一种检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及水产病害微生物检测领域，具体涉及一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒，以及上述引物组的应用。

技术背景

我国是世界主要鳗鲡养殖国家之一，其产值在我国的水产品出口贸易中占有重要地位。养殖的品种主要有日本鳗鲡、欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡、花鳗鲡等。由于大规模的集约化养殖，重大病毒性疫病爆发日益频繁，造成巨额的经济损失。鳗鲡疾病的病原学研究方面，鳗鲡细菌性疾病、寄生虫疾病的研究较多，且已经有一套比较成熟的预防和治疗方法。而在鳗鲡病毒性疾病领域的研究较少，由于对病原不了解，使得一旦病毒性疾病爆发，常呈区域性传播，造成巨额的经济损失。

鳗鲡疱疹病毒(eelherpesvirus,ehv)在我国养殖的鳗鲡中普遍存在。临床和病理学研究表明，ehv可引起鱼粘液分泌增多，病鱼眼突和腹胀，肝脏褪色，肾脏肿大、胆囊膨大与显著的肠炎，明显增高的死亡率等。在无明显临床症状的鳗鲡中，也可检测到ehv。

目前开发的ehv的检测方法包括pcr、定量pcr等检测方法。这些检测技术具有特异性好等优点，但都需要pcr仪等专业的仪器设备和较专业的操作人员，很难在基层推广应用。环介导等温扩增技术(lamp)是在pcr基础上发展的核酸扩增技术，只需要一个恒温装置，具有检测快速、灵敏度高、操作简便、成本低、检测结果易于判定等优点，已广泛应用于病原检测领域。目前，未见利用lamp方法对ehv进行检测的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒以及上述引物组的应用。

本发明提供了一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的引物组，所述引物组包括两条外引物f3-ehv和b3-ehv、两条内引物fip-ehv和bip-ehv、两条环引物lf-ehv和lb-ehv；

各引物的碱基序列5’-3’如下：

f3-ehv：ggcatcgagatgatgcacaa(seqidno.1)；

b3-ehv：tccgcggaagagagacag(seqidno.2)；

fip-ehv：gaggaacctggtggcatcagacgacaacatgccgtggatcg(seqidno.3)；

bip-ehv：atcacttcaaaaccggccgcgacggtgtcgtagtacggata(seqidno.4)；

lf-ehv：gcgcggcaggcatatcta(seqidno.5)；

lb-ehv：tcgaaggcgctgtactacaa(seqidno.6)。

本发明还提供了上述引物组在制备检测鳗鲡疱疹病毒试剂盒中的应用。

本发明提供了一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组，以及反应缓冲液、dna聚合酶和阳性对照。

优选的，所述引物组含有30～50μmf3-ehv，30～50μmb3-ehv，3～7μmfip-ehv，3～7μmbip-ehv，15～25μmlf-ehv，15～25μmlb-ehv。

优选的，所述反应缓冲液含有30～50mmtris缓冲液、15～25mmkcl、7～25mmmgso4、15～25mm(nh4)2so4、体积百分比0.1～0.3％吐温20、1～2m甘氨酸三甲胺内盐、2.5～4mmeachdntps、0.5～1.5mmmncl2、40～60μm钙黄绿素。

优选的，所述的dna聚合酶为bst2.0warmstartdna聚合酶。

优选的，所述的阳性对照为含有鳗鲡疱疹病毒orf51基因的质粒。

有益效果：

本发明提供的引物组针对鳗鲡疱疹病毒，能特异性地识别靶序列的八个不同位点，并在反应中产生茎环结构，具有良好的扩增特异性。

本发明提供的检测试剂盒利用lamp技术检测ehv，具有检测特异性强，检测灵敏度高等特点，可检测最低10个拷贝的靶标dna。试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可实现现场的高通量快速检测；克服了传统的基于pcr的检测方法需要pcr仪等仪器设备，对检测人员的技术素质要求高、检测时间长等缺点。

本发明的检测试剂盒可在不开盖的条件下，通过肉眼观察判定是否有目标基因的扩增：在可见光下显示黄绿色可判定为阳性，显示为棕红色可判定为阴性；或者，在紫外光下显示绿色可判定为阳性，未显示绿色可判定为阴性。

利用本发明提供的试剂盒，可在鳗鲡脱粘败血病样本中100％检出鳗鲡疱疹病毒。

附图说明

图1为本发明实施例4利用琼脂糖凝胶电泳分析lamp扩增产物的电泳图，其中m为maker、1为细胞培养的ehv、2为病料中的ehv、3为阳性对照；

图2为本发明实施例5中lamp扩增后的显示结果，其中1为鲤疱疹病毒、2为ehv、3为鳗鲡虹彩病毒、4为ehv；

图3为本发明实施例6中lamp扩增后的显示结果，其中1～8分别代表10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷拷贝的阳性对照dna。

图4为本发明实施例7中lamp扩增后的显示结果，其中1和5为鳗鲡脱粘败血病病料1，2和6为鳗鲡脱粘败血病病料2，3和7为未患病鳗鲡dna，4和8为阳性对照dna；1～4为自然光下显色结果；5～8为紫外光下显色结果。

具体实施方式

本发明提供了一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的引物组，所述引物组包括两条外引物f3-ehv和b3-ehv、两条内引物fip-ehv和bip-ehv、两条环引物lf-ehv和lb-ehv；

各引物的碱基序列5’-3’如下：

f3-ehv：ggcatcgagatgatgcacaa；

b3-ehv：tccgcggaagagagacag；

fip-ehv：gaggaacctggtggcatcagacgacaacatgccgtggatcg；

bip-ehv：atcacttcaaaaccggccgcgacggtgtcgtagtacggata；

lf-ehv：gcgcggcaggcatatcta；

lb-ehv：tcgaaggcgctgtactacaa。

本发明通过细胞分离、鉴定，得到10株ehv；本发明通过克隆上述10株ehv的orf51开放阅读框序列，分析同源性，再根据在线软件primerexplorerv5(http://primerexplorer.jp/)在保守区设计了上述用于检测鳗鲡疱疹病毒的lamp引物组。本发明利用上述引物组对ehv的靶标序列进行lamp扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，进行扩增特异性验证，比较引物的扩增效率。结果证明：本发明提供的lamp检测引物组相较于从ehv的orf4、orf8、orf33、orf95、orf115等基因保守区设计的引物组，具有扩增效率高、特异性好的优点。

本发明还提供了上述引物组在制备检测鳗鲡疱疹病毒试剂盒中的应用。以上述引物组为唯一检测引物，配合本领域可接受的缓冲液、dna聚合酶以及阳性对照样本，制得用于检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒。

本发明提供了一种具体的用于检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组，以及反应缓冲液、dna聚合酶和阳性对照。

在本发明中，所述引物组含有f3-ehv，b3-ehv，fip-ehv，bip-ehv，lf-ehv和lb-ehv共6条引物；所述f3-ehv的浓度优选为30～50μm，更优选为40μm；所述b3-ehv的浓度优选为30～50μm，更优选为40μm；所述fip-ehv的浓度优选为3～7μm，更优选为5μm；所述bip-ehv的浓度优选为3～7μm，更优选为5μm；所述lf-ehv的浓度优选为15～25μm，更优选为20μm；所述lb-ehv的浓度优选为15～25μm，更优选为20μm。上述引物组能针对鳗鲡疱疹病毒，特异性地识别靶序列的八个不同位点，并在反应中产生茎环结构，具有良好的扩增特异性；上述各引物的浓度为25×工作浓度。

在本发明中，所述反应缓冲液优选含有tris缓冲液、kcl、mgso4、(nh4)2so4、吐温20、甘氨酸三甲胺内盐、eachdntps、mncl2和钙黄绿素。所述tris缓冲液的ph优选为8.5～9.0，更优选为8.8；所述tris缓冲液的浓度优选为30～50mm，更优选为40mm；所述kcl的浓度优选为15～25mm，更优选为20mm；所述mgso4的浓度优选为7～25mm，更优选为16mm；所述(nh4)2so4的浓度优选为15～25mm，更优选为20mm；所述吐温20的体积百分比浓度优选为0.1～0.3％，更优选为2％；所述甘氨酸三甲胺内盐的浓度优选为1～2m，更优选为1.6m；所述eachdntps的浓度优选为2.5～4mm，更优选为3.2mm；所述mncl2的浓度优选为0.5～1.5mm，更优选为1mm；所述钙黄绿素的浓度优选为40～60μm，更优选为50μm。上述反应缓冲液中各组分的浓度为2×工作浓度。

在本发明中，所述的dna聚合酶优选为6～10u/μl的bst2.0warmstartdna聚合酶；在本发明的实施例中，所述bst2.0warmstartdna聚合酶购买自neb(newenglandbiolabs)公司。本发明所述的阳性对照优选为含有鳗鲡疱疹病毒orf51基因的质粒；在本发明的实施例中，所述含有鳗鲡疱疹病毒orf51基因的质粒优选通过如下方法获得：设计引物，扩增ehv的开放阅读框orf51序列，克隆至载体pmd19-t，利用质粒提取试剂盒提取质粒，测序验证后，利用nanodrop测定dna含量，计算拷贝数，然后用双蒸水调整质粒的浓度至10⁸拷贝/μl。

本发明上述试剂盒在检测鳗鲡疱疹病毒时，包括如下步骤：

1)待检样品基因组dna的提取；

2)利用上述试剂盒和提取到的样品dna配制lamp检测体系；

3)ehv的lamp扩增；

4)结果判定。

在本发明中，步骤1)所述dna的提取具体利用基因组dna提取试剂盒或病毒基因组dna提取试剂盒提取待检样品中的基因组dna。

在本发明中，步骤2)所述lamp检测体系的配制具体为：取上述样品中提取的样品dna2μl作为pcr模板，在室温条件下配制lamp检测反应液体系：检测引物组1μl，反应缓冲液12.5μl，bstdna聚合酶1μl，补充双蒸水至25μl。

在本发明中，步骤3)所述扩增具体为：将配制的lamp检测反应液混匀后置于60-65℃恒温设备中扩增45分钟～60分钟，然后置于80℃下持续5分钟。

在本发明中，步骤4)所述结果判定的方法为：肉眼直接观察或者在紫外灯下观察，根据反应液颜色判定结果，判定标准为：在可见光下显示黄绿色可判定为阳性，显示为棕红色可判定为阴性；或者，在紫外光下显示绿色可判定为阳性，未显示绿色可判定为阴性。

下面结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围

实施例1:

一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，包括25×工作浓度的引物组(40μm的f3-ehv、40μm的b3-ehv、5μm的fip-ehv、5μm的bip-ehv、20μm的lf-ehv、20μm的lb-ehv)、2×工作浓度的反应缓冲液(40mm的tris缓冲液(ph8.8)、20mm的kcl、16mm的mgso4、20mm的(nh4)2so4、体积百分比为0.2％的吐温20、1.6m的甘氨酸三甲胺内盐、3.2mm的eachdntps、1mm的mncl2、50μm的钙黄绿素)、8u/μlbst2.0warmstartdna聚合酶和10⁸拷贝/μl含有鳗鲡疱疹病毒orf51基因的质粒。

实施例2

一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，包括30μm的f3-ehv、30μm的b3-ehv、3μm的fip-ehv、3μm的bip-ehv、15μm的lf-ehv、15μm的lb-ehv、30mm的tris缓冲液(ph8.5)、15mm的kcl、10mm的mgso4、15mm的(nh4)2so4、体积百分比为0.1％的吐温20、1m的甘氨酸三甲胺内盐、2.5mm的eachdntps、0.5mm的mncl2、40μm的钙黄绿素、8u/μlbst2.0warmstartdna聚合酶和10⁸拷贝/μl含有鳗鲡疱疹病毒orf51基因的质粒。

实施例3

一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒包括50μm的f3-ehv、50μm的b3-ehv、7μm的fip-ehv、7μm的bip-ehv、25μm的lf-ehv、25μm的lb-ehv、50mm的tris缓冲液(ph9.0)、25mm的kcl、20mm的mgso4、25mm的(nh4)2so4、体积百分比为0.3％的吐温20、2m的甘氨酸三甲胺内盐、4mm的eachdntps、1.5mm的mncl2、60μm的钙黄绿素、8u/μlbst2.0warmstartdna聚合酶和10⁸拷贝/μl含有鳗鲡疱疹病毒orf51基因的质粒。

实施例4

以实施例1所述试剂盒分别对待测dna样品1～3进行扩增，在本实施例中，待测dna样品1为细胞培养的ehv；待测dna样品2为病料中的ehv；待测dna样品3为阳性对照。

(1)配制25μllamp反应体系，其中待测dna样品2μl，25x检测引物组1μl，2xlamp反应缓冲液12.5μl，bstdna聚合酶1μl，补充双蒸水至25μl；

(2)将配制的lamp检测反应液混匀后置于63℃恒温设备中扩增60分钟，反应后置于80℃进行酶灭活处理，5分钟后终止反应；

(3)利用琼脂糖凝胶电泳分析上述lamp扩增产物，结果见图1。

图1表明，使用本发明提供的检测试剂盒对待测dna样品1～3进行扩增，扩增结果一致，稳定性好。

实施例5

以实施例1所述试剂盒分别对待测dna样品1～4进行扩增，在本实施例中，待测dna样品1为与ehv同源性较高的鲤疱疹病毒；待测dna样品2为ehv；待测dna样品3为鳗鲡患病样品中常见的鳗鲡虹彩病毒；待测dna样品4为ehv。

(1)配制25μllamp反应体系，其中待测dna样品2μl，25x检测引物组1μl，2xlamp反应缓冲液12.5μl，bstdna聚合酶1μl，补充双蒸水至25μl；

(2)将配制的lamp检测反应液混匀后置于63℃恒温设备中扩增60分钟，反应后置于80℃进行酶灭活处理，5分钟后终止反应；

(3)观察终止后的反应液颜色，结果见图2。

由于有效扩增反应的副产物可使钙黄绿素游离后发出荧光；在可见光下显示黄绿色可判定为阳性，显示为棕红色可判定为阴性。图2结果表明，本发明提供的引物组对ehv的扩增具有特异性。

实施例6

以实施例1所述试剂盒分别对待测dna样品1～8进行扩增，在本实施例中，待测dna样品1～8分别代表10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷拷贝的阳性对照dna。本实施例用实施例5的操作方法分别对各稀释梯度的阳性对照dna进行检测。结果见图3。

图3结果表明：本发明提供的检测试剂盒可特异性检出最低10个拷贝的ehv，灵敏性高。

实施例7

以实施例1所述试剂盒分别对待测dna样品1～4进行扩增，在本实施例中，待测dna样品1为鳗鲡脱粘败血病病料1；待测dna样品2为鳗鲡脱粘败血病病料2；待测dna样品3为未患病鳗鲡dna；待测dna样品4为阳性对照。本实施例用实施例5的操作方法分别对各样品进行检测。结果见图4。

图4结果表明：使用本发明提供的引物组或试剂盒，可有效针对鳗鲡脱粘败血病进行检测。

以上详细说明了本发明的实施方式，但这只是为了便于理解而举的实例，不应被视为是对本发明范围的限制。任何所属技术领域的技术人员均可根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，做出各种可能的等同改变或替换，但所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。

序列表

<110>福建省农业科学院生物技术研究所

<120>一种检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggcatcgagatgatgcacaa20

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<211>18

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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