需要其他辅基，在37℃水浴环境下催化吲哚合成靛蓝，产率高达54％。在本发明的一些具体实施方案中，如(ⅰ)所述的氨基酸序列如seqidno.1所示；编码如(ⅰ)所述的氨基酸序列的核苷酸序列如seqidno.2所示。本发明还提供了所述的肌红蛋白突变体作为单加氧酶在物质合成中的应用。本发明还提供了所述的肌红蛋白突变体在催化有机物氧化的应用。本发明还提供了所述的肌红蛋白突变体作为催化剂在制备靛蓝中的应用。本发明还提供了一种靛蓝的制备方法，其特征在于，以所述的肌红蛋白突变体为催化剂，在过氧化氢存在的条件下，不需要其他辅基，于25～40℃催化吲哚合成靛蓝。在本发明的一些具体实施方案中，吲哚与所述的肌红蛋白突变体的摩尔比不大于1000：1。在本发明的一些具体实施方案中，吲哚、所述的肌红蛋白突变体、氧化剂的摩尔比为1000：1：1000。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的突变体蛋白的浓度：5～20μm；制备靛蓝时，本发明提供的突变体蛋白的反应浓度：10μm。在本发明的一些具体实施方案中，反应氧化剂及浓度：h2o2，0.5～4mm；反应氧化剂的反应浓度为：1mm。在本发明的一些具体实施方案中，反应起始原料及浓度：吲哚，0.5～4mm；反应起始原料的反应浓度为：1mm。本发明还提供了编码所述的肌红蛋白突变体的dna分子。本发明还提供了具有所述dna分子的载体。本发明还提供了一种宿主细胞，包含所述的载体。本发明还提供了所述肌红蛋白突变体的制备方法，包括如下步骤：步骤1：获取编码所述肌红蛋白突变体的dna分子：步骤2：将步骤1获得的所述dna分子与表达载体融合，构建重组表达载体，转化宿主细胞；步骤3：诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。本发明以肌红蛋白为蛋白质分子设计骨架，在其活性中心血红素的周围引入酪氨酸(tyr)，从而构建一种具有单加氧酶活性的人工蛋白酶。基于基因工程和蛋白质工程技术的发展，运用定点突变技术可以研究特定氨基酸残基在蛋白质结构、功能和性质中的作用。本发明利用突变体蛋白f43ymb做催化剂，催化吲哚与过氧化氢的反应。实验结果表明，f43ymb具有单加氧酶活性，能在过氧化氢存在的条件下，不需要其他辅基，在37℃水浴环境下催化吲哚合成靛蓝，产率高达54％。本发明为当前提供了一种安全环保、易操作、经济的靛蓝生物合成方法。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示f43ymb的质谱图；图2示f43ymb催化吲哚与过氧化氢反应的溶液颜色变化；图3示野生型(wild-type)wtmb催化吲哚与过氧化氢反应的溶液颜色变化；图4示f43ymb催化吲哚与过氧化氢反应的紫外光谱变化图，右上角插图为靛蓝特征峰670nm处吸收值随反应时间的变化趋势；图5示wtmb催化吲哚与过氧化氢反应的紫外光谱变化；图6示将f43ymb催化反应完的混合液体于4000r/min离心30min，取沉淀重溶于dmf中，定容为3ml的流程图；图7示沉淀的dmf溶液的紫外可见光谱与靛蓝的标准dmf溶液的紫外可见光谱图对比图，其中黑色实线为靛蓝的标准溶液，虚线为反应产物；图8示f43ymb催化吲哚合成靛蓝的稳态速率常数与底物吲哚不同浓度之间的关系；图9示离心后蓝色沉淀与靛蓝标准品的液相色谱图。具体实施方式本发明公开了一种肌红蛋白突变体及其在生物制备靛蓝中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的靛蓝的制备方法如下：(1)肌红蛋白单点突变的位点选择：在肌红蛋白的43位引入酪氨酸。(2)模板：运输氧功能的肌红蛋白；(3)突变体蛋白浓度：5～20μm；(4)反应氧化剂及浓度：h2o2，0.5～4mm；(5)反应起始原料及浓度：吲哚，0.5～4mm；(6)反应的沉淀溶剂：dmf；(7)分离方法：4000r/min条件下离心30min。本发明提供的靛蓝的制备方法具体如下：用50mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)配制10μm野生型(wild-type)wtmb、10μmf43ymb。用离子水配制配置1mh2o2，浓度用紫外光谱标定(h2o2为ε240nm＝39.4m-1cm-1)用乙醇配制1m吲哚(indole)母液。取上述f43ymb溶液2ml，加入1m吲哚母液(终浓度为1mm)，混合均匀置于37℃水浴孵化30min后，加入h2o2使其终浓度为1mm，混合均匀后，在37℃反应，每10s测一次670nm处的吸光度，得到670nm处吸光度随反应时间的变化曲线，对反应曲线的初试线性部分进行拟合，得到靛蓝生成的初试反应速率，将反应速率对吲哚浓度作图，然后再用michaelis-menten酶促动力学方程拟合(图7)，从拟合出来的米氏曲线可以得到酶促反应的动力学参数kcat和km(表1)。将反应15min后的混合液离心，得到的蓝色沉淀即为靛蓝，将产物靛蓝-dmf溶液注入超高效液相色谱(uplc)，根据定量的靛蓝标准品-dmf溶液在相同条件下的色谱吸收峰面积，计算出靛蓝的产量，结果表明，f43ymb有更好的催化效率，更高的靛蓝产率(表1)。本发明中突变体肌红蛋白f43y的突变位点选择恰当，能催化吲哚反应合成靛蓝，表现出单加氧酶活性，且靛蓝产率较高，达到了54％。为当前提供了一种安全环保、易操作、经济的靛蓝合成方法。本发明提供的肌红蛋白突变体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1基于基因工程和蛋白质工程，运用定点突变技术，在肌红蛋白血红素活性中心附近43位引入酪氨酸(tyr,y)，将突变质粒在大肠杆菌bl21(de3)中表达，通过超声破菌、离子交换(deae树脂)、凝胶柱(surperdex75)分离方法，进行蛋白质分离纯化，获得f43ymb突变体蛋白，蛋白质分子量如质谱图所示(图1)。f43ymb突变体蛋白的氨基酸序列如下所示(seqidno.1所示)：vlsegewqlvlhvwakveadvaghgqdilirlfkshpetlekydrfkhlkteaemkasedlkkhgvtvltalgailkkkghheaelkplaqshatkhkipikylefiseaiihvlhsrhpgdfgadaqgamnkalelfrkdiaakykelgyqg。f43ymb突变体蛋白的核苷酸序列如下所示(seqidno.2所示)：atggttctgtctgaaggtgaatggcagctggttctgcatgtttgggctaaagttgaagctgacgtcgctggtcatggtcaggacatcctcattcgactgttcaaatctcatccggaaactctggaaaaatatgatcgtttcaaacatctgaaaactgaagctgaaatgaaagcttctgaagatctgaaaaaacatggtgttaccgtgttaactgccctaggtgctatccttaagaaaaaagggcatcatgaagctgagctcaaaccgcttgcgcaatcgcatgctactaaacataagatcccgatcaaatacctggaattcatctctgaagcgatcatccatgttctgcattctagacatccaggtgacttcggtgctgacgctcagggtgctatgaacaaagctctcgagctgttccgtaaagatatcgctgctaagtacaaagaactgggttaccagggttaa实施例2配制10μmf43ymb。配制1m的吲哚(indole)溶液(溶剂为乙醇)、200mm的过氧化氢溶液。将f43ymb蛋白溶于的磷酸二氢钾-氢氧化钾的缓冲溶液(ph7.4)中，使蛋白溶液浓度为10μm。将配制好的吲哚-乙醇溶液分散到f43y蛋白溶液中，使吲哚的终浓度为1mm。混合溶液在37℃下孵化半小时后，加入1mm过氧化氢溶液，继续在37℃下反应15分钟后拍照，f43y催化反应的溶液变成蓝色(图2)。实施例3配制10μmf43ymb。配制1m的吲哚(indole)溶液(溶剂为乙醇)、200mm的过氧化氢溶液。将f43ymb蛋白溶于的磷酸二氢钾-氢氧化钾的缓冲溶液(ph[7.4)中，使蛋白溶液浓度为10μm。将配制好的吲哚-乙醇溶液分散到f43y蛋白溶液中，使吲哚的终浓度为1mm。混合溶液在37℃下孵化半小时后，加入1mm过氧化氢溶液，利用紫外可见分光光度计，监测f43ymb蛋白酶催化反应体系在670nm的吸光度变化，15分钟内光谱变化如图4所示。实施例4按照实施例2操作，将f43ymb催化反应15min后的混合液体于4000r/min条件下离心30min，得到上层清液和蓝色沉淀，取蓝色沉淀溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，定容至3ml(图6)。实施例5按实施例4操作，测沉淀-dmf溶液紫外可见光谱，再与靛蓝的标准品-dmf溶液紫外可见光谱比对(图7)，可以确定所得沉淀为靛蓝。实施例6按照实施例4操作，将靛蓝-dmf溶液注入超高效液相色谱(uplc)，色谱柱为2.1×100mmbehc181.7μm，流动相为甲醇-水(v：v，1：1)，监测250nm处的吸收峰，根据定量的靛蓝标准品-dmf溶液在相同条件下的色谱吸收峰面积，计算出产物靛蓝的浓度(图8和表1)。结果显示，f43ymb的靛蓝产率高达54％。实施例7配制0.1mm，0.2mm，0.3mm，0.4mm，0.5mm，0.6mm，0.7mm，0.8mm，0.9mm，1mm的靛蓝标准溶液(溶剂为dmf)，分别测定不同浓度靛蓝溶液的吸光度，绘制浓度-吸光度的标准曲线，得a＝14.71446c-0.01494(r^2＝0.9994)。3ml1mm的吲哚与过氧化氢经f43y蛋白酶(实施例1制得)催化反应后按照实施例5步骤，得到的靛蓝溶液吸光度为2.6，靛蓝浓度为0.18mm。f43y催化吲哚合成靛蓝的产率为54％。对比例1配制10μm的wtmb。配制1m的吲哚(indole)溶液(溶剂为乙醇)、200mm的过氧化氢溶液。将wtmb蛋白溶于的磷酸二氢钾-氢氧化钾的缓冲溶液(ph7.4)中，使蛋白溶液浓度为10μm。将配制好的吲哚-乙醇溶液分散到wtmb蛋白溶液中，使吲哚的终浓度为1mm。混合溶液在37℃下孵化半小时后，加入1mm过氧化氢溶液，继续在37℃下反应15分钟拍照，可见wtmb催化反应无明显颜色变化(图3)。对比例2配制10μm的wtmb(野生型肌红蛋白)。配制1m的吲哚(indole)溶液(溶剂为乙醇)、200mm的过氧化氢溶液。将wtmb蛋白溶于的磷酸二氢钾-氢氧化钾的缓冲溶液(ph7.4)中，使蛋白溶液浓度为10μm。将配制好的吲哚-乙醇溶液分散到wtmb蛋白溶液中，使吲哚的终浓度为1mm。混合溶液在37℃下孵化半小时后，加入1mm过氧化氢溶液，利用紫外可见分光光度计，监测wtmb蛋白酶催化反应体系的吸光度变化，可见光谱在670nm无明显变化(图5)。结果表明，wtmb不能催化吲哚与过氧化氢反应生成靛蓝。效果例配制10μm的f43ymb(实施例1制得)，配制1m的吲哚(indole)溶液(溶剂为乙醇)、200mm的过氧化氢溶液。将f43ymb蛋白溶于的磷酸二氢钾-氢氧化钾的缓冲溶液(ph7.4)中，使蛋白溶液浓度为10μm。将配制好的吲哚-乙醇溶液分散到f43y蛋白溶液中，使吲哚的终浓度为0.5mm、1mm、1.25mm、1.5mm、1.75mm、2mm、2.5mm、3mm、4mm。混合溶液在37℃下孵化半小时后，加入吲哚终浓度等量的过氧化氢溶液，在37℃下反应15分钟，利用紫外可见光谱进行动力学监测，每10s测一次670nm处的吸光度，得到670nm处吸光度随反应时间的变化曲线，对反应曲线的初试线性部分进行拟合，得到靛蓝生成的初试反应速率，将反应速率对吲哚浓度作图(图8)，然后再用michaelis-menten酶促动力学方程拟合，从拟合出来的米氏曲线可以得到酶促反应的动力学参数kcat和km，与已有文献报道的h64dmb做对比(表1)。结果显示，f43ymb具有更好的催化效率。表1mbmutantskcat(min-1)km(mm)kcat/km(m-1s-1)indigoyieldbwtn.dn.dn.dn.df43y13.82.0911054％对照：h64da4.81.74720％a：j.xu,o.shoji,t.fujishiro,t.ohki,t.ueno,y.watanabe,catal.sci.technol.2(2012)739.b：theyieldofindigobasedonconsumedindole.nd：notdetectable文献(j.xu,o.shoji,t.fujishiro,t.ohki,t.ueno,y.watanabe,catal.sci.technol.2012,2:739-744)报道，也可使用肌红蛋白单突变体h64dmb作为催化剂，但产率只有20％，而且生成很多副产物。表1为wtmb和f43ymb，以及h64dmb催化吲哚氧化生成靛蓝的稳态动力学参数之间的比较以及靛蓝的产量。与h64dmb相比，本发明提供的突变体f43ymb催化制得的靛蓝的产量极显著提高(p＜0.01)。本发明提供的f43ymb蛋白酶与文献报道的使用肌红蛋白单突变体h64dmb(j.xu,o.shoji,t.fujishiro,t.ohki,t.ueno,y.watanabe,catal.sci.technol.2012,2:739-744)相比，催化吲哚与过氧化氢反应生成的靛蓝产率增加了200％，且本发明中使用的产物提取方法简单且环保，将反应后的混合液高速离心后，所得固体沉淀物即为靛蓝。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
：的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>南华大学<120>一种基于肌红蛋白突变体的染料靛蓝的生物制备方法<130>mp1808067<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>153<212>prt<213>f43ymb(f43ymb)<400>1valleusergluglyglutrpglnleuvalleuhisvaltrpalalys151015valglualaaspvalalaglyhisglyglnaspileleuileargleu202530phelysserhisprogluthrleuglulystyraspargphelyshis354045leulysthrglualaglumetlysalasergluaspleulyslyshis505560glyvalthrvalleuthralaleuglyalaileleulyslyslysgly65707580hishisglualagluleulysproleualaglnserhisalathrlys859095hislysileproilelystyrleuglupheileserglualaileile100105110hisvalleuhisserarghisproglyasppheglyalaaspalagln115120125glyalametasnlysalaleugluleuphearglysaspilealaala130135140lystyrlysgluleuglytyrglngly145150<210>2<211>465<212>dna<213>f43ymb(f43ymb)<400>2atggttctgtctgaaggtgaatggcagctggttctgcatgtttgggctaaagttgaagct60gacgtcgctggtcatggtcaggacatcctcattcgactgttcaaatctcatccggaaact120ctggaaaaatatgatcgtttcaaacatctgaaaactgaagctgaaatgaaagcttctgaa180gatctgaaaaaacatggtgttaccgtgttaactgccctaggtgctatccttaagaaaaaa240gggcatcatgaagctgagctcaaaccgcttgcgcaatcgcatgctactaaacataagatc300ccgatcaaatacctggaattcatctctgaagcgatcatccatgttctgcattctagacat360ccaggtgacttcggtgctgacgctcagggtgctatgaacaaagctctcgagctgttccgt420aaagatatcgctgctaagtacaaagaactgggttaccagggttaa465当前第1页12当前第1页12