新型猪源融合抗菌肽VASP生物制剂的制备及应用的制作方法

本发明属于生物技术和基因工程领域，涉及新型猪源融合抗菌肽vasp生物制剂的制备及应用。

背景技术

现在限制我国养殖业进一步发展和提高经济效益的主要问题是防控动物疾病、提高动物产品质量和优质廉价饲料的开发生产。我国出口动物产品因检疫和药残问题，出口所占比例很低，如猪肉为23万多吨，仅占国际贸易量的4％左右。尤其是四川动物饲料的豆粕等蛋白质原料的90％和玉米等能量饲料原料的70％均依赖外部供给，这就严重制约了我国的畜牧业生产发展和经济效益的提高。因此，如何减少饲料中抗生类素添加剂的使用、克服动物产品的药残危害、有效防控动物疾病发生、保障绿色有机动物食品的生产，保护人民群众生命健康安全，已成为当代亟需解决的重大科技和社会经济难题。

目前中国畜禽养殖业随着集约化程度提高，畜禽养殖规模和养殖密度日益扩大，迫于控制30多种传染性病原感染传播扩散的压力，尤其是禽流感和呼吸繁殖综合症等烈性病相继循环爆发；动物养殖中耐药菌引起的腹泻，沙门、大肠杆菌、链球菌、蓝耳病(prrsv)、圆环病毒(pcv2)、猪瘟(csfv)等各种细菌、病毒性疾病，严重阻碍畜牧业的发展；也使抗生素等药物添加剂在饲料的滥用情况非常严重，畜禽疾病和抗生素饲料添加剂的公害问题已经成为制约我国畜禽养殖业发展水平和经济效益提高的瓶颈。饲料抗生素添加剂的滥用不仅提高饲养成本，也导致病原微生物的耐药性和致病力明显增强，严重破坏了动物消化道的微生态平衡，长期使用后在动物体内残留并富集，畜禽机体因药物毒副作用而削弱健康水平，免疫抗病力显著下降。如此恶性循环，畜禽各种烈性传染疾病频繁发生，难于控制和治疗。而另一方面，药物残留及日益严重的畜禽产品食品安全问题，不仅直接威胁着人类自身的健康，也阻碍了养殖业的发展。

动物饲料添加抗生素，长期或不适当使用不仅将诱导病菌出现抗药性，而且在动物产品出现药物残留，造成严重的食品安全隐患，损害人类健康以及招致治疗抗生素的药物失效。欧盟、美国等发达地区2006年开始全面限制抗生素作为饲料添加剂。我国也将严格限制饲料添加抗生素。现代养殖业急需开发取代传统抗生素的无残留、无抗性诱导、安全无污染的新型生物饲料及其添加剂。

抗菌肽分子量小，分离纯化和检验存在一定的困难。目前科研和应用中抗菌肽的主要来源是化学合成，但化学合成成本高，量小，不利于大规模应用。并且现有的单一抗菌肽分子存在抗菌谱较窄、生物活性较低等缺点；利用基因工程手段，重组连接多个抗菌肽基因，获得具有广谱抗多种微生物(g+、g-、病毒、真菌、寄生虫)和免疫调节活性的高效重组抗菌肽分子，是克服现有技术和产品缺陷的重要新途径。

有关抗菌肽基因与其它相关基因融合克隆和表达的报道也逐渐增多，但很少见有关将多种抗菌和免疫调节活性的短肽基因融合，有效共表达后形成多种抗感染活性分子而协同抗感染和提高免疫水平的报道。

技术实现要素：

本发明一个目的是提供新型猪源融合抗菌肽vasp生物制剂。

本发明提供的一种蛋白质(vasp)，为如下a)-e)中任一种蛋白质：

a)氨基酸序列包括序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质；

b)氨基酸序列由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成；

c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；

d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；

e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：

1)其编码序列包括序列表中序列2；

2)其编码序列为序列表中序列2；

3)在严格条件下与1)或2)限定的dna分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的dna分子；

4)与1)或2)限定的dna分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码上述蛋白的dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。序列2编码序列1所示的vasp。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码vasp的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的vasp的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码vasp且具有vasp功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，b2)所述的含有编码vasp的核酸分子的表达盒(vasp基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达vasp的dna，该dna不但可包括启动vasp基因转录的启动子，还可包括终止vasp基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的载体构建含有所述vasp基因表达盒的重组载体。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pvax1载体。

b3)所述重组载体可含有序列2所示的用于编码vasp的dna序列。进一步所述重组载体具体可为pvax1。所述pvax1-sp为将pvax1载体的hindⅲ、和xbal识别序列间的dna片段替换为序列1所示的vasp基因，得到的重组载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组真核载体为将所述vasp基因导入pvax1中得到的重组质粒。

上述应用中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

下述1)-3)中的任一种生物材料也是本发明保护的范围：

1)含有上述核酸分子的表达盒；

2)含有上述核酸分子的重组载体；

3)含有上述核酸分子的重组菌或转基因细胞系；

4)含有所述重组载体的纳米颗粒。

上述纳米颗粒为将所述重组载体用壳聚糖或阳离子脂质体包裹得到的纳米颗粒。

上述蛋白质或上述核酸分子或上述的生物材料在下述c1或c2或c3中的应用也是本发明保护的范围内：

c1、在提高动物免疫能力；

c2、制备提高动物免疫能力产品；

c3、制备作用动物的广谱抗感染产品。

上述应用中，所述提高动物免疫能力为下述m1-m5中的至少一种：

m1、抑制致病微生物的生长；

m2、促进免疫细胞的增加；

m3、促进疫苗诱导的免疫应答；

m4、促进细胞免疫和/或体液免疫；

m5、提高动物发育和生长增重；

和/或，所述致病微生物具体为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪肺炎支原体、猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒或猪瘟病毒；

和/或，所述免疫细胞具体为淋巴细胞或白细胞；

和/或，所述抗体具体为igg、igg1和/或igg2a；

和/或，所述广谱抗感染为抗细菌、抗病毒、真抗菌或抗寄生虫。

本发明另一个目的是提供如下产品。

本发明提供下述x1或x2任一产品：

x1、生物制剂，含有下述x3a、x3b或x3c：

x3a、上述蛋白质；

x3b、上述核酸分子；

x3c、上述的生物材料；

x2、用于提高动物免疫能力的成套试剂，由上述x1与抗生素组成。

上述产品中，所述生物制剂可以x3a、x3b或x3c为活性成分，还可以将x3a、x3b或x3c与其他可以提高动物免疫能力的物质组合在一起的组合物为活性成分。

上述产品中，所述抗生素可为卡那霉素。

本发明第3个目的是提供一种提高动物免疫能力的方法。

本发明提供的方法，包括对动物施用上述蛋白质或上述核酸分子或上述的生物材料或所述生物制剂或所述成套试剂，提高所述动物的免疫能力。

上述中，所述动物为h1或h2：

h1、哺乳动物；

h2、小鼠。

上述中，所述致病微生物可为大肠杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌。

所述免疫细胞可为淋巴细胞(如cd4+或cd8+)、红细胞或白细胞。

所述抗体可为igg、igg1和/或igg2a。所述抗体具体可为所述致病微生物的抗体。

本发明中，所述动物可为哺乳动物。所述哺乳动物具体可为小鼠。

本发明中，所述提高动物免疫能力产品均可为提高动物免疫能力的药物。

实验证明，本发明的融合表达vasp分子具有以下作用：促进动物淋巴细胞、红细胞和白细胞的增加，施用vasp的动物体内淋巴细胞、红细胞和白细胞含量可提高10％以上；明显抑制致病微生物的生长，施用vasp的致病微生物的量可降低达20％以上；促进非特异性抗体(igg、igg1、igg2a)及疾病特异抗体的分泌，施用vasp的动物体内非特异性抗体的含量可提高40％-60％；促进免疫相关基因的表达，进而提高动物的免疫抗感染能力，施用vasp的动物攻毒存活率明显提高至少60％，生长增重率10％以上。

本发明通过基因重组融合，构建新的具有抗细菌、病毒、真菌及寄生虫和免疫调节等广谱免疫抗感染活性的融合抗菌肽基因，表达融合蛋白vasp，进一步通过mic法研究融合蛋白vasp的免疫调节及其抗感染活性，以获得广谱高效抗微生物和免疫调节作用强的重组蛋白。

附图说明

图1为pvasp及转化子中目的基因的酶切及pcr结果。

图2为大提pvasp质粒琼脂糖凝胶电泳验证结果。

图3为pvasp真核表达rt-pcr电泳图谱。

图4为体外验证pvasp上清液刺激猪淋巴细胞增殖实验结果。

图5为融合抗菌肽基因表达上清液对大肠杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌生长抑制效果。

图6为实验小鼠注射pvasp后外周血白细胞总数变化。

图7为实验小鼠注射pvasp后外周血cd4+\cd8+t细胞总数级比例变化。

图8为实验小鼠注射pvasp后外周血igg，igg1，igg2a水平变化。

图9为实验小鼠注射pvasp后体重变化。

图10为实验小鼠注射pvasp后tlrs基因表达水平变化。

图11为实验小鼠注射pvasp后白细胞介素基因表达水平变化。

图12为实验小鼠注射pvasp后ifn-γ基因表达水平变化。

图13为实验小鼠注射pvasp后细菌攻毒存活率。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的pvax1载体为invitrogen，lifetechnologies公司产品，产品目录号为catalogno.v260-20。

下述实施例中的大肠杆菌标准菌(g^-)为atcc(americatypeculturecollection)产品，产品目录号为25922；沙门杆菌(g^-,atcc14028)，americatypeculturecollection产品，目录号为14028；金黄色葡萄球菌标准菌(g⁺,atcc29213)为atcc(americatypeculturecollection)产品，产品目录号为29213。链球菌标准菌(g⁺,atcc19615)，为atcc(americatypeculturecollection)产品，产品目录号为19615。

下述实施例中的大肠杆菌耐药菌(g-)和金黄色葡萄球菌耐药菌(g⁺)为四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室提供，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的雌性昆明小鼠为四川省人民医院实验动物研究所产品。

实施例1、猪抗菌肽融合蛋白(vasp)具有抑菌作用

本发明采用的猪抗菌肽融合蛋白，名称为vasp，其带有tpa分泌信号肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示，编码蛋白vasp的基因vasp的核苷酸序列如序列2所示。

其中，序列1第1-25位为tpa分泌信号肽、第26-160位为猪融合抗菌肽，161-166为标签分子。序列2第1-75位为tpa分泌信号肽编码基因、第76-480位为猪融合抗菌肽编码基因，481-498为编码标签分子基因。

一、真核表达载体pvax1-sp的制备

将pvax1载体的hindⅲ和xbal识别序列间的dna片段替换为序列2所示的带有tpa分泌信号肽的基因vasp，保持载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为pvax1-sp(简称pva-sp)，真核表达载体pva-sp能表达序列1所示的猪抗菌肽融合蛋白(vasp)。

hindⅲ和xbal双酶切检测重组载体pvax1-sp。

结果如图1所示，a为重组质粒pvax1-sp电泳图谱(1％琼脂糖凝胶)；lanem:dl5000marker；lane1:pvax1-sp，大小为3385bp；lane2:pvax1空载体，大小为2999bp；b为重组质粒pvax1-sp双酶切电泳图谱(1％琼脂糖凝胶)；lanem:dl5000marker；lane1:pvax1经过hindⅲ、xbalⅰ双酶切得到2900bp和100bp；lane2:pvax1空载体，3000bp；lane3:重组质粒pvax1-sp经过hindⅲ、xbalⅰ双酶切得到2900bp和500bp；可以看出，成功将vasp基因导入pvax1真核表达载体，证明融合抗菌肽的重组真核表达质粒构建成功。

二、融合基因重组质粒pvasp真核细胞表达及体外生物学活性检测

1、重组质粒的大量提取

将上述一得到的真核表达载体pvasp转化至大肠杆菌mach1-t1phageresistant感受态细胞中(购自于transgene公司)；采用常规的碱裂解法大量提取重组质粒pvasp。

(1)将带有重组真核质粒pvasp的e.coli接种于3mllb/kana抗生素培养液中，37℃震荡培养过夜。取2ml过夜培养的菌液，接种到200mllb/kana抗生素培养液中，37℃震荡培养12-16h。

(2)转移菌液至100ml离心管中，4℃下4000rpm离心10min，尽量去除上清。重复此操作一次。

(3)将菌液沉淀重悬于6mlsolutioni中，剧烈震荡，使菌体分散均匀。

(4)加入6mlsolutionii，将离心管温和颠倒数次至混合均匀，将离心管置于冰上5min。

(5)加入5ml预冷的solutioniii，将离心管温和颠倒数次至混合均匀，在冰上放置10min，4℃下10000rpm离心10min。

(6)将上清倾倒进50ml离心管中，加入12ml异丙醇，-20℃放置10min，在4℃下10000rpm离心10min，去尽上清。

(7)将沉淀溶于850ul的te溶液中，然后将溶液转移到1.5mlep管，加入400ul10mol/lnh4ac，颠倒数次混匀，在冰上放置10min，在4℃下10000rpm离心10min。

(8)将上清均分进两个1.5mlep管中(各约620ul)，然后各加入600ul异丙醇混匀，-20℃放置10min，在4℃下12000rpm离心10min，去尽上清。

(9)两个1.5mlep管中各加入100ulte(含40ug/mlrnasea)，溶解沉淀，然后将溶液合并到一个1.5mlep管中，37℃水浴20min以降解rna分子。

(10)加入200ul的15％peg8000+1.6mol/lnacl，颠倒数次混匀，在冰上放置20min，然后在4℃下14000rpm离心15min，去尽上清。

(11)将沉淀完全溶解于200ulte，加入80ul10mol/lnh4ac混匀，然后加入280ul异丙醇，颠倒数次混匀，在冰上放置10min，在4℃下12000rpm离心10min，去尽上清。

(12)加入700ul70％乙醇洗涤沉淀和ep管内壁，吸去70％乙醇，进行短暂离心，然后尽量吸去剩余的乙醇，将离心管开盖室温放置10min，使沉淀表面的乙醇挥发。最后加入300-700ulte溶解沉淀。

将提取的质粒用0.7％的琼脂糖凝胶电泳进行大小验证(见图2，lanem:dl5000marker；lane1:pvax1空载lane2-3:重组质粒pva-sp)。

2、pvasp重组真核表达质粒的分子包装

1)pvasp分子包装得到pvasp的壳聚糖纳米颗粒

壳聚糖对真核表达载体pvasp进行分子包装：以离子交联法(bodmeieretal.,1989)用壳聚糖(chitosan，cs，90％以上脱乙酰度，分子量：100kda，sigama公司，usa，目录号：900342)包裹质粒pvasp，即：将壳聚糖水溶液(ph5.5，5mg/ml)和上述1得到的pvasp溶液(将pvasp、三聚磷酸盐和水混合得到的溶液，其中，pvasp的浓度为0.5mg/ml，三聚磷酸盐的质量百分含量为0.1％)(壳聚糖和pvasp的质量比为20:1)65℃水浴恒温5-10min，然后均匀混合质粒溶液和壳聚糖溶液5-10min，得到pvasp的壳聚糖纳米颗粒样品液，用cnp-vasp来表示。

按照上述方法将壳聚糖对空载pvax1进行分子包装作为对照组，得到pvax1的壳聚糖纳米颗粒。

2)pvasp的壳聚糖纳米颗粒检测

将上述1)得到的pvasp的壳聚糖纳米颗粒样品液于45℃在旋转蒸发仪上浓缩10倍，收集到的浓缩液体积为原体积的1/10，补充0.9％nacl生理盐水轻柔打匀定容至500μg/ml质粒浓度，以备细胞转染和动物实验注射用。

通过0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，包裹的纳米颗粒均被阻滞在点样孔中，未能迁移出样品孔，说明了重组质粒已被壳聚糖分子充分包裹，形成有效的纳米颗粒。

3、纳米颗粒转染hek293细胞及目的基因的检测

当培养板中的hek293贴壁至75％左右时，即可进行细胞转染，每孔加入含4μgpvasp的壳聚糖纳米颗粒的样品液，同时用translipidtransfectionreagent(liperfectamine，北京全式金公司，目录号：ft101)10ul，混合4μgpvasp或pvax1质粒，边滴加边混匀(得到liperfectamine-vasp或liperfectamine-pvax1)；使用前半小时混合滴加完成后放入细胞培养箱中，37℃5％co2孵育，5小时后更换培养基。分别于转染后24h、48h、72h对细胞拍照，并做rt-pcr检测；收集cnp-vasp转染hek293后24h、48h、72h的细胞上清液备用。

hek293细胞转染排版见表1。

rt-pcr检测方法如下：提取转染后hek293细胞总rna，经rt-pcr鉴定(p1：5-gtttaaacttaagcttatggatgcaatg-3；p2：5-aaacgggccctctagactaatggtgatg-3)。

结果如图3所示，lane1：liperfectamine-vasp；lane2：liperfectamine-pvax1；lane3,4,5：vasp–cs；m:dnamarker；可以看出，liperfectamine-vasp和vasp–cs转染的hek293细胞出现特异扩增目的条带，约125bp。而liperfectamine-pvax1rt-pcr不出现特征带。

上述结果表明，无论通过哪种材料包装，pvasp重组质粒在hek293细胞中均能表达目的基因片段相应的mrna。

通过pcr产物与定量分析目的基因表达，发现转染48h表达量最高。

表1.hek293转染排版

4、pvasp对淋巴细胞增殖的影响

1)藏猪淋巴母细胞的制备

无菌条件下用抗凝管(edta-2k抗凝)采取猪前腔静脉外周血5ml，按照淋巴细胞分离液说明书分离藏猪淋巴细胞。将分离到的淋巴细胞用1640完全培养液稀释至细胞终浓度2×10⁶/ml，分至直径为10cm的细胞培养皿中，每皿10ml,最后再加入终浓度为10μg/ml的coa(刀豆球蛋白a,上海恒远生物科技有限公司,cas号：11028-71-0)进行培养刺激，5％co2、37℃细胞培养箱中培养24h。

2)新型抗菌肽融合基因表达产物的生物学活性检测

通过前面的研究，发现转染48小时经translipidtransfectionreagent转染的外源基因的表达量最高，因此淋巴细胞刺激实验采用24、48小时hek293细胞转染表达上清。

其中对照孔cnegative采用未经coa刺激激活的淋巴细胞，cpositive为经coa激活的淋巴细胞，观察淋巴细胞活性。

淋巴细胞刺激实验具体如下：

1)24h时，将培养皿中的细胞收集，2500rpm离心5min收集细胞；

2)用pbs或1640完全培养基清洗细胞2次，每次2500rpm离心5min；

3)用含20mg/mlα-mm的1640培养基洗细胞1次，1500rpm离心15min；

4)用含20mg/mlα-mm的1640培养基调整细胞至约6x10⁶/ml；

96孔板实验孔加入50μl靶细胞(经coa激活的淋巴母细胞)和50μl上述3得到的cnp-vasp转染hek293后24h、48h和72h的细胞上清液。设有rpmi1640完全培养基、磷酸缓冲液pbs、淋巴细胞空白对照、pvax1的壳聚糖纳米颗粒转染hek293后24h、48h和72h的细胞上清液对照，每个样品设2个重复孔，置于细胞培养箱培养5％co2、37℃48h。

5)48h时，取出96孔板，每孔加入cck810μl继续细胞培养箱培养5％co2、37℃2h。

6)取出96孔板，用bio-reader3550检测每孔od450。

结果如图4(vasp即为pvasp组，为cnp-vasp转染hek293后24h、48h和72h的细胞上清液；pvax1组为pvax1的壳聚糖纳米颗粒转染hek293后24h、48h和72h的细胞上清液)，可以看出，pvasp组上清较对照pvax1组增殖更明显，这说明融合蛋白vasp用两种材料包裹后均能表达具有生物学活性，能刺激猪淋巴母细胞增殖，而且转染48h其表达产物可能最多，显著刺激淋巴细胞增殖(p<0.05)。

5、pvasp表达上清抑菌活性及最小抑菌浓度mic相对法的检测

测定猪抗菌肽融合蛋白对大肠杆菌标准菌(g^-)、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌标准菌(g⁺)(以下简称为s-g⁺)、链球菌抑菌情况，具体方法如下：

首先将4种细菌菌株接种活化并培养其处于指数生长期(od600大约为0.5)，然后用lb培养液稀释到od600约0.005，将稀释后的菌液接种到96孔细胞培养板上，100μl/每孔，每个96孔细胞培养板一种细菌。

针对每个含有细菌的96孔细胞培养板按照以下方式处理：将100μlcnp-vasp转染hek293后48h的细胞上清液加入实验孔中轻轻混匀，每个样品设3个重复孔。

将96孔细胞培养板置37℃培养箱孵育16h后，分别用酶标仪(bio-reader680)检测每孔od600值。

s-g^-和s-g⁺的四种抗生素梯度均如表2所示，

表2、标准菌株抗生素梯度

注：表2中，“——”表示不含卡那霉素。

通过以下方法检测其抑菌活性：首先将4种细菌菌株接种活化并培养其处于指数生长期(od600大约为0.5)，然后用lb培养液稀释到od600约0.005，将稀释后的菌液接种到96孔细胞培养板上，100μl/每孔，每个96孔细胞培养板一种细菌。

针对每个含有细菌的96孔细胞培养板按照以下方式处理：将100μl样品液加入实验孔中轻轻混匀，每个样品设3个重复孔；

其中样品液为实施例1的步骤3获得的cnp-vasp转染hek293细胞后48h的培养上清液(l-vapa)或pvax1的壳聚糖纳米颗粒转染hek293细胞后48h的培养上清液(vax1)。

每种菌均设4种抗生素梯度作为阳性对照(抗生素和lb培养液)；每种菌均设只加lb培养液作为阴性对照，并设不含菌的lb培养液作为空白对照。

将96孔细胞培养板置37℃培养箱孵育16h后，分别用酶标仪(bio-reader3350)检测每孔od600值，测定融合抗菌肽的抗菌活性。

结果如图5，可以看出，与vax1相比，l-vasp的不同稀释液对金黄葡萄球菌和链球菌均具有明显的抑制作用(p<0.05)；对g-菌的抑制作用也较显著(p<0.05)，48h上清液稀释32倍时仍有显著的抑菌活性，约接近于50μg/ml氨苄抗生素，或100μg/ml卡那霉素。上述结果表明，新型融合抗菌肽vasp有显著的抑菌活性，为后续实验奠定基础，挑选金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为后续动物攻毒试验菌株。

实施例2、融合基因重组真核表达质粒在小鼠体内生物学活性研究

1、内毒素的检测

用“凝胶法”检测质粒的内毒素含量，方法参考《鲎试剂说明书》，具体方法如下：

(1)阳性对照样品制备：取内毒素标准品(上海哈灵生物科技有限公司，150600)，以检查用水配制浓度为2倍灵敏度λ＝0.25eu/ml的溶液备用；

(2)阴性对照：检查用水；

(3)检测样品：根据检测样品内毒素限值得要求计算器有效稀释倍数(mvd＝cl/λ)，将样品稀释备用；

(4)取鲎试剂，折断安瓿颈并标记，其中1支作阳性对照管，1支作阴性对照管，2支作检品管，1支作检品阳性对照管，共5支；

(5)按照要求分别在阴性对照管、阳性对照管和检品管中加入0.2ml检查用水、0.1ml检查用水+0.1ml浓度为2倍λ的内毒素溶液、以及0.1ml检查用水+0.1ml检测样品(实施例1获得的pvasp的壳聚糖纳米颗粒样品液或pvax1的壳聚糖纳米颗粒样品液)，轻轻摇匀待检；

(6)将上一步待检样垂直放入恒温器中，37℃孵育60分钟，读取结果。

结果未见样品管有凝胶形成，表明真核质粒pvasp和pvax1的壳聚糖纳米颗粒样品液没有含内毒素。

2、实验小鼠分组及免疫

1)分组

20只28日龄昆明小雌鼠，体重约25-30g,随机分组2组，每组10只小鼠，分为实验组和对照组。

2)免疫

实验组vasp:为将实施例1的得到的cnp-vasp腹腔注射小鼠，注射剂量为每只小鼠100μgpvasp的壳聚糖纳米颗粒。

对照组pvax1:为将实施例1得到的pvax1的壳聚糖纳米颗粒样品液腹腔注射小鼠，注射剂量为每只小鼠100μgpvax1的壳聚糖纳米颗粒。

3、小鼠接种及耐药菌攻毒

在上述2得到的实验组vasp和对照组pvax1小鼠免疫接种28天后，选择高耐药金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，接种lb培养基后，过夜培养，检测od值在1.0左右，直接采用0.2ml原菌液，注射小鼠腹腔。对每组中10只小鼠，各分5只注射不同耐药菌，观察小鼠发病率和存活率。

分别在灌胃前、灌胃第7天、灌胃第14天、灌胃第21天和灌胃第28天采取每只小鼠尾静脉血，进行如下免疫学检测：30μl全血与30μl生理盐水混匀后在血球计数仪做血常规分析；50μl全血做流式细胞测定；小鼠免疫前及免疫后3周，攻毒后一周自尾静脉采血，分离血清，酶联免疫吸附检测技术(elisa)检测血清中igg、igg1和igg2含量变化。免疫动物前后分别每周固定时间称量小鼠的体重，并做好记录，从平均体重变化可以大致看出vap对小鼠生长的影响；100μl全血提取rna后实时定量免疫相关基因，定量相关引物见表3。

表3定量引物

每组小鼠外周血免疫细胞变化如图6所示，免疫后0d-28d,实验组vasp和对照组pvax1小鼠的白细胞数量明显增加(p<0.05)。cs壳聚糖包裹pvasp纳米颗粒实验组小鼠外周血白细胞数量均显著高于对照组，说明cs包裹pvasp纳米颗粒能有效刺激免疫细胞增殖，数量提高。

图7显示实验组小鼠的cd4+t和cd8+t细胞数量14天后较对照组显著增多(p<0.05)，且cd4/cd8比例升高。实验前小鼠普遍cd8+t比例高，接种后cd4+t数量和比值不断上升，显示小鼠向细胞免疫明显应答明显加强。

图8表示接种后实验组小鼠血清中igg、igg1和igg2水平分别在21-28天、7天及14-28天较对照小鼠明显上升(p<0.05)，说明小鼠的体液免疫也明显加强。

图9表明实验组小鼠体重在接种后体重均较对照小鼠增加，后期的差异达到显著水平(p＜0.05)；说明接种pvasp有效地促进了小鼠的生长增重。

图10所示，实验组小鼠tlr1、tlr4、tlr6和tlr9基因的表达水平在接种后21-28天和7-28天均较对照小鼠显著提高(p＜0.05)；表明免疫接种小鼠能更快速高效的识别病原微生物，固有免疫能力得到提升。

图11所示，il-1主要生物学功能在局部低浓度进行免疫调节，协同刺激apc和t细胞活化，促进b细胞增殖和分泌抗体。实验结果显示pvasp接种能够显著的提升小鼠il-1分泌水平(p<0.05)。同样，实验小鼠的il-2、il-4、il-7和il-15转录水平也不同程度的上升，说明新型融合抗菌肽vasp基因体内表达能有效促进多种细胞因子的表达，加强动物免疫细胞的活化与免疫功能调节。

图12所示，实验组小鼠血液ifn-γ转录表达14-28天显著高于对照组(p<0.05)，在21天时ifn-γ达最高值。ifn-γ的上升说明新型融合抗菌肽vasp基因促进th1型免疫应答。

图13所示，攻毒实验采用两株高耐药细菌：g+菌：金黄色葡萄球菌，g-菌：大肠杆菌进行攻毒后，腹腔注射后间隔6小时、12小时、24小时到5天观察存活率和病变、死亡情况。结果显示新型融合抗菌肽vasp基因能够有效的保护接种小鼠，接种实验组对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌攻毒感染的抵抗力显著加强，实验组死亡率0/5(g+)-0/5(g-)，而空白对照组死亡4/5。

序列表

<110>深圳市前海金卓生物技术有限公司四川大学

<120>新型猪源融合抗菌肽vasp生物制剂的制备及应用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>166

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly

151015

alavalphevalserproserglyproprothrglyserargserarg

202530

argargproargproprotyrleuproargproargproproprophe

354045

pheproproargleuproproargileproproglypheproproarg

505560

pheproproargpheproglylysargglyserglyaspaspaspasp

65707580

lysvalargargpheprotrptrptrppropheleuargargglyser

859095

glyaspaspaspasplysargileileaspleuleutrpargvalarg

100105110

argproglnlysprolysphevalthrvaltrpvalargglysergly

115120125

aspaspaspasplysargglyglyargleucystyrcysargargarg

130135140

phecysvalcysvalglyargglyglyserglyaspaspaspasplys

145150155160

hishishishishishis

165

<210>2

<211>498

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtt60

tcgcccagcggtacccctaccggatccagatctaggagacgtccccgacccccatatttg120

ccaaggccaaggccacctccgtttttcccaccaaggttgccaccacgtatcccaccaggg180

ttcccaccaaggttcccaccacggttccccggaaaacggggatccggagatgacgatgac240

aaggtacgacgtttcccatggtggtggcctttcttgcgacgtggatccggagatgacgat300

gacaagaggattattgacttgttgtggagagtacgtcggccacagaaacccaaatttgtg360

actgtatgggtcagaggatccggagatgacgatgacaagaggggaggtcgcctgtgctat420

tgtaggcgtaggttctgcgtctgtgtcggacgaggaggatccggagatgacgatgacaag480

catcatcaccatcaccat498