一种用于检测丙二酰辅酶A的分子探针的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种用于检测丙二酰辅酶a的分子探针。
背景技术：
丙二酰辅酶a(malonyl-coa)是脂肪酸合成代谢过程中重要的中间代谢产物，也是脂肪酸氧化分解过程中的调节分子。细胞中malonyl-coa的增加促使其与线粒体表面脂肪酸转运相关蛋白cpt1结合抑制脂肪酸向线粒体的转运，从而减少脂肪酸的氧化分解。最近的研究发现malonyl-coa还是蛋白质翻译后修饰丙二酰化(malonylation)反应过程中的基团供体。在一定条件下malonyl-coa可自发的使蛋白质发生malonylation修饰。malonylation修饰的功能目前尚在研究中。目前，malonyl-coa的检测方法主要有三类。第一类，基于脂肪酸合成反应中代谢物的转换的方法间接检测malonyl-coa的量[guynn,r.w.,d.veloso,andr.l.veech,theconcentrationofmalonyl-coenzymeaandthecontroloffattyacidsynthesisinvivo.jbiolchem,1972.247(22):p.7325-31.mcgarry,j.d.,m.j.stark,andd.w.foster,hepaticmalonyl-coalevelsoffed,fastedanddiabeticratsasmeasuredusingasimpleradioisotopicassay.jbiolchem,1978.253(22):p.8291-3.]。用纯化的乙酰辅酶a羧化酶(acc1)和脂肪酸合酶(fasn)体外构建脂肪酸合成的反应体系。将待测样本，一般为组织和细胞的提取液加入此体系中。通过光谱观察nadph的减少，或者观察同位素标记的(c14)acetyl-coa转化为脂肪酸的多少来推算样本中malonyl-coa的量。第二类，利用液相或气相色谱直接检测malonyl-coa的量[hosokawa,y.,etal.,determinationofshort-chainacyl-coenzymeaestersbyhigh-performanceliquidchromatography.analbiochem,1986.153(1):p.45-9.king,m.t.,p.d.reiss,andn.w.cornell,determinationofshort-chaincoenzymeacompoundsbyreversed-phasehigh-performanceliquidchromatography.methodsenzymol,1988.166:p.70-9.reszko,a.e.,etal.,assayoftheconcentrationand13c-isotopicenrichmentofmalonyl-coenzymeabygaschromatography-massspectrometry.analbiochem,2001.298(1):p.69-75.]。首先利用强酸从组织或细胞中粗提取malonyl-coa，将提取物利用highperformanceliquidchromatography(hplc)高效液相色谱直接检测，根据标准品的量，利用色谱峰的高度计算出样本中malonyl-coa的量。另外还可以将提取物中的malonyl-coa通过化学方法转变成丙二酸及其衍生物，再利用gaschromatography-massspectrometry(gc-ms)气相色谱联合质谱实现检测。以上两类方法共同存在的问题是必须利用组织提取物才能实现检测。且malonyl-coa本身就是不稳定的高能量分子，很容易在体外提取等操作中降解。且这两类方法只能进行体外检测，无法检测细胞内的malonyl-coa的含量。第三类，利用芽孢杆菌中malonyl-coa结合蛋白fapr配合荧光蛋白报告基因实现细胞内malonyl-coa的检测[ellis,j.m.andm.j.wolfgang,ageneticallyencodedmetabolitesensorformalonyl-coa.chembiol,2012.19(10):p.1333-9.]。fapr是细菌中一个转录因子，可以感应细胞内malonyl-coa的变化，从而实现脂肪酸代谢相关基因的调控。利用这个特征，将fapr结合的dna启动子序列下游接上荧光蛋白或荧光素酶等报告基因。同时将fapr蛋白编码的质粒和带有fapr启动子序列的报告基因同时转入细胞，即可实现对细胞内malonyl-coa的检测。这种方法的缺点是：1、由于涉及转录过程，受报告基因转录效率的影响。2、只能检测整个细胞内的malonyl-coa的量，无法区分各个细胞器中malonyl-coa的量。3、由于是细胞体系下反应，无法检测细胞外malonyl-coa，例如细胞间质或血液等无细胞区域的检测。技术实现要素：为了有效的解决上述技术问题，本发明旨在提供一种既可以对体外样本提取物中malonyl-coa进行检测，又可以对活细胞内malonyl-coa进行检测和动态观察的新的用于检测丙二酰辅酶a(malonyl-coa)的分子探针。第一方面，本发明要求保护一种融合蛋白(即为用于检测丙二酰辅酶a的分子探针)。本发明所提供的融合蛋白，其自n端到c端依次包含nanoluc荧光素酶大亚基、fapr△43蛋白和nanoluc荧光素酶小亚基。其中，所述fapr△43蛋白为fapr蛋白删除n端43个氨基酸后的截短体。进一步地，所述融合蛋白中，所述nanoluc荧光素酶大亚基和所述fapr△43蛋白之间通过连接肽i相连；所述fapr△43蛋白和所述nanoluc荧光素酶小亚基之间通过连接肽ii相连。更进一步地，所述nanoluc荧光素酶大亚基可为如下(a1)-(a3)任一所示蛋白质：(a1)氨基酸序列为seqidno.1的第1-159位所示的蛋白质；(a2)将seqidno.1的第1-159位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。所述fapr△43蛋白可为如下(b1)-(b3)任一所示蛋白质：(b1)氨基酸序列为seqidno.1的第175-318位所示的蛋白质；(b2)将seqidno.1的第175-318位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(b3)与(b1)-(b2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。所述nanoluc荧光素酶小亚基可为如下(c1)-(c3)任一所示蛋白质：(c1)氨基酸序列为seqidno.1的第332-342位所示的蛋白质；(c2)将seqidno.1的第332-342位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(c3)与(c1)-(c2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。所述连接肽i可为如下(d1)-(d3)任一所示多肽：(d1)氨基酸序列为seqidno.1的第160-174位所示的多肽；(d2)将seqidno.1的第160-174位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽；(d3)与(d1)-(d2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的多肽。所述连接肽ii可为如下(e1)-(e3)任一所示多肽：(e1)氨基酸序列为seqidno.1的第319-331位所示的多肽；(e2)将seqidno.1的第319-331位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽；(e3)与(e1)-(e2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的多肽。在本发明具体实施方式中，所述融合蛋白为自n端到c端依次由所述nanoluc荧光素酶大亚基、所述连接肽i、所述fapr△43蛋白、所述连接肽ii和所述nanoluc荧光素酶小亚基融合而成的融合蛋白。更加具体地，所述融合蛋白可为如下(f1)-(f4)任一所示蛋白质：(f1)氨基酸序列为seqidno.1所示的蛋白质；(f2)将seqidno.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(f3)与(f1)-(f2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(f4)在(f1)-(f3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。为了便于所述融合蛋白的纯化，可在所述融合蛋白的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表：标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl第二方面，本发明要求保护编码所述融合蛋白的核酸分子。其中，所述核酸分子可为dna，也可为rna，当然也可以为其他可能存在的核酸形式，只要能编码出所述融合蛋白即可。进一步地，所述核酸分子为编码所述融合蛋白的融合基因。所述融合基因中编码所述nanoluc荧光素酶大亚基的基因可为如下(a1)-(a3)任一所示dna分子：(a1)seqidno.2的第1-477位所示的dna分子；(a2)在严格条件下与(a1)限定的dna分子杂交且编码所述nanoluc荧光素酶大亚基的dna分子；(a3)与(a1)或(a2)限定的dna序列具有95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述nanoluc荧光素酶大亚基的dna分子。所述融合基因中编码所述fbpr△43蛋白的基因可为如下(b1)-(b3)任一所示dna分子：(b1)seqidno.2的第523-954位所示的dna分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码所述fbpr△43蛋白的dna分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的dna序列具有95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述fbpr△43蛋白的dna分子。所述融合基因中编码所述nanoluc荧光素酶小亚基的基因可为如下(c1)-(c3)任一所示dna分子：(c1)seqidno.2的第994-1026位所示的dna分子；(c2)在严格条件下与(c1)限定的dna分子杂交且编码所述nanoluc荧光素酶小亚基的dna分子；(c3)与(c1)或(c2)限定的dna序列具有95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述nanoluc荧光素酶小亚基的dna分子。所述融合基因中编码所述连接肽i的基因可为如下(d1)-(d3)任一所示dna分子：(d1)seqidno.2的第478-522位所示的dna分子；(d2)在严格条件下与(d1)限定的dna分子杂交且编码所述连接肽i的dna分子；(d3)与(d1)或(d2)限定的dna序列具有95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述连接肽i的dna分子。所述融合基因中编码所述连接肽ii的基因可为如下(e1)-(e3)任一所示dna分子：(e1)seqidno.2的第955-993位所示的dna分子；(e2)在严格条件下与(e1)限定的dna分子杂交且编码所述连接肽ii的dna分子；(e3)与(e1)或(e2)限定的dna序列具有95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述连接肽ii的dna分子。更进一步地，所述融合基因可为如下(f1)-(f3)任一所示dna分子：(f1)seqidno.2所示的dna分子；(f2)在严格条件下与(f1)限定的dna分子杂交且编码所述融合蛋白的dna分子；(f3)与(f1)或(f2)限定的dna序列具有95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述融合蛋白的dna分子。上述严格条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。第三方面，本发明要求保护含有前文所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。其中，所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。在本发明的具体实施方式中，所述重组载体具体为将所述融合基因插入到gv141载体的酶切位点ecori和kpni之间后得到的重组质粒。所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。第四方面，本发明要求保护一种用于检测丙二酰辅酶a的试剂盒。本发明所提供的用于检测丙二酰辅酶a的试剂盒中含有前文所述的融合蛋白和nanoluc荧光素酶的底物(如furimazine)。第五方面，本发明要求保护如下任一应用：(a)前文所述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备前文所述的融合蛋白或所述试剂盒中的应用；(b)前文所述的融合蛋白或所述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或试剂盒在检测丙二酰辅酶a中的应用。在所述(b)中，所述检测既可为为活细胞内的检测，也可为胞外(如体液)的检测，还可为体外的检测。进一步地，所述活细胞内的检测可为活细胞内整体的检测，也可为活细胞不同细胞器部位的检测。另外，所述活细胞内的检测可为比较不同活细胞内丙二酰辅酶a含量多少，也可为活细胞内对丙二酰辅酶a的动态变化的检测。第六方面，本发明要求保护一种检测丙二酰辅酶a的方法。本发明所提供的检测丙二酰辅酶a的方法，依据检测样本及检测目的的不同，可分为如下几种：(i)一种对胞外或体外待测样本中丙二酰辅酶a的有无和/或含量进行检测的方法，可包括如下步骤：向待测样本中加入前文所述的融合蛋白和nanoluc荧光素酶的底物(如furimazine)进行反应，然后观察反应体系中荧光的有无以及强弱，所述反应体系中荧光的有无以及强弱即能反映所述待测样本中是否含有丙二酰辅酶a以及丙二酰辅酶a含量的多少。进一步地，所述“向待测样本中加入前文所述的融合蛋白和nanoluc荧光素酶的底物(如furimazine)进行反应”具体可为：先向所述待测样本中加入所述融合蛋白至其终浓度为0.1μg/ml，室温孵育10min后加入所述nanoluc荧光素酶的底物(如furimazine)，再室温孵育10min。进一步地，所述反应体系中荧光的有无以及强弱即能反映所述待测样本中是否含有丙二酰辅酶a以及丙二酰辅酶a含量的多少，具体是通过如下实现的：相同检测条件下，采用丙二酰辅酶a标准品替代所述待测样本，丙二酰辅酶a标准品设置系列浓度梯度(如浓度从0到2000μm递增)，然后根据丙二酰辅酶a标准品中荧光值建立丙二酰辅酶a浓度-荧光值标准曲线，将所述待测样本的荧光值带入所述标准曲线，从而计算出所述待测样本中丙二酰辅酶a的具体含量。(ii)一种比较不同活细胞内丙二酰辅酶a的含量多少的方法，可包括如下步骤：使待测的不同靶细胞分别表达前文所述的融合蛋白，接着向所述靶细胞的培养体系中直接加入nanoluc荧光素酶的底物(如furimazine，可自由透过细胞膜，其终浓度可控制为1μm/l)进行反应(室温孵育10min)，然后观察反应体系的荧光强度，荧光强度高的反应体系中所述靶细胞中丙二酰辅酶a的含量相对较高。(iii)一种对活细胞不同细胞器部位的丙二酰辅酶a的动态变化进行检测的方法，可包括如下步骤：使前文所述的融合蛋白在待测细胞的靶细胞器部位定位表达，接着向所述靶细胞的培养体系中直接加入nanoluc荧光素酶的底物(如furimazine，可自由透过细胞膜)进行反应(室温孵育10分钟)，然后观察反应体系中荧光强度及其动态变化情况，所述反应体系的荧光强度及其动态变化情况即能反映所述待测细胞的靶细胞器部位处丙二酰辅酶a的动态变化情况(动态变化是指不同条件下malonyl-coa含量的相对含量)。本发明所所提供的malonyl-coa分子探针(即前文所述的融合蛋白)是一个单一蛋白(即前文所述的融合蛋白)，既可以对体外样本提取物中malonyl-coa进行检测，又可以对活细胞内malonyl-coa进行检测和动态观察。更重要的可以实现对活细胞不同细胞器部位malonyl-coa的检测，这是之前所有malonyl-coa检测方法都无法实现的。与之前的色谱和质谱方法相比，在体外检测时，此融合蛋白更加简单。只需将纯化的蛋白加入样本即可。此纯化的融合蛋白有潜力做成商业化产品，用于不同样本提取物，体液等体外实验中malonyl-coa的含量测定。与之前的基于报告基因表达的方法相比，此融合蛋白基于本身结构变化实现对malonyl-coa的检测，不受细胞内转录调控的影响。理论上可以定位到细胞内各个区域，甚至分泌到细胞间隙，体液等部位实现局部的malonyl-coa检测。附图说明图1为本发明中用于检测丙二酰辅酶a的分子探针的结构示意图。图2为根据已知的蛋白结构nanoluc(pdb：5ibo)、fapr(4a0z)推导出的融合蛋白的结构及检测malonyl-coa的机制图。图3为native-page及westernblot显示预期的二聚体存在形式。图4为直接在native-page上加nanoluc的荧光底物furimazine可以观察到一定的荧光素酶活性，且位置正好是探针蛋白二聚体所在位置。图5为证明分子探针对malonyl-coa的反应性实验结果。图6为证明分子探针对malonyl-coa的反应的特异性实验结果。图中，mal表示malonyl-coa(丙二酰辅酶a)；succ表示succinyl-coa(琥珀酰辅酶a)；glu表示glutaryl-coa(戊二酰辅酶a)；ace表示acetyl-coa(乙酰辅酶a)；pro表示propionyl-coa(丙酰辅酶a)；but表示butyryl-coa(丁酰辅酶a)。图7为随着细胞内mcd表达量的增加，即细胞内malonyl-coa含量的减少，融合蛋白nanoluc-fapr△43产生的荧光信号逐步减弱。其中，上图为荧光信号柱形图；下图为westernblot检测的mcd和nanoluc-fapr△43的表达量。图8为随着orlistat分子浓度的增大，融合蛋白nanoluc-fapr△43产生的荧光信号增强。其中，上图为荧光信号柱形图；下图为westernblot检测的nanoluc-fapr△43的表达量。图9为通过在融合蛋白nanoluc-fapr△43表达质粒上添加不同的细胞器定位序列实现了融合蛋白在细胞质、细胞核、线粒体、内质网和高尔基体等亚细胞器的定位。其中，a为融合蛋白定位在细胞质中时，在不同的葡萄糖浓度下样本中荧光值相对强弱；b为融合蛋白定位在细胞质中时，orlist药物处理后样本中荧光值相对强弱；c为融合蛋白定位在细胞核中时，在不同的葡萄糖浓度下样本中荧光值相对强弱；d为融合蛋白定位在细胞核中时，orlist药物处理后样本中荧光值相对强弱；e为融合蛋白定位在线粒体中时，在不同的葡萄糖浓度下样本中荧光值相对强弱；f为融合蛋白定位在线粒体中时，orlist药物处理后样本中荧光值相对强弱；g为融合蛋白定位在内质网中时，在不同的葡萄糖浓度下样本中荧光值相对强弱；h为融合蛋白定位在内质网中时，orlist药物处理后样本中荧光值相对强弱；i为融合蛋白定位在高尔基中时，在不同的葡萄糖浓度下样本中荧光值相对强弱；j为融合蛋白定位在高尔基中时，orlist药物处理后样本中荧光值相对强弱；k为免疫荧光显示带flag标签的融合蛋白细胞质定位；l为dapi核染色；m为k和l合并后的图；n为免疫荧光显示带flag标签的融合蛋白细胞核定位；o为dapi核染色；p为n和o合并后的图；q为免疫荧光显示带flag标签的融合蛋白线粒体定位；r为免疫荧光显示抗线粒体标签蛋白anti-coxⅳ定位；s为q和r合并后的图；t为免疫荧光显示带flag标签的融合蛋白内质网定位；u为免疫荧光显示抗内质网标签蛋白anti-calunexin定位；v为t和u合并后的图；w为免疫荧光显示带flag标签的融合蛋白高尔基体定位；x为免疫荧光显示抗高尔基体标签蛋白anti-golga2定位；y为w和x合并后的图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、用于检测丙二酰辅酶a的分子探针的制备及鉴定一、用于检测丙二酰辅酶a的分子探针的制备本发明中用于检测丙二酰辅酶a的分子探针具体为结构如图1所示的融合蛋白。该融合蛋白自n端到c端依次为nanoluc荧光素酶大亚基(lg)、连接肽i(linker1)、fapr△43蛋白(fapr△43)、连接肽ii(linker2)和nanoluc荧光素酶小亚基(sm)。该融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，其中第1-159位为nanoluc荧光素酶大亚基(lg)，第160-174位为连接肽i(linker1)，第175-318位为fapr△43蛋白(fapr△43)，第319-331位为连接肽ii(linker2)，第332-342位为nanoluc荧光素酶小亚基(sm)。将该融合蛋白命名为nanoluc-fapr△43。获得融合蛋白nanoluc-fapr△43的具体步骤如下：1、获得已知的nanoluc荧光素酶的序列(genbank：ky563063.1)和枯草芽孢杆菌的fapr的蛋白序列(genbank：np_389470.1)。2、将枯草芽孢杆菌fapr的蛋白序列进行密码子优化，使其密码子适合在哺乳动物细胞中翻译。3、将nanoluc荧光素酶的大小亚基dna序列与密码子优化过的fapr△43序列通过两个linker序列连接得到一个完整的序列。直接合成此dna序列(seqidno.2)并在两端分别添加酶切位点ecori和kpni的识别序列。其中seqidno.2的第1-477位为nanoluc荧光素酶大亚基(lg)的编码序列，第478-522位为连接肽i(linker1)的编码序列，第523-954位为fapr△43蛋白(fapr△43)的编码序列，第955-993位为连接肽ii(linker2)的编码序列，第994-1026位为nanoluc荧光素酶小亚基(sm)的编码序列。4、将合成的两端分别添加酶切位点ecori和kpni的识别序列的seqidno.2通过酶切位点ecori和kpni连接到带有flag标签的真核表达载体gv141(上海吉凯基因化学技术有限公司产品，记载于“田磊,潘静坤,施明等.htnfα/cho基因工程细胞的构建及其分泌蛋白功能的检定.局部手术学杂质,2016,25(4)”一文)上，得到重组表达载体gv141-nanoluc-fapr△43，并经测序验证正确。5、将重组表达载体gv141-nanoluc-fapr△43分别转染哺乳动物细胞系293t和hela，转染后24小时，用细胞裂解液(配方：50mmtrishcl，ph7.4；150mmnacl；1mmedta；1％tritonx-100，％表示体积百分含量)裂解细胞20分钟。12,000g高速离心10分钟。离心后的上清与40微升抗flag抗体偶联的琼脂糖珠子(sigma-aldrich)混合，4℃旋转孵育4小时。珠子用清洗液(配方：50mmtrishcl，ph7.4；150mmnacl)洗脱两遍后，再用洗脱液(配方：50mmtrishcl，ph7.4；150mmnacl；150ng/μl3×flag肽段(f4799sigma-aldrich))4℃旋转洗脱30分钟。12,000g高速离心2分钟，上清即为纯化后的融合蛋白nanoluc-fapr△43。二、融合蛋白nanoluc-fapr△43的鉴定首先，根据已知的蛋白结构nanoluc荧光素酶(pdb：5ibo)、fapr蛋白(4a0z)推导出的融合蛋白的结构及检测malonyl-coa的机制图，如图2所示。融合蛋白nanoluc-fapr△43可能以二聚体形式存在。接着，采用native-page(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)及westernblot对步骤一获得的纯化后融合蛋白nanoluc-fapr△43进行鉴定，采用抗flag标签的抗体进行检测。结果如图3所示，图3中显示出了融合蛋白nanoluc-fapr△43预期的二聚体存在形式，单体大小大概为40kda，二聚体大概80kda，与预期大小基本一致。然后，直接在native-page上加nanoluc荧光素酶的荧光底物furimazine，结果显示可以观察到一定的荧光素酶活性(图4)，且位置正好是融合蛋白二聚体所在位置。实施例2、用实施例1制备的分子探针检测malonyl-coa一、体外实验1、证明分子探针对malonyl-coa的反应性反应在96孔酶标版中进行，总反应体系100微升。反应分8组，每组重复5孔。先向每孔中加入实施例1制备的纯化后融合蛋白nanoluc-fapr△43，使其终浓度为0.1μg/ml。后加入不同浓度的malonyl-coa，每组的终浓度分别为0，0.1，1，10，50，250，1250和6250μm/l。室温孵育10分钟后加入nanoluc的底物furimazine其终浓度为1μm/l。室温10分钟后利用多功能酶标仪测定每个孔的荧光值。结果显示：观察到随着malonyl-coa浓度的变化，融合蛋白nanoluc-fapr△43的荧光强度增强(图5)。将每组的荧光强度值对malonyl-coa的浓度进行非线性曲线回归计算得到该反应的km值为192.5μm，最大反应速率vmax为2076μm。2、证明分子探针对malonyl-coa的反应的特异性向实施例1制备的纯化后融合蛋白nanoluc-fapr△43中加入与malonyl-coa分子类似的其他酰基coa(acyl-coa，具体见图6)。具体反应条件与步骤1相比，差别仅在于将其中的malonyl-coa替换为等量的其他酰基coa。结果显示：观察到融合蛋白nanoluc-fapr△43只对malonyl-coa有反应。如图6所示。二、细胞实验1、向在96孔细胞培养板中培养的hela细胞中共转染融合蛋白nanoluc-fapr△43的表达质粒(即实施例1构建的重组表达载体gv141-nanoluc-fapr△43)(100ng)和不同剂量(0、10、50、100ng)的mcd蛋白的表达质粒gv141-mcd(在上海吉凯基因化学技术有限公司产品gv141载体基础上改造而来，具体为：设计针对小鼠mcd基因cdna的引物，引物序列为正向：5-tccgctcgagatgcgaggcctcgggccagg-3反向：5-atcggaattcgagtttgctgttgttctgg-3，利用pcr法扩增小鼠cdna文库后酶切连接到gv141空载的酶切位点xhoi和ecori之间后获得)(mcd蛋白为malonyl-coadecarboxylase，可有效减少细胞中malonyl-coa的量)。转染后24小时，去除细胞培养液，每孔加入100微升pbs磷酸盐缓冲液，后加入nanoluc的底物furimazine，使其终浓度为1μm/l，加入后室温孵育10分钟后，直接在多功能酶标仪中检测荧光强度。每组实验重复3次。结果显示：观察到随着mcd表达量的增加，即细胞内malonyl-coa含量的减少，融合蛋白nanoluc-fapr△43产生的荧光信号逐步减弱。如图7所示。2、在hela细胞中转染融合蛋白nanoluc-fapr△43的表达质粒(即实施例1构建的重组表达载体gv141-nanoluc-fapr△43)(96孔板中每孔100ng)后，6小时后用不同剂量(0、15、30、45μm，在反应体系中的终浓度)orlistat分子处理，将orlistat储存液直接加入细胞培养基中，使其达到相应的终浓度(orlistat为脂肪酸合酶的抑制剂，可有效增加细胞内malonyl-coa的含量)。加入orlistat后18小时，去除细胞培养液，每孔加入100微升pbs磷酸盐缓冲液，后加入nanoluc的底物furimazine，使其终浓度为1μm/l，加入后室温孵育10分钟后，直接在多功能酶标仪中检测荧光强度。每组实验重复3次。结果显示：观察到随着orlistat分子浓度的增大，融合蛋白nanoluc-fapr△43产生的荧光信号增强。如图8所示。3、细胞核定位表达质粒gv141-nanoluc-fapr△43-nuc的构建。以gv141-nanoluc-fapr△43质粒为模板，在正向引物合成时加上细胞核定位的核苷酸序列，利用pcr方法克隆出nanoluc-fapr△43-nuc表达序列并以ecori和kpni为酶切位点克隆入gv141载体。克隆所用引物为nucf：tgcgaattcatggtcttcacactcgaag；nucr：ttggggtaccgagtccagcttcacgcgcttggcggcggggagaatctcctcgaacag。细胞核定位序列来自细胞核蛋白c-myc定位序列具体如下：vgrnsaiaagvcgalfigyciyfdrkrrs。线粒体定位表达质粒gv141-nanoluc-fapr△43-mito的构建。以gv141-nanoluc-fapr△43质粒为模板，在正向引物合成时加上线粒体定位的核苷酸序列，利用pcr方法克隆出nanoluc-fapr△43-mito表达序列并以ecori和kpni为酶切位点克隆入gv141载体。克隆所用引物为mitof：tgcgaattcatggtgggccgcaactccgccatcgccgccggcgtgtgcggcgccctgttcatcggctactgcatctacttcgaccgcaagcgccgctccgtcttcacactcgaag；mitor：ttggggtaccgagagaatctcctcgaacag。线粒体定位序列来自线粒体蛋白tom20定位序列vgrnsaiaagvcgalfigyciyfdrkrrs。内质网定位表达质粒gv141-nanoluc-fapr△43-er的构建。以gv141-nanoluc-fapr△43质粒为模板，在正向引物合成时加上内质网定位的核苷酸序列，利用pcr方法克隆出nanoluc-fapr△43-er表达序列并以ecori和kpni为酶切位点克隆入gv141载体。克隆所用引物为erf：tgcgaattcatgaagctgtccctggtggccgccatgctgctgctgctgtccgccgcccgcgccgtcttcacactcgaag；err：ttggggtaccgagagaatctcctcgaacag。内质网定位序列来自内质网蛋白grp78定位序列klslvaamllllsaara。高尔基体定位表达质粒gv141-nanoluc-fapr△43-golgi的构建。以gv141-nanoluc-fapr△43质粒为模板，在正向引物合成时加上高尔基体定位的核苷酸序列，利用pcr方法克隆出nanoluc-fapr△43-golgi表达序列并以ecori和kpni为酶切位点克隆入gv141载体。克隆所用引物为golgif：gcgaattcatggtgggccgcaactccgccatcgccgccggcgtgtgcggcgccctgttcatcggctactgcatctacttcgactcctcctcctcctccgaccccaacttcaaggtcttcacactcgaag；golgir：ttggggtaccgagagaatctcctcgaacag。高尔基体定位序列来自序列vgrnsaiaagvcgalfigyciyfdsssssdpnfk。细胞质定位质粒gv141-nanoluc-fapr△43与以上4种细胞器定位质粒分别转染接种在96孔培养板和共聚焦小皿中的cos7细胞。在共聚焦小皿中，转染24小时后，进行免疫荧光实验。基本步骤为：去除培养基后用4％的甲醛室温固定20分钟；pbs洗2次，每次5分钟；0.2％tritonx-100透10分钟；pbs洗2次，每次5分钟；5％bsa室温封闭30分钟；加一抗(用1％bsa稀释)(小鼠抗flag单抗；兔抗coxⅳ多抗，兔抗calnexin多抗，兔抗golga2多抗均为proteintech公司产品)，4℃过夜；pbs洗3次，每次5分钟；加二抗(荧光标记的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗多克隆抗体为中山金桥公司产品，二抗用1％bsa稀释)室温60分钟，闭光；pbs洗3次，每次5分钟；加dapi室温10分钟，1×pbs洗3次；封片观察。在96孔细胞培养板中，一组实验加入含葡萄糖终浓度分别为3mm和15mm的培养基，培养24小时后，去除培养基，每孔加入100微升pbs磷酸盐缓冲液，后加入nanoluc的底物furimazine，使其终浓度为1μm/l，加入后室温孵育10分钟后，直接在多功能酶标仪中检测荧光强度。每个浓度实验重复5次。另一组实验在转染6小时后，在培养基中直接加入dmso(对照)，和orlistat使其终浓度为15μm。加入orlistat后18小时，去除细胞培养液，每孔加入100微升pbs磷酸盐缓冲液，后加入nanoluc的底物furimazine，使其终浓度为1μm/l，加入后室温孵育10分钟后，直接在多功能酶标仪中检测荧光强度。每组实验重复5次。结果显示：通过在融合蛋白nanoluc-fapr△43表达质粒上添加不同的细胞器定位序列实现了融合蛋白在细胞质、细胞核、线粒体、内质网和高尔基体等亚细胞器的定位(如图9所示)。可见，定位后可以对亚细胞区域的malonyl-coa含量和动态变化进行检测。<110>中国科学院生物物理研究所<120>一种用于检测丙二酰辅酶a的分子探针<130>gncln181212<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>342<212>prt<213>artificialsequence<400>1metvalphethrleugluaspphevalglyasptrpgluglnthrala151015alatyrasnleuaspglnvalleugluglnglyglyvalserserleu202530leuglnasnleualavalservalthrproileglnargilevalarg354045serglygluasnalaleulysileaspilehisvalileileprotyr505560gluglyleuseralaaspglnmetalaglnileglugluvalphelys65707580valvaltyrprovalaspasphishisphelysvalileleuprotyr859095glythrleuvalileaspglyvalthrproasnmetleuasntyrphe100105110glyargprotyrgluglyilealavalpheaspglylyslysilethr115120125valthrglythrleutrpasnglyasnlysileileaspgluargleu130135140ilethrproaspglysermetleupheargvalthrileasnsergly145150155160serserglyglyglyglyserglyglyglyglyserserglygluleu165170175serileprogluleuarggluargilelysasnvalalaglulysthr180185190leugluaspgluvallysserleuserleuaspgluvalileglyglu195200205ileileaspleugluleuaspaspglnalaileserileleugluile210215220lysglngluhisvalpheserargasnglnilealaargglyhishis225230235240leuphealaglnalaasnserleualavalalavalileaspaspglu245250255leualaleuthralaseralaaspileargphethrargglnvallys260265270glnglygluargvalvalalalysalalysvalthralavalglulys275280285glulysglyargthrvalvalgluvalasnsertyrvalglygluglu290295300ilevalpheserglyargpheaspmettyrargserlyshissergly305310315320glyglyglyserglyglyglyglyserserglyvalthrglytyrarg325330335leupheglugluileleu340<210>2<211>1026<212>dna<213>artificialsequence<400>2atggtcttcacactcgaagatttcgttggggactgggaacagacagccgcctacaacctg60gaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgctgcagaatctcgccgtgtccgta120actccgatccaaaggattgtccggagcggtgaaaatgccctgaagatcgacatccatgtc180atcatcccgtatgaaggtctgagcgccgaccaaatggcccagatcgaagaggtgtttaag240gtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgccctatggcacactggta300atcgacggggttacgccgaacatgctgaactatttcggacggccgtatgaaggcatcgcc360gtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatc420gacgagcgcctgatcacccccgacggctccatgctgttccgagtaaccatcaacagtggg480agttccggtggtggcgggagcggaggtggaggctcgagcggtgagctgagcatccctgag540ctgcgggagagaatcaagaatgtggccgagaagaccctggaggacgaggtgaagagcctg600tccctggatgaagtgatcggcgagatcatcgacctggagctggacgatcaggccatcagc660atcctggagatcaagcaggagcacgtgttctccaggaaccagatcgcaaggggacaccac720ctgtttgcacaggccaattccctggcagtggccgtgatcgacgatgagctggccctgaca780gcctctgccgatatccggttcaccagacaggtgaagcagggcgagagggtggtggccaag840gccaaggtgacagccgtggagaaggagaagggccggaccgtggtggaggtgaactcctac900gtgggcgaggagatcgtgttctctggccggtttgacatgtatagatctaagcacagcggt960ggtggcgggagcggaggtggagggtcgtcaggtgtgaccggctaccggctgttcgaggag1020attctg1026当前第1页12