抗PCV2单克隆抗体的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物免疫技术领域，具体涉及一种抗pcv2单克隆抗体的制备方法及其应用。

背景技术

猪圆环病毒（porcinecircovirus，pcv）属于圆环病毒科（circoviridae）、圆环病毒属（circovirus）成员，是迄今发现的最小的dna病毒，由其引起的猪传染性疾病在全球猪群中广泛存在，是国际公认的危害世界各国规模化养猪业的重要免疫抑制病原。

其中pcv2是引发pmws、猪皮炎和肾病综合症（porcinedermatitisandnephropathysyndrome，pdns）、猪呼吸道疾病综合征（porcinerespiratorydiseasecomplex，prdc）等疾病的主要病原，导致养猪业遭受严重损失。目前在我国主要流行毒株依然是pcv2，pcv2感染导致猪群免疫力降低，随之而来的其他多种病原的混合或继发感染更是给养猪业带来严重的威胁。

pcv2的基因组包括两个主要的开放阅读框（openreadingframe，orfs）。orf1编码两个复制相关的蛋白（rep和rep’），这两个蛋白参与pcv2的复制过程。orf2编码病毒结构蛋白cap蛋白，该蛋白通过多聚结合后形病毒的衣壳。cap蛋白作为猪圆环病毒唯一的结构蛋白，具有很高的免疫原性，是疫苗开发和疫病检测的主要靶标。

目前实验室诊断pcv2的方法主要有病毒的分离与鉴定技术、分子生物学诊断方法及免疫学诊断方法3大类。

在实现本发明过程中，发明人发现现有技术中至少存在如下问题：

病毒的分离与鉴定是最为准确的诊断pcv2感染的方法，但pcv2在细胞中增殖并不产生明显的细胞病变，后续鉴定还需要其他技术，整个过程技术繁杂，需要专业人士进行操作，且耗时费力，不适于疾病快速诊断；

分子生物学诊断方法主要包括聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,pcr）检测技术、基因芯片检测技术、核酸杂交检测技术等。随着分子生物学的不断发展，pcr因其快速、敏感性高等优点在实验室中被广泛应用于检测疾病病原，但其操作耗时耗力，对技术和设备要求高，因此无法在实际的生产养殖中推广应用。

常用的免疫学诊断方法主要包括免疫组织化学（immunohistochemistry，ihc）、ipma、ifa、酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa）及免疫层析试纸快速检测技术（immuno-chromatographiclateralflowstriptest，ilfst）等。这些免疫学检测方法具有高度的灵敏性和特异性，重复性好等优点，在流行病学普查和疫苗免疫效果评价中也具有很高实用性。

单克隆抗体是利用免疫学检测方法检测病原的核心试剂，其特异性和亲和力是决定免疫学检测方法的特异性和灵敏度的重要因素，因此获得针对检测靶标的特异性抗体是建立病原免疫学检测方法的关键。随着猪圆环病毒疫苗大面积地使用，血清学的检测数据不再反应猪圆环病毒野毒的感染状况，因此，病原学检测变得越来越重要。

然而，目前亟需制备出一种与pcv1、pcv3和其他猪源病毒均无交叉反应且可以同时用于多种免疫检测手段的pcv2单克隆抗体，进而确定其重链可变区序列和轻链可变区序列以改造其抗体可变区序列制备不同组合形式的基因工程抗体，以期进一步提升抗体的特异性和亲和力。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种抗pcv2单克隆抗体的制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

筛选得一种抗pcv2单克隆抗体，其重链可变区dna序列为如seqidno.1所示的序列；其重链可变区氨基酸序列为如seqidno.2所示的序列，或在所述seqidno.2序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换而获得活性片段或保守性变异体的序列；和/或

其轻链可变区dna序列为如seqidno.3所示的序列；其轻链可变区氨基酸序列为如seqidno.4所示的序列，或在所述seqidno.4序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。

优选的，所述单克隆抗体的轻链型为kappa，亚型为igg2a。

优选的，所述单克隆抗体的elisa效价不小于1：2.56×10⁵。

优选的，所述单克隆抗体的ipma效价为1：8×10⁴。

优选的，所述单克隆抗体的亲和力不小于1.26×10^-10mol/l。

设计一种所述的抗pcv2单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）以pcv2acap蛋白的亚单位疫苗免疫小鼠；

（2）融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；

（3）采用ipma检测结合及多轮亚克隆的方法得阳性杂交瘤细胞；

（4）提取阳性单克隆杂交瘤细胞株rna反转录成cdna，经过pcr扩增出单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列；

（5）对阳性克隆进行克隆化培养，得pcv2单克隆抗体杂交瘤细胞株；

（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。

所述的抗pcv2单克隆抗体在抗原/抗体检测试剂盒、抗原/抗体免疫层析试纸以及ifa、ipma中的应用。

所述的抗pcv2单克隆抗体在pcv2或pcv2cap的免疫亲和柱中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明的单克隆抗体是由单个细胞株产生的，具有高度特异性、均一性等特性，单抗纯度高、特异性强、重复性好、且能持续地无限量供应，在免疫检测中具有更广泛的研究应用价值和商业使用价值。

2.本发明的单克隆抗体可以同时用于elisa、ipma、westernblot等多种检测手段。

3.本发明的单克隆抗体具有较高特异性，与pcv1、pcv3均无交叉反应，与其他猪源病毒如csfv、prrsv、prv等均无交叉反应，可以用于猪圆环病毒2型的抗原检测，降低假阳性结果。

4.本发明的单克隆抗体具有高度的灵敏度，该单克隆抗体只与pcv2特异性结合，其亚型为igg1，轻链型为kappa型，亲和力不小于1.26×10^-10mol/l，elisa

效价不小于1：2.56×10⁵，ipma效价为1：8×10⁴。

5.本发明筛选得到的单抗具有稳定的抗体分泌能力，能快速特异的识别pcv2及其cap蛋白，为pcv2抗原快速检测的技术难题的解决奠定了很好的基础，在pcv2相关的免疫检测中具有重要价值。

6.在本发明单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列的基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，为进一步提升抗体的特异性和亲和力奠定基础。

附图说明

图1为elisa及ipma对免疫小鼠血清效价测定统计图；

图2为1号小鼠的ipma效价测定对比图；

图3为单抗3b6的亲和常数测定曲线图；

图4为单抗3b6的特异性westernblot电泳图；

其中，泳道m为蛋白标准分子量marker；泳道1为原核表达的pcv2cap蛋白；泳道2为bl21阴性对照；

图5为ipma单抗3b6的特异性检测对比图；

图6为ipma检测单抗3b6与pcv1、pcv3、csfv、prrsv、prv及pedv等猪源病毒的交叉反应性对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：分泌抗pcv2单抗的杂交瘤细胞株的制备及鉴定

1.主要材料

pcv2acap蛋白亚单位疫苗为市售，balb/c小鼠购自郑州大学医学院，骨髓瘤细胞sp2/0购自郑州大学生命科学学院分子免疫学实验室，猪圆环病毒2型cap蛋白购自郑州大学生命科学学院分子免疫学实验室，pcv2kf株、猪圆环病毒1型pcv1、pcv3、猪瘟病毒csfv石门株、猪繁殖与呼吸综合症病毒prrsvbj-4株、猪伪狂犬病毒prvhn-jz-16、猪流行性腹泻病毒pedv购自河南省农业科学院动物免疫学重点实验室。

2.主要试剂

弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、hat、ht、peg-1500、rpml-1640细胞培养基、胎牛血清购自gibco公司，hrp标记羊抗鼠igg购自sigma公司，液体aec酶底物试剂盒购自中杉金桥公司，bca蛋白浓度测定试剂盒购自solarbio公司，单抗亚型测定试剂盒购自北京义翘神州生物技术有限公司。

3.免疫balb/c小鼠

（1）将抗原成分为pcv2acap蛋白的亚单位疫苗分别加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原，其中pcv2acap蛋白与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂体积比均为1：1；

（2）通过背部皮下多点注射的方法，用弗氏完全佐剂免疫原免疫8周龄的雌性balb/c小鼠3只，免疫剂量是100μl/只；

（3）在首次免疫14天和28天后分别用弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量对balb/c小鼠进行加强免疫，免疫两周后，尾部采血，测小鼠血清效价；

（4）加强免疫后3～30周，细胞融合前3～4天，选取血清效价最高的小鼠通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的pcv2acap蛋白的亚单位疫苗对balb/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量是50μl/只。

4.免疫小鼠血清抗体效价测定

elisa测效价：

（1）用包被液稀释纯化的原核表达的猪圆环病毒2型cap蛋白至1µg/ml，每孔加入50µl包被液，37℃孵育2h，弃包被液，用pbst洗涤3次；

（2）用300µl封闭液（5％脱脂奶粉+pbst）于4℃过夜封闭；

（3）每孔加入用稀释缓冲液（pbst）以2倍倍比稀释的待检血清各50µl（初始稀释倍数为1：400），于37℃孵育1h后，弃上清液，用pbst洗涤6次；

（4）向每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的hrp标记的羊抗小鼠igg各50µl，37℃保温0.5h后弃上清，用pbst洗涤液洗涤6次；

（5）向凹孔中加入50µldab显色液，室温避光作用20min后加2mh2so450µl终止液终止反应，并用酶标仪测定od450值。

ipma测效价：

（1）用pcv2kf毒株作为毒种，分别按5%、10%和15%毒种剂量接种于新消化的pk15细胞悬液(2×10⁵/ml)，病毒维持液为含2%fcs的rpmi1640；

（2）每孔按100μl病毒培养物铺于96孔细胞培养板中，同时设未接种病毒的pk15细胞作为阴性对照，于37℃5%co2条件下培养形成单层；

（3）用丙酮-pbs固定，用pbs浸洗一次，待检血清用pbs按1：200起进行2倍梯度稀释，同时作阳性血清、阴性血清和未接毒细胞对照，加样量为100μl/孔，置37℃孵育lh；

（4）pbs洗3次，加入l：1000稀释的hrp标记羊抗鼠二抗，置37℃孵育lh；

（5）pbs洗3次，加入aec底物液显色30min，用光学显微镜观察判定结果。

结果如图1和图2所示，elisa及ipma结果显示1号小鼠elisa效价和ipma效价均为最高，其ipma效价可达到1：6400，选取1号小鼠用于细胞融合制备单克隆抗体。

5.细胞融合

（1）饲养细胞的制备

a.取2只昆明鼠引颈致死后浸泡在75%酒精消毒液中体表消毒；

b.将75%酒精浸泡过的昆明鼠固定在石蜡板上，在超净台中用无菌手术剪剪开腹部皮肤，暴露腹膜；

c.用无菌镊子提起腹膜，用无菌注射器将5mlhat选择培养基缓慢注入小鼠腹腔，轻轻按压腹腔再将注入的培养基重新吸出；

d.将饲养细胞浓度调整为约2×10⁵cells/ml，每孔100µl铺至96孔细胞培养板中，37℃，5%co2培养箱中培养。

饲养细胞需在融合前1天制备。也可以用适量hat选择培养基将饲养细胞稀释至所需量临时存放在500ml无菌螺口瓶中，与待融合细胞后一起铺至96孔细胞培养板中。

（2）脾细胞的制备

a.取效价最高的1号balb/c小鼠进行超免，4～5天后引颈致死，用75%酒精体表消毒；

b.在超净工作台中无菌操作取出小鼠脾脏，用37℃预热的gnk溶液洗2次，加少许hat培养基在无菌的120目尼龙纱布上用小剪刀剪碎脾脏；

c.将脾细胞滤至无菌烧杯并转至无菌细胞离心管中，1000r/min离心10min洗涤细胞1～2次备用。

（3）细胞融合及融合细胞的培养

a.对小鼠进行超免后第3天，采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0按细胞数量10：1的比例进行细胞融合；

b.融合后的细胞用hat选择培养液轻轻混悬，分散融合细胞到96孔细胞培养板中，250μl/孔，置37℃、5%co2培养箱内培养

c.培养3～4天可以显微镜观察到小细胞团；

d.融合后7天改用ht培养基半量换液，第10天吸取25µl细胞培养上清，用ipma进行初筛。

6.杂交瘤细胞的筛选鉴定

（1）用pcv2kf毒株作为毒种，分别按5%、10%和15%毒种剂量接种于新消化的pk15细胞悬液（2×10⁵/ml），病毒维持液为含2%fcs的rpmil640；

（2）每孔按100μl病毒培养物铺于96孔细胞培养板中，同时设未接种病毒的pk15细胞作为阴性对照，于37℃5%co2条件下培养形成单层；

（3）用丙酮-pbs固定制备ipma反应板，经干燥后置20℃保存备用；

（4）取ipma反应板置室温预热，用pbs洗一次，待检融合细胞培养上清用pbs按1：20进行稀释，同时作阳性血清、阴性血清和未接毒细胞对照，加样量为500μl/孔，置37℃孵育lh；

（5）pbs洗3次，加入l：1000稀释的hrp标记羊抗鼠二抗，置37℃孵育lh；

（6）pbs洗3次，加入aec底物液显色30min，用光学显微镜观察判定结果，从中筛选出阳性杂交瘤细胞株进行扩大培养和进一步亚克隆。

7.通过有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆

（1）用1640/10完全培养基稀释上述阳性杂交瘤细胞至约3cells/ml，每孔100µl加入到预铺有100µl饲养细胞的96孔板中，置于37℃，5%co2培养箱中培养6~8天；

（2）将阳性单克隆细胞株转入24孔细胞培养板进行扩大培养；

（3）进行二次亚克隆，直至直到获得稳定分泌抗猪圆环病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即可获得目的杂交瘤细胞，命名为3b6；

（4）将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1～2×10⁶/管进行冻存。

8.单克隆杂交瘤细胞稳定性鉴定

将获得的阳性单克隆杂交瘤细胞进行连续传代至35次，分别取不同代次的培养上清用elisa进行稳定性测定，测定结果如表1所示：

表1不同代次的杂交瘤细胞分泌抗体的效价

。

elisa结果表明细胞传至35代相应的杂交瘤细胞株均能够稳定地分泌特异性单克隆抗体，说明这一株杂交瘤细胞株的单克隆化程度都比较高，性状比较稳定，可以用做种子长期保存和大量制备单克隆抗体。

实施例二：抗pcv2单克隆抗体腹水的制备

将实施例一中单克隆杂交瘤细胞株3b6扩大培养，elisa法测培养上清效价，确保单克隆细胞株性状稳定，收集细胞用于大量制备单克隆抗体。

1.单克隆抗体腹水的制备及纯化

（1）选择经产的雌性balb/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，刺激免疫细胞用以促进杂交瘤细胞的增殖；

（2）观察小鼠状态，7～10天后按照每只约1×10⁷个细胞的量注入提前准备好的单克隆阳性细胞，及时观察小鼠状态，约10天后抽取腹水，8000r/min，4℃离心20min去除油脂及细胞沉淀，收集腹水上清-80℃保存备用；

（3）一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×10⁵个细胞；

（4）再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清；

（5）使用辛酸硫酸铵法粗提腹水igg，并用de-52离子交换柱纯化小鼠igg，用elisa对腹水效价进行测定。

2.单克隆抗体腹水elisa效价测定

（1）用cbs液将pcv2cap蛋白稀释成浓度为2µg/ml的包被液包被酶标板，100µl/孔，4℃封闭过夜；

（2）将pcv2单抗抗体（一抗）用5%的脱脂奶进行倍比稀释，依次加入酶标板中，100µl/孔，阳性对照为pcv2猪阳性血清，阴性对照为prrsv的单抗腹水，37℃孵育30min；

（3）弃去一抗，用pbst洗板，洗干净，拍干；

（4）将稀释好的hrp标记的羊抗鼠igg（二抗）加入反应孔中，100µl/孔。37℃孵育30min；

（5）弃去二抗，用pbst冲洗干净，拍干；

（6）每孔加入现配的tmb显色液100µl，暗室反应15min；

（7）每孔加入50µl2mh2so4终止反应；

（8）酶标仪读取每孔的od450值。

elisa检测结果显示该单克隆抗体腹水效价为1：1.024×10⁶。

3.单克隆抗体腹水ipma效价的测定

按照彭伍平等（猪圆环病毒2型ipma和ifa检测方法的建立.首届中国兽药大会暨中国畜牧兽医学会动物药品学分会2008年学术年会.）文献中的ipma方法测定单抗3b6效价。

单抗初始浓度从1：1000，用5%的脱脂奶进行10倍倍比稀释，未感染pcv2的pk15细胞孔作为阴性对照，hrp标记二抗的稀释度为1：1000，每孔加入50µlaec显色液进行显色。

ipma结果显示3b6效价1：5.12×10⁵。

实施例三：抗pcv2单克隆抗体的鉴定

1.亚型鉴定

单抗亚类和型的鉴定按mousemonoclonalantibodyisotypingkit使用说明书操作。

单抗亚类和亚型的鉴定结果显示单克隆抗体3b6亚型为igg2a，如表2所示，其轻链型为kappa型。

表2单克隆抗体亚型鉴定

。

2.亲和力鉴定

用cbs液将pcv2cap蛋白稀释成浓度0.5µg/ml和1µg/ml的包被液分别包被酶标板，通过间接elisa法测定单抗腹水效价，以单抗浓度为横坐标，od450值为纵坐标，绘出相应的2条间接elisa反应曲线。

以每条曲线上部平坦段的od450值作为100%，在曲线上算出50%od450值时对应的抗体浓度，按照公式kaff=(n-1)/2(n[ab′]t-[ab]t)计算单抗的亲和常数，其中n=[ag]t/[ag′]t，[ag]t、[ag′]t为2个不同的包被原浓度，[ab]t、[ab′]t为各包被原浓度下50%od450值对应的抗体浓度。

如图3所示，根据亲和力测定结果计算出3b6单克隆抗体亲和常数k值为3.6×10^-9mol/l。

3.特异性鉴定

分别用elisa、westernblot及ipma实验鉴定单抗3b6的特异性，取纯化的pcv2病毒进行elisa检测，结果显示单抗3b6可与病毒发生特异性反应，而与pk15细胞对照不发生反应。

取纯化的pcv2-cap蛋白及大肠杆菌其他无关蛋白作对照，进行sds-page凝胶电泳，然后将其转印到硝酸纤维素膜上，筛选获得的单抗3b6作为一抗，hrp标记的羊抗鼠igg(h+l)作为二抗，用aec酶底物试剂盒显色。

如图4和图5所示：westernblot试验结果表明，单抗3b6可与pcv2-cap蛋白发生特异性反应，而与无关蛋白不发生反应；ipma结果显示单抗3b6可与pcv2病毒发生特异性反应，而与pk15细胞不发生反应。

4.与猪源病毒的交叉反应性鉴定

将单抗腹水按一定比例稀释后分别加入猪圆环病毒2型pcv2kf株、猪圆环病毒1型pcv1、pcv3、猪瘟病毒csfv石门株，猪繁殖与呼吸综合症病毒prrsvbj-4株，猪伪狂犬病毒prvhn-jz-16株，猪流行性腹泻病毒pedv感染的细胞，利用ipma检测方法，测定pcv2单克隆抗体3b6、3g11与pcv1、pcv3、csfv、prrsv、prv、pedv是否具有交叉反应性。

ipma结果如图6所示，单抗3b6和3g11均只与pcv2反应为阳性结果，与其它几种病毒（pcv1、pcv3、csfv、prrsv、prv、pedv）的反应结果均为阴性，证明单克隆抗体3b6与pcv2反应的特异性好，与其它几种常见的猪病毒无交叉反应。

实施例四：抗pcv2单克隆抗体可变区基因的扩增

根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：

p1：5’-ttctcttgacgttgtactgg-3’；

p2：5’-ttttgaggagacggtga-3’。

设计轻链可变区引物序列：

p3：5’-ttatgggtagttcatggagaca-3’；

p4：5’-acacatggtgcagcatcagcc-3’。

通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体3b6的可变区序列，送上海生工生物有限公司测序。测定单克隆抗体3b6的重链可变区和轻链可变区基因序列分别为seqidno.1、seqidno.3所示，由其推导的3b6的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为seqidno.2、seqidno.4所示。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

sequencelisting

<110>河南中泽生物工程有限公司

<120>抗pcv2单克隆抗体的制备方法及其应用

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